阅读说明：本技术 一种含海茴香愈伤组织培养物滤液的修护蓝光损伤组合物及应用 (Repair blue light injury composition containing hypecoum vulgare callus culture filtrate and application ) 是由 吕平平 李传茂 张伟杰 张楚标 于 2020-05-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于化妆品领域,具体涉及一种含海茴香愈伤组织培养物滤液的修护蓝光损伤组合物及应用。本发明的组合物包括海茴香愈伤组织培养物滤液、乳酸杆菌/北美圣草发酵产物提取物、杉叶蕨藻提取物、紫苑提取物、表棓儿茶酚棓酸葡糖苷,几种组分协同增效,能最大程度减少蓝光照射下产生的自由基、修护蓝光引起的损伤；同时也能解决由蓝光辐射引起的皮肤老化的问题。(The invention belongs to the field of cosmetics, and particularly relates to a blue light injury repairing composition containing hypecoum vulgare callus culture filtrate and application thereof. The composition comprises hypsizygus marmoreus callus culture filtrate, lactobacillus/eriodictyon fermentation product extract, codium meridionatum extract, aster extract and epigallocatechin gallate glucoside, and the components are synergistic, so that free radicals generated under blue light irradiation can be reduced to the maximum extent, and damage caused by blue light can be repaired; and simultaneously, the problem of skin aging caused by blue light radiation can be solved.)

一种含海茴香愈伤组织培养物滤液的修护蓝光损伤组合物及 应用

技术领域

本发明属于化妆品领域，具体涉及一种含海茴香愈伤组织培养物滤液的修护蓝光损伤组合物及应用。

背景技术

蓝光是波长为400-500nm的可见光，是波长最短的可见光，也被称为高能量可见光(High Energy Visible Light，HEVL)，蓝光具有很强的穿透力，可穿透肌肤的表皮层和真皮层。蓝光主要来源于自然光、LED灯以及手机、电脑等电子设备。有研究表明蓝光与睡眠紊乱有关，也会导致眼睛疲劳，甚至会引起视力障碍，2005年，Bernard首次报道了蓝光对皮肤的损伤、产生自由基，从而引起皮肤老化。

由蓝光引起的损伤、自由基清除能力弱化和皮肤老化还没有适合的护肤品。然而，随着现在人们生活习惯的改变，人们每天有越来越多的时间暴露在电子产品前，不可避免地受到蓝光的大量照射，皮肤因蓝光而造成的损伤也越来越受到人们的重视。

发明内容

一方面，一发明提供了一种组合物，包括：海茴香愈伤组织培养物滤液(CrithmumMaritimum callus culture filtrate)、乳酸杆菌/北美圣草(EriodictyonCalifornicum)发酵产物提取物、杉叶蕨藻(Caulerpa Taxifolia)提取物、紫苑(AsterTataricus)提取物、表棓儿茶酚棓酸葡糖苷(epigallocatechin gallatyl glucoside)。

海茴香是一种生长在海岸边的伞形科芳香植物，海茴香精油在所有浓度下的抗氧活性均高于α-生育酚和BHT，能抑制亚油酸的过氧化作用。同时能抑制酪氨酸酶的活性，具有美白的功效。

植物干细胞是未分化的细胞，干细胞的活性成分具有完整的生物学功能，每个未分化的细胞含有植物的所有组分，是新细胞生长或替代特殊组织的来源。研究表明，植物干细胞对提高皮肤的新陈代谢，改善微循环，收紧和恢复皮肤弹性具有重要的应用价值。海茴香愈伤组织培养物滤液来自其根部萃取的植物干细胞，是海茴香愈伤组织培养物，干细胞中含有酚酸、绿原酸和类黄酮等使其能够抵御高燕、高紫外线的极端环境，可加快表皮的新陈代谢，有效改善皮肤的自愈能力，快速修复受损部位，促进细胞组织的再生。

在一些实施方案中，所述的组合物，包括以下重量份的各物质：

在一些实施方案中，所述的组合物，包括以下重量份的各物质：

在一些实施方案中，所述海茴香愈伤组织培养物滤液通过以下步骤得到：

1)将海茴香根切片后置于基本培养基中，并添加蔗糖、琼脂和二氯苯氧乙酸进行培养，得到愈伤组织；

2)将步骤1)制得的愈伤组织置于基本培养基中，并添加蔗糖、二氯苯氧乙酸和激动素进行培养，得到悬浮细胞。

在一些实施方案中，所述步骤1)中，在基本培养基中，蔗糖的加入质量分数为1.5～4.5％，琼脂的加入量为7～8.5g/L，二氯苯氧乙酸的加入量为0.5～1.5mg/L；优选地，步骤1)培养20-30天；进一步优选为培养25天。

在一些实施方案中，所述步骤2)中，在基本培养基中，蔗糖的加入质量分数为1.5～4.5％，二氯苯氧乙酸的加入量为0.2～1.2mg/L，激动素的加入量为0.01～0.5mg/L；优选地，步骤2)培养20-30天；进一步优选为培养25天。

在一些实施方案中，所述海茴香愈伤组织培养物滤液的制备还包括对制得的悬浮细胞进行过滤，收集滤液的步骤。

本申请还提供了所述的组合物在制备具有修护蓝光损伤功效的护肤品中的应用；优选地，所述护肤品包括眼霜、面霜、精华液、爽肤水中的一种或多种。

一方面，本申请还提供了一种化妆品，包括所述的组合物。

在一些实施方案中，所述组合物的加入量为3-20％，优选6-16％。

一方面，本申请还提供了一种所述的面霜，包含以重量百分比计的以下成分：

优选地，所述组合物的加入量为6-16％；进一步优选为10％。

一方面，本申请还提供了一种制备所述的含有修护蓝光损伤组合物的面霜的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将A相投入到水相锅中，搅拌均匀，加热搅拌至80～85℃，保温8-20min；

(2)将B相投入到油相锅，加热搅拌至80～85℃，搅拌；

(3)将水相锅中的物料抽入乳化锅中。将油相锅中的物料抽入乳化锅中，搅拌，然后将乳化锅内抽真空，均质搅拌10-25min；

(4)降温至40-45℃，加入C相，搅拌。

附图说明

图1为修护蓝光损伤测试中各组别的细胞活性；

图2为DPPH自由基清除实验测试中实施例1-4和对比例1-16的面霜对DPPH的清除率；

图3为皮肤弹性测试中实施例1-4和对比例1-16的面霜对皮肤的弹性变化值。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本申请的技术方案，具体实施例不代表对本申请保护范围的限制。其他人根据本申请理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本申请的保护范围。

“包含”或“包括”旨在表示组合物(例如介质)和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的本申请的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由……组成”是指排除其他组成部分的微量元素和实质性的方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本申请的范围内。

实施例0海茴香愈伤组织培养物滤液的制备

(1)外植体的选取和消毒处理：取切除根冠的海茴香根尖作为外植体，清洗干净后进行消毒；

(2)外植体切片：将步骤(1)中得到的海茴香根尖在无菌条件下切成1mm的薄片；

(3)愈伤组织培养：将步骤(2)中的切片放入基本培养基，再加入3％蔗糖、8g/L琼脂和1mg/L二氯苯氧乙酸(2,4-D)在25℃的温度下进行培养25天；

其中，基本培养基为MS培养基，购自Sigma，将购买的MS培养基取4.3g加热溶解于1000mL蒸馏水中，即得所述的基本培养基。

(4)细胞悬浮培养：将步骤(3)中的愈伤组织加入到基本培养基中，再加入3％蔗糖、0.5mg/L二氯苯氧乙酸(2,4-D)和0.1mg/L激动素KT，摇床以90rpm/min的转速振荡培养25天，得悬浮细胞；

(5)将步骤(4)中的悬浮细胞过滤后，收集滤液即得海茴香愈伤组织培养物滤液。

实施例1-4

按表1的重量份数制备实施例1-4的修护蓝光损伤组合物共100g。

表1

对比例1-16

按表2的重量份数制备对比例1-16的修护蓝光损伤组合物共100g。

表2

应用实施例1-4、应用对比例1-16

根据下表3中各组分的重量百分比，制备得到应用实施例1-4、应用对比例1-16的面霜。其中，所述修护蓝光损伤组合物为实施例1-4、对比例1-16制备得到的修护蓝光损伤组合物。

表3

上述面霜的制备步骤如下：

1)将A相投入到水相锅中，搅拌均匀，加热搅拌至80～85℃，保温10min；

2)将B相投入到油相锅，加热搅拌至80～85℃，搅拌均匀；

3)将水相锅中的物料抽入乳化锅中。将油相锅中的物料抽入乳化锅中，搅拌均匀，然后将乳化锅内抽真空，均质搅拌15min；

4)然后开冷却水降温至40-45℃，加入C相，搅拌均匀，检验合格后出料，制备完成。

性能测试

测试1修护蓝光损伤测试

本测试为了测试修护蓝光损伤霜修护蓝光损伤的效果，通过细胞活性来判断，细胞活性越大，蓝光损伤程度越小。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为甲瓒，死细胞无此功能，二甲基亚砜可溶解细胞中甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其吸光度(OD)值，在一定细胞数范围内，活细胞数越多，OD值越大，细胞活性越强。

在二氧化碳培养箱中，37℃，5％CO₂条件下，将成纤维细胞(HFF-1)培养在直径为10cm的培养皿中，培养液含10％的胎牛血清，当细胞汇合度达到80-90％时，将成纤维细胞接种在96孔细胞培养板，(细胞密度为1×10⁴)，即可进行测试。

将应用实施例1-4和应用对比例1-16分别配置成质量浓度为1.5mg/mL样品溶液，实验分为对照组和实验组，将对照组中的培养基替换为新鲜培养基，将实验组中培养基替换为含有实施例1-4和对比例1-16配制的溶液的培养基，继续培养12小时。将对照组部分遮光保护，其余对照组和实验组置于蓝光灯下连续照射6小时。然后每孔加入200μl MTT(1mg/ml)溶液，细胞在37℃下继续孵育3小时；每孔加入200μl DMSO，振荡使其溶解，然后在酶标仪490nm处测量OD值。细胞活性＝OD实验组/OD对照组，计算结果如表4和图1所示。

表4

样品	细胞活性
		对照组	100％
对照组+蓝光照射	65.87％
		实施例1+蓝光照射	88.23％
实施例2+蓝光照射	87.69％
		实施例3+蓝光照射	87.48％
实施例4+蓝光照射	85.66％
		对比例1+蓝光照射	70.51％
对比例2+蓝光照射	69.02％
		对比例3+蓝光照射	68.04％
对比例4+蓝光照射	67.33％
		对比例5+蓝光照射	68.52％
对比例6+蓝光照射	73.52％
		对比例7+蓝光照射	72.44％
对比例8+蓝光照射	72.69％
		对比例9+蓝光照射	71.63％
对比例10+蓝光照射	72.51％
		对比例11+蓝光照射	77.52％
对比例12+蓝光照射	79.34％
		对比例13+蓝光照射	78.36％
对比例14+蓝光照射	77.51％
		对比例15+蓝光照射	76.35％
对比例16+蓝光照射	75.47％

从表4和图1中可以看出实施例1-4在蓝光照射后和对照组在蓝光照射(对照组+蓝光照射)后相比，细胞活性都得到了提高，且实施例1，加入的修护蓝光损伤组合物为10％时，细胞活性最高，说明本发明的修护蓝光霜可以修护蓝光引起的损伤；从对比例1-10和实施例1对比可知，通过组合配比海茴香愈伤组织培养物滤液与乳酸杆菌/北美圣草发酵产物提取物、杉叶蕨藻提取物、紫苑提取物、表棓儿茶酚棓酸葡糖苷，五者协同增效，缺一不可，不添加任一成分均导致细胞活性的降低；从对比例11-16和实施例1对比的结果得出，海茴香愈伤组织培养物滤液与乳酸杆菌/北美圣草发酵产物提取物、杉叶蕨藻提取物、紫苑提取物、表棓儿茶酚棓酸葡糖苷的重量份数只有在本发明所述范围内对蓝光损伤的修护效果才最佳。

测试2 DPPH自由基清除实验测试

分别取2mL乙醇和2mL浓度为0.3mM(3×10^-5mol/L)的DPPH溶液置于试管A₀中，静置30min，用紫外分光光度计，在517nm波长下，测定吸光度值。将实施例1-4和对比例1-16分别配置成质量浓度为1.2mg/mL样品溶液，分别取实施例1-4和对比例1-16配制的溶液2mL置于反应试管Ai中，加入DPPH乙醇溶液2mL；取2.0mL乙醇及2.0mL实施例1-4和对比例1-16配制的溶液置于试管Aj中。各试管静置30min，用紫外分光光度计，在517nm波长下，测定各试管的吸光度值。

表5测试样

DPPH自由基清除率计算公式为：

式中，A₀为DPPH乙醇溶液的吸光度值；Ai为样品溶液清除DPPH自由基后吸光度值；Aj为样品溶液的吸光度值。

DPPH清除率的结果如表6和图2所示。

表6

从表6和图2中可以看出，实施例1，即使用了含有修护蓝光损伤组合物的霜DPPH自由基清除率最高，且从实施例1-4中可以看出DPPH自由基清除率和修护蓝光损伤组合物的含量呈正相关，说明该发明的防蓝光和修护蓝光霜可以有效改善自由基清除率弱化的问题；对比例1-10和实施例1对比可知，通过组合配比海茴香愈伤组织培养物滤液与乳酸杆菌/北美圣草发酵产物提取物、杉叶蕨藻提取物、紫苑提取物、表棓儿茶酚棓酸葡糖苷，五者协同增效，缺一不可，不添加任一成分均导致DPPH自由基清除率的降低。从对比例11-16和实施例1对比的结果得出，海茴香愈伤组织培养物滤液与乳酸杆菌/北美圣草发酵产物提取物、杉叶蕨藻提取物、紫苑提取物、表棓儿茶酚棓酸葡糖苷的重量份数只有在本发明所述范围内，DPPH自由基清除率效果最佳。

测试3皮肤弹性测试

选取30～45岁有皱纹的志愿者100人，随机分成20组，每组5人，将实施例1-4以及对比例1-16制备得到的修护蓝光损伤霜进行受试者体验测试。测试周期为4周，每天早晚各涂抹一次。使用皮肤弹性仪Cutometer MPA580分别于未使用时、第4周时进行测试，测试值越接近1，表明皮肤的弹性越好，变化值越大，说明提高皮肤弹性的效果越明显，实验结果见表7和图3。

表7

样品	第0周	第4周	变化值
				实施例1	0.606	0.741	0.135
实施例2	0.598	0.729	0.131
				实施例3	0.615	0.734	0.119
实施例4	0.547	0.668	0.121
				对比例1	0.598	0.639	0.041
对比例2	0.570	0.602	0.032
				对比例3	0.596	0.635	0.039
对比例4	0.610	0.650	0.040
				对比例5	0.583	0.620	0.037
对比例6	0.597	0.650	0.053
				对比例7	0.595	0.651	0.056
对比例8	0.607	0.671	0.064
				对比例9	0.610	0.672	0.062
对比例10	0.599	0.659	0.060
				对比例11	0.589	0.665	0.076
对比例12	0.603	0.681	0.078
				对比例13	0.582	0.654	0.072
对比例14	0.573	0.644	0.071
				对比例15	0.569	0.638	0.069
对比例16	0.594	0.668	0.074

从表7和图3的实验结果可以看出，使用实施例1-4的修护蓝光损伤霜4周后，可有效提高皮肤弹性，说明本发明的修护蓝光损伤霜能更好的改善皮肤老化的现象。从对比例1-10中可以看出，通过组合配比海茴香愈伤组织培养物滤液与乳酸杆菌/北美圣草发酵产物提取物、杉叶蕨藻提取物、紫苑提取物、表棓儿茶酚棓酸葡糖苷，五者每个成分添加量不足或过高时都不能有效提高皮肤弹性；五者组合配比，协同增效，在本发明的所述范围内，才能有效改善因蓝光引起的皮肤老化现象。

鉴于可以应用所公开的发明的原理的许多可能的实施例，应当认识到，所示的实施例仅是本申请的优选示例，而不应视为限制本申请的范围。相反，本申请的范围由所附权利要求书限定。因此，我们要求保护所有落入这些权利要求的范围和精神内的发明。