一种生产土霉素的发酵工艺
阅读说明：本技术 一种生产土霉素的发酵工艺 (Fermentation process for producing oxytetracycline ) 是由 王波政 李蕊红 兰明 李贵红 于 2021-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明属于抗生素发酵技术领域,具体涉及一种生产土霉素的发酵工艺；提供了一种生产土霉素的发酵工艺,其进一步优化了发酵及其分离纯化的工艺,使得制得的产品品质有较大的提升,极大的降低了杂质的含量,提高了玉米原料的利用率,采用的技术方案为：将玉米分别粉碎,分离其中碳源和氮源及油脂,制备发酵培养基,然后酸化后,用磷酸盐缓冲液回调pH过滤,再进行脱色,脱色后的脱色液通过超声波间歇搅拌的工艺来结晶,最后清洗,干燥制得成品土霉素。(The invention belongs to the technical field of antibiotic fermentation, and particularly relates to a fermentation process for producing oxytetracycline; the fermentation process for producing the oxytetracycline is provided, and further optimizes the processes of fermentation, separation and purification, so that the quality of the prepared product is greatly improved, the content of impurities is greatly reduced, the utilization rate of corn raw materials is improved, and the adopted technical scheme is as follows: respectively crushing corns, separating a carbon source, a nitrogen source and grease, preparing a fermentation culture medium, acidifying, adjusting the pH back by using a phosphate buffer solution, filtering, decoloring, crystallizing the decolored solution after decoloring through an ultrasonic intermittent stirring process, and finally cleaning and drying to obtain the finished product oxytetracycline.)
技术领域
本发明属于抗生素发酵技术领域，具体涉及一种生产土霉素的发酵工艺。
背景技术
土霉素具有广谱抗病原微生物作用，为快速抑菌剂，高浓度时对某些细菌呈杀菌作用。其作用机制在于药物能特异性地与核糖体30S亚基的A位置结合，阻止氨基酰-tRNA在该位置上的联结，从而抑制肽链的增长和影响细菌或其他病原微生物的蛋白质合成。土霉素对金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、化脓性链球菌、淋球菌、脑膜炎球菌、大肠杆菌、产气杆菌、志贺菌属、耶尔森菌、单核细胞李斯特菌等有较强抗菌活性；此外，土霉素对立克次体、支原体、衣原体、放线菌等也有较强作用。
现有的土霉素发酵方法，在发酵及后续的分离纯化过程中，都是采用的较为成熟的技术方法，固然有工艺简单，成本低廉的好处，但也极大的限制了成品的品质，同时对发酵原料的利用不够充分。
发明内容
本发明克服了现有技术存在的不足，提供了一种生产土霉素的发酵工艺，其进一步优化了发酵及其分离纯化的工艺，使得制得的产品品质有较大的提升，极大的降低了杂质的含量，提高了玉米原料的利用率。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种生产土霉素的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1)土霉素发酵
玉米棒经过脱粒后，分别将玉米粒和玉米芯粉碎，玉米粒破碎后分离出胚芽，破碎的玉米粒制取玉米浆，分离出的胚芽制取玉米油并得到副产物玉米胚芽粕；玉米芯制得玉米芯降解液；原料准备完毕后，具体发酵工艺如下：
选用龟裂链霉菌作为发酵菌，经过孢子培养，三级种子发酵从而发酵制得发酵液；所述一级种子发酵条件为：控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间30-40h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉20-35份，玉米芯降解液20-35份，玉米胚芽粕5-15份，黄豆饼粉5-15份，玉米浆10-25份，碳酸钙1.5-4份，磷酸二氢钾1-3.5份，玉米油1-5份，复合氨基酸粉3-9份，植物油1-5份，硅基消泡剂1-5份，无菌水1000-1500份；
所述二级种子发酵条件为：
控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间30-40h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉30-40份，玉米芯降解液30-40份，玉米胚芽粕10-15份，黄豆饼粉10-20份，玉米浆15-30份，碳酸钙1.5-4份，磷酸二氢钾1-3.5份，玉米油1-5份，复合氨基酸粉3-9份，植物油1-5份，硅基消泡剂1-5份，无菌水600-1200份；
所述三级种子发酵条件为：控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间30-40h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉40-50份，玉米芯降解液40-50份，玉米胚芽粕15-25份，黄豆饼粉15-25份，玉米浆25-35份，碳酸钙1.5-4份，磷酸二氢钾1-3.5份，玉米油1-5份，复合氨基酸粉3-9份，植物油1-5份，硅基消泡剂1-5份，无菌水500-800份；
2)将土霉素发酵液注入酸化罐中，加入草酸酸化处理，调节pH值至1.6-1.9，将酸化处理后的土霉素发酵液经过稀释后，进行预过滤，和两次板框过滤分离出菌丝渣和土霉素原液；
3)向所述土霉素原液中添加pH值5-7的缓冲液，回调pH值至2-3.6，用超滤膜过滤；
4)将步骤2超滤后的土霉素液加入盐酸调节pH值至1.6-1.9，然后用脱色树脂脱色，得到脱色液；
5)将脱色后的土霉素脱色液进行过滤，去除残存的树脂，然后将脱色液加热至28-32℃，进行结晶；
6)向升温后的脱色液中加入氨水调节pH值至4.8-5.4，同时进行超声波间歇搅拌，结晶40-60min，完成结晶；
7)将结晶液用压滤机进行压滤，分离得到土霉素湿晶体，然后在压滤机中用纯水循环清洗土霉素湿晶体，控制纯水与土霉素湿晶体的重量比为5-10：1，清洗后进行干燥，得到土霉素成品。
所述步骤3中的缓冲液为磷酸盐缓冲液。
所述超滤膜为1-5万分子量的超滤膜。
所述脱色树脂的参数为体积交换容量3eq/L，含水量65-72％。
所述超声波频率为6.5-35kHz，强度为0.6-4W/cm2。
所述超声间歇搅拌为超声搅拌5-10min，间隔1-3min。
所述所述超声间歇搅拌控制超声频率逐渐升高，首次超声频率为6.5-10kHz，每次递增5-10kHz。
所述步骤7中清洗时间为15-25min。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果。
1、本发明充分利用了玉米做为种子培养基的原料，先将玉米粒与玉米芯进行分离，分离后的玉米粒将其玉米胚芽脱离出来，用于制备玉米油，制油产生了玉米胚芽粕，同时将一部分的玉米粒用于制备玉米浆，脱粒后的玉米芯一部分通过浸泡，蒸，糖化，制得玉米芯降解液，用来补充培养基中的碳源。
2、本发明采用向土霉素原液中加入磷酸缓冲液，回调pH值，同时使用超滤膜过滤的方法，来实现减少有机杂质，同时清除内毒素，使得在使用脱色树脂脱色时，能够提高树脂的使用寿命，和使用效率，并使得脱色液更加的稳定。
3、本发明所采用的超声波间歇搅拌的方法结晶，其中采用的间歇超声波搅拌为梯度增加强度，使得在前期能够起到加入晶种的目的，同时随着强度的增加，使得结晶的粒度更加均匀，配合后期的纯水清洗工艺，使得水溶性杂质较少，且更易于过滤和干燥。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
一种生产土霉素的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1)土霉素发酵
玉米棒经过脱粒后，分别将玉米粒和玉米芯粉碎，玉米粒破碎后分离出胚芽，破碎的玉米粒制取玉米浆，分离出的胚芽制取玉米油并得到副产物玉米胚芽粕；玉米芯制得玉米芯降解液；原料准备完毕后，具体发酵工艺如下：
选用龟裂链霉菌作为发酵菌，经过孢子培养，三级种子发酵从而发酵制得发酵液；所述一级种子发酵条件为：控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间40h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉35份，玉米芯降解液35份，玉米胚芽粕15份，黄豆饼粉15份，玉米浆25份，碳酸钙4份，磷酸二氢钾3.5份，玉米油5份，复合氨基酸粉9份，植物油5份，硅基消泡剂5份，无菌水1500份；
所述二级种子发酵条件为：
控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间40h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉40份，玉米芯降解液40份，玉米胚芽粕15份，黄豆饼粉20份，玉米浆30份，碳酸钙4份，磷酸二氢钾3.5份，玉米油5份，复合氨基酸粉9份，植物油5份，硅基消泡剂5份，无菌水1200份；
所述三级种子发酵条件为：控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间40h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉50份，玉米芯降解液50份，玉米胚芽粕25份，黄豆饼粉25份，玉米浆35份，碳酸钙4份，磷酸二氢钾3.5份，玉米油5份，复合氨基酸粉9份，植物油5份，硅基消泡剂5份，无菌水800份；
2)将土霉素发酵液注入酸化罐中，加入草酸酸化处理，调节pH值至1.6-1.9，将酸化处理后的土霉素发酵液经过稀释后，进行预过滤，和两次板框过滤分离出菌丝渣和土霉素原液；
3)向所述土霉素原液中添加pH值5-7的磷酸盐缓冲液，回调pH值至2-3.6，用1-5万分子量的超滤膜过滤；
4)将步骤2超滤后的土霉素液加入盐酸调节pH值至1.6-1.9，然后用体积交换容量为3eq/L，含水量65-72％的脱色树脂脱色，脱色树脂为得到脱色液；
5)将脱色后的土霉素脱色液进行过滤，去除残存的树脂，然后将脱色液加热至28-32℃，进行结晶；
6)向升温后的脱色液中加入氨水调节pH值至4.8-5.4，同时进行超声波间歇搅拌，先控制超声波频率为6.5kHz，强度为1W/cm2，超声波搅拌10min，间歇1min，然后提高超声波频率至15kHz，强度为2W/cm2，超声波搅拌10min，间歇2min，再提高超声波频率至25kHz，强度为3W/cm2，超声搅拌10min，间歇1min，然后静置结晶25min，完成结晶；
7)将结晶液用压滤机进行压滤，分离得到土霉素湿晶体，然后在压滤机中用纯水循环清洗土霉素湿晶体，控制纯水与土霉素湿晶体的重量比为10：1，清洗25min，清洗后进行干燥，得到土霉素成品。
实施例2
一种生产土霉素的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1)土霉素发酵
玉米棒经过脱粒后，分别将玉米粒和玉米芯粉碎，玉米粒破碎后分离出胚芽，破碎的玉米粒制取玉米浆，分离出的胚芽制取玉米油并得到副产物玉米胚芽粕；玉米芯制得玉米芯降解液；原料准备完毕后，具体发酵工艺如下：
选用龟裂链霉菌作为发酵菌，经过孢子培养，三级种子发酵从而发酵制得发酵液；所述一级种子发酵条件为：控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间30h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉20份，玉米芯降解液20份，玉米胚芽粕5份，黄豆饼粉5份，玉米浆10份，碳酸钙1.5份，磷酸二氢钾1份，玉米油1份，复合氨基酸粉3份，植物油1份，硅基消泡剂1份，无菌水1000份；
所述二级种子发酵条件为：
控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间30h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉30份，玉米芯降解液30份，玉米胚芽粕10份，黄豆饼粉10份，玉米浆15份，碳酸钙1.5份，磷酸二氢钾1份，玉米油1份，复合氨基酸粉3份，植物油1份，硅基消泡剂1份，无菌水600份；
所述三级种子发酵条件为：控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间30h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉40份，玉米芯降解液40份，玉米胚芽粕15份，黄豆饼粉15份，玉米浆25份，碳酸钙1.5份，磷酸二氢钾1份，玉米油1份，复合氨基酸粉3份，植物油1份，硅基消泡剂1份，无菌水500份；
2)将土霉素发酵液注入酸化罐中，加入草酸酸化处理，调节pH值至1.6-1.9，将酸化处理后的土霉素发酵液经过稀释后，进行预过滤，和两次板框过滤分离出菌丝渣和土霉素原液；
3)向所述土霉素原液中添加pH值5-7的磷酸盐缓冲液，回调pH值至2-3.6，用1-5万分子量的超滤膜过滤；
4)将步骤2超滤后的土霉素液加入盐酸调节pH值至1.6-1.9，然后用体积交换容量为3eq/L，含水量65-72％的脱色树脂脱色，脱色树脂为得到脱色液；
5)将脱色后的土霉素脱色液进行过滤，去除残存的树脂，然后将脱色液加热至28-32℃，进行结晶；
6)向升温后的脱色液中加入氨水调节pH值至4.8-5.4，同时进行超声波间歇搅拌，先控制超声波频率为20kHz，强度为1W/cm2，超声波搅拌5min，间歇5min，然后提高超声波频率至25kHz，强度为2W/cm2，超声波搅拌6min，间歇10min，再提高超声波频率至30kHz，强度为3W/cm2，超声搅拌10min，间歇1min，再控制频率至35kHz，强度为3W/cm2，超声搅拌5min，静置结晶5min，完成结晶；
7)将结晶液用压滤机进行压滤，分离得到土霉素湿晶体，然后在压滤机中用纯水循环清洗土霉素湿晶体，控制纯水与土霉素湿晶体的重量比为5：1，清洗15min，清洗后进行干燥，得到土霉素成品。
实施例3
一种生产土霉素的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1)土霉素发酵
玉米棒经过脱粒后，分别将玉米粒和玉米芯粉碎，玉米粒破碎后分离出胚芽，破碎的玉米粒制取玉米浆，分离出的胚芽制取玉米油并得到副产物玉米胚芽粕；玉米芯制得玉米芯降解液；原料准备完毕后，具体发酵工艺如下：
选用龟裂链霉菌作为发酵菌，经过孢子培养，三级种子发酵从而发酵制得发酵液；所述一级种子发酵条件为：控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间33h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉25份，玉米芯降解液22份，玉米胚芽粕7份，黄豆饼粉5份，玉米浆21份，碳酸钙2.5份，磷酸二氢钾1.9份，玉米油2份，复合氨基酸粉4份，植物油3.3份，硅基消泡剂1.5份，无菌水1450份；
所述二级种子发酵条件为：
控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间30-40h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉35份，玉米芯降解液35份，玉米胚芽粕12份，黄豆饼粉17份，玉米浆18份，碳酸钙3份，磷酸二氢钾2份，玉米油3份，复合氨基酸粉4.5份，植物油3.6份，硅基消泡剂3份，无菌水1150份；
所述三级种子发酵条件为：控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间30-40h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉48份，玉米芯降解液45份，玉米胚芽粕24份，黄豆饼粉20份，玉米浆32份，碳酸钙3份，磷酸二氢钾3份，玉米油3份，复合氨基酸粉7份，植物油2份，硅基消泡剂3份，无菌水750份；
2)将土霉素发酵液注入酸化罐中，加入草酸酸化处理，调节pH值至1.6-1.9，将酸化处理后的土霉素发酵液经过稀释后，进行预过滤，和两次板框过滤分离出菌丝渣和土霉素原液；
3)向所述土霉素原液中添加pH值5-7的磷酸盐缓冲液，回调pH值至2-3.6，用1-5万分子量的超滤膜过滤；
4)将步骤2超滤后的土霉素液加入盐酸调节pH值至1.6-1.9，然后用体积交换容量为3eq/L，含水量65-72％的脱色树脂脱色，脱色树脂为得到脱色液；
5)将脱色后的土霉素脱色液进行过滤，去除残存的树脂，然后将脱色液加热至28-32℃，进行结晶；
6)向升温后的脱色液中加入氨水调节pH值至4.8-5.4，同时进行超声波间歇搅拌，先控制超声波频率为15kHz，强度为1W/cm2，超声波搅拌10min，间歇5min，然后提高超声波频率至20kHz，强度为2W/cm2，超声波搅拌10min，间歇5min，再提高超声波频率至25kHz，强度为3W/cm2，超声搅拌10min，静置结晶5min，完成结晶；
7)将结晶液用压滤机进行压滤，分离得到土霉素湿晶体，然后在压滤机中用纯水循环清洗土霉素湿晶体，控制纯水与土霉素湿晶体的重量比为6：1，清洗20min，清洗后进行干燥，得到土霉素成品。
实施例4
一种生产土霉素的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1)土霉素发酵
玉米棒经过脱粒后，分别将玉米粒和玉米芯粉碎，玉米粒破碎后分离出胚芽，破碎的玉米粒制取玉米浆，分离出的胚芽制取玉米油并得到副产物玉米胚芽粕；玉米芯制得玉米芯降解液；原料准备完毕后，具体发酵工艺如下：
选用龟裂链霉菌作为发酵菌，经过孢子培养，三级种子发酵从而发酵制得发酵液；所述一级种子发酵条件为：控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间35h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉30份，玉米芯降解液33份，玉米胚芽粕11份，黄豆饼粉6份，玉米浆18份，碳酸钙2.5份，磷酸二氢钾2份，玉米油3份，复合氨基酸粉4份，植物油3份，硅基消泡剂1.5份，无菌水1300份；
所述二级种子发酵条件为：
控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间30-40h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉35份，玉米芯降解液35份，玉米胚芽粕12份，黄豆饼粉15份，玉米浆20份，碳酸钙3份，磷酸二氢钾2份，玉米油3份，复合氨基酸粉4.5份，植物油3.5份，硅基消泡剂2份，无菌水1000份；
所述三级种子发酵条件为：控制温度为26-34℃，压力为0.01-0.05MP，培养时间30-40h，培养基的按照重量份配比组成为：淀粉45份，玉米芯降解液45份，玉米胚芽粕25份，黄豆饼粉22份，玉米浆32份，碳酸钙2.5份，磷酸二氢钾3份，玉米油3份，复合氨基酸粉6份，植物油3份，硅基消泡剂3份，无菌水750份；
2)将土霉素发酵液注入酸化罐中，加入草酸酸化处理，调节pH值至1.6-1.9，将酸化处理后的土霉素发酵液经过稀释后，进行预过滤，和两次板框过滤分离出菌丝渣和土霉素原液；
3)向所述土霉素原液中添加pH值5-7的磷酸盐缓冲液，回调pH值至2-3.6，用1-5万分子量的超滤膜过滤；
4)将步骤2超滤后的土霉素液加入盐酸调节pH值至1.6-1.9，然后用体积交换容量为3eq/L，含水量65-72％的脱色树脂脱色，脱色树脂为得到脱色液；
5)将脱色后的土霉素脱色液进行过滤，去除残存的树脂，然后将脱色液加热至28-32℃，进行结晶；
6)向升温后的脱色液中加入氨水调节pH值至4.8-5.4，同时进行超声波间歇搅拌，先控制超声波频率为15kHz，强度为1W/cm2，超声波搅拌5min，间歇5min，然后提高超声波频率至20kHz，强度为2W/cm2，超声波搅拌5min，间歇5min，再提高超声波频率至25kHz，强度为3W/cm2，超声搅拌5min，间歇5min，再控制频率至30kHz，强度为4W/cm2，超声搅拌5min，静置结晶5min，完成结晶；
7)将结晶液用压滤机进行压滤，分离得到土霉素湿晶体，然后在压滤机中用纯水循环清洗土霉素湿晶体，控制纯水与土霉素湿晶体的重量比为8：1，清洗22min，清洗后进行干燥，得到土霉素成品。
上述实施方式仅示例性说明本发明的原理及其效果，而非用于限制本发明。对于熟悉此技术的人皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改进。因此，凡举所述技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
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