阅读说明：本技术 入组生酮饮食临床研究患者的首选分子分型的构建方法 (Construction method of first-choice molecular typing of group ketogenic diet clinical research patients ) 是由 周福祥 唐蒙 孙雪花 匡浩 张万芳 于 2020-07-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种入组生酮饮食临床研究患者的首选分子分型的构建方法及首选分子分型方法。该构建方法包括如下步骤：1)对临床大样本结肠癌转录组数据以及结肠非肿瘤组织基因mRNA的表达信息进行分析；2)筛选出糖代谢和酮体代谢重编程相关的靶点分子；3)获得所述多例结肠癌组织的基因mRNA表达信息；4)通过R语言分析靶点分子表达与预后之间的关系；5)将结肠癌患者癌组织分子分型分为三类：预后最差型、中间型及预后最好型；6)选取预后最差的糖酵解型-酮体代谢缺陷型作为入组生酮饮食临床研究患者的首选分子分型。本发明可筛选出其中预后最差型患者,其肿瘤组织对酮体代谢利用较弱,可作为入组生酮饮食临床研究的首选分子分型。(The invention provides a construction method for first-choice molecular typing of a patient in a clinical study of a ketogenic diet and a first-choice molecular typing method. The construction method comprises the following steps: 1) analyzing the colon cancer transcriptome data of a large clinical sample and the expression information of the colon non-tumor tissue gene mRNA; 2) screening out target molecules related to reprogramming of sugar metabolism and ketone body metabolism; 3) obtaining gene mRNA expression information of the plurality of colon cancer tissues; 4) analyzing the relation between target molecule expression and prognosis through R language; 5) cancer tissue molecules of colon cancer patients are classified into three types: worst, intermediate and best prognosis; 6) the glycolytic-ketone body metabolism defect with the worst prognosis is selected as the first molecular typing of the grouping ketogenic diet clinical research patient. The invention can screen the patients with worst prognosis, the tumor tissues of which have weak utilization on ketone body metabolism, and can be used as the first choice molecular typing for clinical research of group ketogenic diet.)

入组生酮饮食临床研究患者的首选分子分型的构建方法

技术领域

本发明涉及疾病分子分型检测，特别涉及一种入组生酮饮食临床研究患者的首选分子分型的构建方法及首选分子分型方法。

背景技术

能量代谢异常是肿瘤细胞的十大特征之一，其主要表现为“Warburg效应”，肿瘤细胞以葡萄糖糖酵解为主要的能量获取方式，即使在有氧条件下亦大量摄取葡萄糖并产生乳酸，促进细胞增殖。许多研究认为改变肿瘤的能量代谢方式可以有效的控制其生长。生酮饮食(ketogenic diet，KD)作为一种高脂肪、低碳水化合物、适量蛋白质和其他营养素构成的配方饮食，其安全性和有效性已得到公认。长期的生酮饮食可以模拟人体饥饿状态，通过肝脏氧化分解脂肪酸产生中间代谢产物酮体：乙酰乙酸、β-羟丁酸、丙酮，用于外周组织供能。由于细胞内酮体的代谢依赖于完整的线粒体内膜和酮体分解酶，正常细胞较易适应将酮体作为高效能代谢物，而大多数肿瘤细胞不具有这样的适应性，其任一酮体代谢酶表达低下，即可导致对酮体利用率显著降低。基于肿瘤生酮疗法(Ketogenic diet，KD)敏感性依赖于酮体代谢酶的低表达，急需研究一种肿瘤代谢相关分子分型方法，探讨不同肿瘤细胞的代谢异质性，可以对生酮疗法效果做出预判。

发明内容

本发明为解决上述技术问题提供一种入组生酮饮食临床研究患者的首选分子分型的构建方法及首选分子分型方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

入组生酮饮食临床研究患者的首选分子分型的构建方法，包括如下步骤：

1)对临床大样本结肠癌转录组数据以及结肠非肿瘤组织基因mRNA的表达信息进行分析；

2)比较结肠癌组织与结肠非肿瘤组织在糖酵解、氧化磷酸化、酮体代谢相关分子转录水平的差异性，筛选出糖代谢和酮体代谢重编程相关的靶点分子，所述靶点分子包括GLUT1、PFKFB3、OXCT1及ACAT1；

3)利用GEO数据库获取多例结肠癌患者的临床信息，获得所述多例结肠癌组织的基因mRNA表达信息；

4)通过R语言分析靶点分子表达与预后之间的关系，确定GLUT1和/或PFKFB3高表达为糖酵解型，预后较差；确定GLUT1和PFKFB3低表达为非糖酵解型；确定OXCT1和/或ACAT1低表达为酮体代谢缺陷型，预后较差；并确定OXCT1和ACAT1高表达为酮体代谢型；

5)进一步将糖酵解和酮体代谢相关基因进行组合，通过生存分析将结肠癌患者癌组织分子分型分为三类：预后最差的为糖酵解型-酮体代谢缺陷型；中间型为非糖酵解型-酮体代谢缺陷型和糖酵解型-酮体代谢型；预后最好的为非糖酵解型-酮体代谢型；

6)选取预后最差的糖酵解型-酮体代谢缺陷型作为入组生酮饮食临床研究患者的首选分型。

优选地，所述步骤3)的临床信息包括年龄，性别，TNM分期，总生存期及无复发生存期。

优选地，所述步骤1)中的转录组基因表达数据选自GEPIA生物信息学网站的TCGA数据库。

入组生酮饮食临床研究患者的首选分子分型方法，包括如下步骤：

1)将患者手术切除的肿瘤病理组织制作成组织切片或芯片，进行Opal多色荧光检测；

2)对荧光检测图像进行分析，将每一个阳性细胞用一个彩色点标记；

3)利用显微镜观测阳性细胞所占细胞中的百分率为X％，大于界定值判定为高表达，低于或等于界定值为低表达；

4)当组织芯片中的GLUT1和/或PFKFB3高表达且OXCT1和/或ACAT1低表达时，作为入组生酮饮食临床研究患者的首选分型。

优选地，当ACAT1>5％、OXCT1>10％、PGC1a>7％、PFKFB3>30％、GLUT1>0.5％为高表达，低于或等于界定值为低表达。

优选地，所述步骤1)中Opal多色荧光检测所使用的抗体为ACAT1、OXCT1、PFKFB3及GLUT1。

优选地，步骤3)中根据免疫组化标记CK及指标分子双阳性标记占组织总细胞比例进行判定，大于界定值判定为高表达，低于或等于界定值为低表达。

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：通过对临床大样本结肠癌转录组数据进行筛选分析，筛选出与癌旁具有表达差异的糖代谢和酮体代谢重编程相关的靶点分子，随后使用差异分子进行联合分型，基于生物信息学分析及180点组织芯片表达水平验证该代谢分子分型与预后的关系，可筛选出其中预后最差的代谢分型糖酵解型-酮体代谢缺陷型Glycolysis+/Ketolysis-患者，其肿瘤组织对酮体代谢利用较弱，可作为入组生酮饮食临床研究的首选分型。

附图说明

图1为酮体代谢调控分子OXCT1与结肠癌预后的关系图。

图2为酮体代谢调控分子ACAT1与结肠癌预后的关系图。

图3为糖酵解调控分子GLUT1与结肠癌预后的关系图。

图4为糖酵解调控分子PFKFB3与结肠癌预后的关系图。

图5为酮体代谢分子联合分型与结肠癌患者预后的关系。Kaplan-Meier生存分析及Log Rank(Mantel-Cox法)统计分析结果如下，OXCT1&ACAT1：Chi Square＝8.871，p＝0.031。

图6为糖酵解代谢分子联合分型与结肠癌患者预后的关系。Kaplan-Meier生存分析及Log Rank(Mantel-Cox法)统计分析结果如下，GLUT1&PFKFB3:Chi Square＝8.562，p＝0.014。

图7为糖酵解及酮体代谢分子联合分型与结肠癌患者预后的关系。Kaplan-Meier生存分析及Log Rank(Mantel-Cox法)统计分析结果如下糖酵解&酮体代谢:Chi Square＝21.88，p<0.001。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面通过实施例详述本发明。

本发明实施例提供一种入组生酮饮食临床研究患者的首选分子分型的构建方法，包括如下步骤：

1)对临床大样本结肠癌转录组数据以及结肠非肿瘤组织基因mRNA的表达信息进行分析；

在此步骤中，是通过GEPIA生物信息学网站在线分析TCGA(the Cancer GenomeAtlas)数据库中选取的275例结肠癌患者的转录组数据，41例结肠非肿瘤组织基因mRNA表达信息。

2)比较结肠癌组织与结肠非肿瘤组织在糖酵解、氧化磷酸化、酮体代谢相关分子转录水平的差异性，筛选出糖代谢和酮体代谢重编程相关的靶点分子，所述靶点分子包括GLUT1、PFKFB3、OXCT1及ACAT1；

此步骤中，比较结肠癌组织与结肠非肿瘤组织在糖酵解、氧化磷酸化、酮体代谢相关分子转录水平有无差异。与正常结肠组织相比，结肠癌组织中糖酵解相关分子GLUT1，PFKFB3，HK2，PKM2高表达，而酮体分解酶BDH1，OXCT1，ACAT1及氧化磷酸化分子PGC1a的表达均降低。且OXCT1及ACAT1表达水平肿瘤患者不同个体中跨度很大，提示患者间存在酮体代谢能力的显著差异。由此我们筛选出与癌旁具有表达差异的糖代谢和酮体代谢重编程相关的靶点分子。这些分子包括GLUT1、PFKFB3、OXCT1、ACAT1。

3)利用GEO数据库获取多例结肠癌患者的临床信息，获得所述多例结肠癌组织的基因mRNA表达信息；

此步骤中，从GEO(Gene Expression Omnibus)数据库GPL570平台获取包括3个数据集GSE17536(172例)，GSE17537(55例)，GSE39582(555例)共计782例结肠癌患者的信息。该数据还包含相应的临床资料，包括年龄，性别，TNM分期，总生存期，无复发生存期。使用R语言对数据进行归一化处理，获得共782例结肠癌组织的基因mRNA表达信息。

4)通过R语言分析靶点分子表达与预后之间的关系，确定GLUT1和/或PFKFB3高表达归为糖酵解型，预后较差；确定GLUT1和PFKFB3同时低表达为非糖酵解型；确定OXCT1和/或ACAT1低表达为酮体代谢缺陷型，预后较差；并确定OXCT1和ACAT1同时高表达为酮体代谢型；

此步骤中，通过R语言分析上述代谢分子表达与预后的关系。结果发现酮体代谢酶OXCT1和ACAT1的表达与预后呈正相关，如图1和图2，糖酵解相关分子中仅GLUT1,PFKFB3与预后呈显著负相关如图3和图4。进一步通过多因素分析显示，OXCT1，ACAT1及PGC1αmRNA的高表达对于结肠癌患者的预后均为保护性因素，而糖酵解途径中以GLUT1和PFKFB3为代表的分子mRNA高表达水平为预后相关的危险因素。随后我们将功能相同的基因进行进一步组合分析，首先我们使用X-tile软件计算出OXCT1、ACAT1、GLUT1、PFKFB3四个分子在807例结肠癌组织中mRNA表达的最佳cutoff值，然后将其分成高低表达组，然后将分子进行联合分型，显示OXCT1，ACAT1任一低表达(OXCT1^low or ACAT1^high、OXCT1^high or ACAT1^low)，与同时低表达(OXCT1^low and ACAT1^low)时预后无明显差异，根据其生物学功能，将此三类患者归为“酮体代谢缺陷型”(Ketolysis-type)，相对两个基因同时高表达：OXCT1^high/ACAT1^high代表的“酮体代谢型”(Ketolysis+type)，前者预后趋势更差，如图5。提示在预后较差的结肠癌患者中，癌组织的酮体代谢多为“酮体代谢缺陷型”亚型。同法将GLUT1和PFKFB3进行联合分析显示，同时高表达(GLUT1^high and PFKFB3^high)及任一高表达(GLUT1^high or PFKFB3^low、GLUT1^low or PFKFB3^high)的患者间预后无显著差异，根据分子代谢特点，将此三类患者归为“糖酵解型”(Glycolysis type)，相对两个基因同时低表达(GLUT1^low and PFKFB3^low)的“非糖酵解型”(Glycolysis-type)，前者预后显著较差，如图6。提示在预后较差的结肠癌患者中，癌组织多为“糖酵解型”亚型。

5)通过生存分析进一步将糖酵解和酮体代谢相关基因进行组合，通过生存分析将结肠癌患者癌组织分子分型分为三类：预后最差的为糖酵解型-酮体代谢缺陷型(Glycolysis+/Ketolysis-：GLUT1^high or PFKFB3^high、OXCT1^low or ACAT1^low)；中间型为非糖酵解型-酮体代谢缺陷型(Glycolysis-/Ketolysis-：GLUT1^low and PFKFB3^low、OXCT1^low orACAT1^low)和糖酵解型-酮体代谢型(Glycolysis+/Ketolysis+：GLUT1^high or PFKFB3^high、OXCT1^high and ACAT1^high)；预后最好的为非糖酵解型-酮体代谢型(Glycolysis-/Ketolysis+：GLUT1^low and PFKFB3^low，OXCT1^high and ACAT1^high)，如图7。

6)选取预后最差的糖酵解型-酮体代谢缺陷型作为入组生酮饮食临床研究患者的首选分子分型。

最后，在购自上海芯超生物工程有限公司的结肠癌180点组织芯片(HColA180Su11)中进行验证。该组织芯片手术时间为2009.11-2010.5，从术后出院1个月后开始随访，末次随访时间至2016.6。包含的临床资料有年龄，性别，TNM分期，病理类型，肿瘤部位，总生存期(90例)，P53，MSH2，MSH6，MLH1，Ki67免疫组化检测。该芯片中，除去脱片的8点，共90例癌组织样本，其中82例具有癌旁对照，基于前期代谢靶点分子在结肠癌组织中mRNA表达情况构建的代谢相关的分子亚型，在组织芯片中使用Opal多色荧光检测进行组织水平的验证。发现结肠癌患者癌组织代谢分子分型分为预后显著不同的3类：糖酵解型-酮体代谢缺陷型(Glycolysisi+/Ketolysis-:GLUT1high or PFKPB3high、OXCT1low orACAT1low)预后最差，中位生存期(mOS)为22个月；中间型为非糖酵解型-酮体代谢缺陷型(Glycolysisi-/Ketolysis-：GLUT1low and PFKPB3low、OXCT1low or ACAT1low)，mOS为30个月；糖酵解型-酮体代谢型(Glycolysisi+/Ketolysis+：GLUT1high or PFKPB3high、OXCT1high and ACAT1high)，mOS为47.5个月；而非糖酵解型-酮体代谢型(Glycolysisi-/Ketolysis+：GLUT1low and PFKPB3low、OXCT1high and ACAT1high)预后最好，至观察截点死亡患者不足50％，mOS有待进一步延长随访时间。该结论与前期mRNA水平得出的结论相符合。

本实施例还提供一种入组生酮饮食临床研究患者的首选分子分型方法，包括如下步骤：

一、临床肿瘤患者，进行手术切除原发灶后，将肿瘤组织制作成组织芯片，进行组织芯片的Opal多色荧光检测；其具体步骤为：

a)脱蜡：在烘箱中(60-65℃)加热切片至少一小时，固定到位以便融化的石蜡蒸发。使用二甲苯清洗切片10分钟，重复三次。通过乙醇梯度进行水合反应，最后使用蒸馏水清洗。

b)切片固定：在NBF中固定组织20分钟，随后用蒸馏水清洗。

c)抗原修复：配置AR6或AR9工作液，高火煮沸，放入玻片，低火15-20分钟，修复后让切片在试验台上冷却至室温(至少15分钟)。

d)封闭：使用清水冲洗切片，然后用TBST处理。使用组画笔圈出待染色的组织区域。在室温下，使用抗体稀释/封闭溶液赋予组织10分钟。

e)一抗孵育：去除封闭液，然后对组织应用一抗溶液。必须针对Opal检测优化抗体浓度和孵育时间。

f)二抗孵育：对组织应用二抗溶液。Opal聚合物HRP应在室温下孵育10分钟。使用TBST清洗切片三次，每次两分钟。

g)Opal荧光团孵育：对组织应用Opal荧光团溶液，然后在室温下赋予10分钟。使用TBST清洗切片三次，每次两分钟。

h)抗体去除：AR buffer进行MWT并使切片在试验台上冷却至少15分钟。

i)光谱DAPI染色：使用蒸馏水冲洗切片，然后用TBST清洗。在DAPI溶液中至室温下孵育切片5分钟。

j)封片：玻片滴加抗荧光猝灭封片剂封片。

二、对荧光检测图像进行分析；具体步骤为：

a)准备图像：用Inform软件对芯片进行扫描及分析，先进行信号抽提及光谱拆分，去除自发荧光，调节荧光强度及伪彩。

b)组织分割：可以分割肿瘤区域和间质区域，以便对肿瘤、间质区域分别做分析。

c)细胞分割：细胞分割，对细胞的识别基于细胞核，胞浆识别：距离细胞核的距离。

d)细胞分型：细胞表型识别，将每一个阳性细胞用一个彩色点标记。荧光设置如下：Opal 520-GLUT1-red；Opal 540-PGC-1a-yellow；Opal 570-OXCT1-cyan；Opal 620-CK-magenta；Opal 650-PFKFB3-orange；Opal 690-ACAT1-green。

e)定量分析：对肿瘤区域，间质区域单独分析，可分析单阳性率、双阳性率、阳性强度评分。

三、利用显微镜观测阳性细胞所占细胞中的百分率为X％，大于界定值判定为高表达，低于或等于界定值为低表达；具体步骤为：

为了避免观察者视野间的误差，可请一位资深病理老师对免疫组化实验结果进行判读。

判读项目及标准分别为：

a)定位的判定：胞浆、胞膜、胞核

b)定性的判定：阴性、阳性

c)定量的判定：

1、染色强度判定：在低倍镜下对组织点整个视野进行观察，将其分为弱阳性、中阳性及强阳性。弱阳性为浅黄色(+或1)、中阳性为棕黄色(++或2)、强阳性为棕褐色(+++或3)。(备注：如果组织中既有中阳性又有强阳性时一般记为2-3，类似结果如上)

2、染色阳性率判定：首先在低倍镜下把组织点进行整个视野的观察后，然后选取3个染色强度不同的视野在高倍镜下进行判读，如果是目标分子定位于胞核时，我们是在每个视野中随机记100个细胞，然后记100个细胞中阳性细胞占的百分率X1％，同样原理看另外2个视野的阳性细胞占的百分率后X2％、X3％，最终该组织点染色阳性率取X1％、X2％及X3％的平均数；如果定位于胞浆或胞膜的话，我们同样选取3个不同的染色强度视野，分别进行估算其阳性率后取其平均值。

3、结果的判定：根据CK(细胞角蛋白，上皮来源标记，判断和鉴别肿瘤是否为上皮源性)及指标分子双阳性标记占组织总细胞比例进行判定，大于界值判定为高表达：ACAT1>5％为高表达，低于或等于5％为低表达，同理进行判定其余靶分子的表达，其中OXCT1>10％，PGC1a>7％，PFKFB3>30％，GLUT1>0.5％为高表达，低于或等于界定值为低表达(界定值的确定仅限于按照我们推荐的抗体和实验条件，其抗体稀释比例如下表1)。

表1靶标分子免疫组化操作流程表

四、当组织芯片中的GLUT1和/或PFKFB3高表达且OXCT1和/或ACAT1低表达时，作为入组生酮饮食临床研究患者的首选分子分型。

具体应用实例：刘某为57岁中年女性，诊断为结肠低分化粘液腺癌，行结直肠癌根治术，术后病理分期为T3N2bM0，IIIc期。

我们按照上述方案检测术后结肠癌肿瘤样本，检测4个蛋白分子(GLUT1、PFKFB3、ACAT1、OXCT1)在组织样本中的表达，经过病理医生阅片，该患者GLUT1高表达、PFKFB3高表达，OXCT1高表达，ACAT1低表达，属于预后最差的糖酵解型-酮体代谢缺陷型Glycolysis+/Ketolysis-患者，其肿瘤组织对酮体代谢利用较弱，可作为入组生酮饮食临床研究的首选分型。