阅读说明：本技术 一类三萜类衍生物及其作为程序性细胞坏死抑制剂的用途 (Triterpenoid derivatives and application thereof as programmed cell necrosis inhibitor ) 是由 庄春林 王志斌 *** 马皓 黄嘉璇 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一类三萜类衍生物,或其异构体、盐或溶剂合物的前体药物,具有式I所示的通式结构：<Image he="490" wi="619" file="DDA0002539571130000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>式中各取代基详见说明书。本发明的三萜类衍生物或其异构体、盐或溶剂合物的前体药物可以作为程序性细胞坏死抑制剂,有效抑制细胞发生程序性坏死；可以用于制备程序性细胞坏死相关缺血性疾病的防治药物。(The invention discloses a triterpenoid derivative, or a prodrug of an isomer, a salt or a solvate thereof, which has a general structure shown in a formula I: the details of each substituent in the formula are shown in the specification. The triterpenoid derivative or the prodrug of the isomer, the salt or the solvate thereof can be used as a programmed cell necrosis inhibitor to effectively inhibit programmed cell necrosis; can be used for preparing medicines for preventing and treating ischemic diseases related to programmed cell necrosis.)

一类三萜类衍生物及其作为程序性细胞坏死抑制剂的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一类三萜类衍生物及其作为程序性细胞坏死抑制剂的用途。

背景技术

三萜类化合物是通过角鲨烯环化后在生物活性上与甾体相似的天然产物。三萜类化合物，如齐墩果酸和熊果酸，在许多亚洲国家被用于药物治疗，并且具有微弱的抗肿瘤和抗炎特性。现在已经合成并测试了大量齐墩果酸和熊果酸的衍生物，用作潜在的化学治疗药物。2-氰基-3,12-二氧代齐墩果烷-1,9(11)-二烯-28-羧酸(CDDO)(R.Borella,L.Forti,L.Gibellini et al.,Synthesis and Anticancer Activity of CDDO and CDDO-Me,TwoDerivatives of Natural Triterpenoids.[J]Molecules,24(22):4097-4117.)是一种合成的齐墩果烷衍生物，具有较强的抗增殖、分化和抗炎活性。其化学结构如下：

程序性细胞坏死作为目前研究广泛的细胞死亡途径，在器官发育、免疫系统的稳态以及疾病的发病机制等多个生理过程中发挥重要作用；是由肿瘤坏死因子受体及Toll样受体家族诱导，受体相互作用蛋白激酶RIPK1(receptor interacting protein kinase 1)和RIPK3来介导并进行募集磷酸化混合谱系激酶域样蛋白(mixed lineage kinasedomain-like protein，MLKL)，从而导致RIPK1-RIPK3-MLKL复合物的形成，最终表现为细胞膜的完整性丢失、细胞器肿胀、线粒体功能障碍等。研究表明，程序性细胞坏死与人类中枢神经细胞疾病密切相关，比如脑卒中(Degterev A,Huang Z,Boyce M,et al.Chemicalinhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemicbrain injury[J].nature chemical biology,2005,1(2):112-119.)、肌萎缩侧硬化病(Ito Yasushi,Ofengeim Dimitry,Najafov Ayaz et al.RIPK1 mediates axonaldegeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.[J].Science,2016,353:603-8.)和阿尔兹海默症(Caccamo Antonella,Branca Caterina,PirasIgnazio S et al.Necroptosis activation in Alzheimer's disease.[J].Nat.Neurosci.,2017,20:1236-1246.)等。缺血性脑卒中是由于脑部血液供应障碍，导致缺血、缺氧，从而引起的脑组织的缺血性坏死或者脑软化，是一种可导致死亡和残疾的中枢神经系统疾病。脑缺血后RIPK3、MLKL表达均升高，主要分布在神经元与星形胶质细胞，并且这些RIPK3和MLKL阳性细胞都呈现出坏死的超微结构特征。缺血再灌注(ischemia andreperfusion，I/R)作为脑缺血后的另一种损伤表现形式，目前有研究认为其发病机制也与程序性细胞坏死有关。一项研究表明，TRAF2是脑缺血性损伤的新型调节剂，敲除TRAF2加剧了小胶质细胞死亡和神经元细胞死亡，在MCAO前预处理Nec-1，可以抑制TRAF2敲除加剧的细胞死亡(J.Li,J.Zhang,Y.Zhang,Z.Wang,Y.Song,S.Wei,M.He,S.You,J.Jia,J.Cheng,TRAF2 protects against cerebral ischemia-induced brain injury by suppressingnecroptosis,Cell Death Dis 10(5)(2019)328.)，提示缺血性脑损伤可能与程序性细胞坏死的靶点有关。

最近，研究发现齐墩果烷衍生物可作为一种新型的程序性细胞坏死抑制剂，并进一步研究了该类化合物在制备程序性细胞坏死的药物、脑缺血/再灌注损伤的药物中的应用。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一类含有酰胺或酯基侧链的三萜类衍生物。

本发明的另一目的是提供一种所述三萜类衍生物的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种所述三萜类衍生物作为程序性细胞坏死抑制剂的用途。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供了一类三萜类衍生物，或其异构体、盐或溶剂合物的前体药物，具有式I所示的通式结构：

R₁为以下基团中的一种：氨基(-NH₂)、卤素(F、Cl、Br、I)、-NHR₃、-NHCOOR₄、-OR₅、-NR₆R₇；

R₃为以下基团中的一种：C3～C20烷基、苯基、苄基、萘基、烷基上的至少一个氢被卤素取代的C1～C20烷基、环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、1,2,3,4-四氢萘基、-(CH₂)nNHCOOCR₈R₉R₁₀；n为1～4的整数，R₈、R₉、R₁₀同时或不同时为氢、甲基、乙基、正丙基；

R₄为以下基团中的一种：C1～C20烷基、苯基、萘基；

R₅为以下基团中的一种：C2～C20烷基、苯基、苯并***基、吡啶并***基；

R₆、R₇与C或杂原子N组成C3～C8的环，或上述C3～C8的环上的至少一个氢被吡啶取代的基团；不包括

较优选的，所述三萜类衍生物中，

R₁为以下基团中的一种：氨基(-NH₂)、卤素(F、Cl、Br、I)、-NHR₃、-NHCOOR₄、-OR₅、

R₃为以下基团中的一种：正丙基、正戊基、苯基、苄基、萘基、-CH₂Br、-CH₂CH₂Br、环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、1,2,3,4-四氢萘基、-CH₂NHCOOC(CH₃)₃、-CH₂CH₂NHCOOC(CH₃)₃、-CH₂CH₂CH₂NHCOOC(CH₃)₃；

R₄为以下基团中的一种：甲基、乙基、正丙基、正戊基、苯基、萘基；

R₅为以下基团中的一种：乙基、正丙基、正戊基、苯基、苯并***基()、吡啶并***基(

)。

最优选的，所述三萜类衍生物选自以下结构中的一种：

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-N-苄基-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-4)

叔丁基(2-(((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十八氢苉-4a-羧酰胺基)氨基甲酸乙酯；(化合物I-5)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-N-(2-溴乙基)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-6)

4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-N-环己基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-7)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢萘4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-8)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-N-((S)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢萘4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-9)

(4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-3,13-二氧代-8a-(4-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-1-羰基)-3,4,4a，5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八碳二氢吡啶-2-腈；(化合物I-11)

(4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-3,13-二氧代-8a-(4-(吡啶-3-基)-1H-咪唑-1-羰基)-3,4,4a，5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八碳二氢吡啶-2-腈；(化合物I-12)

1H-苯并[d][1,2,3]***-1-基(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶并4a(2H)-羧酸盐；(化合物I-13)

3H-[1,2,3]***并[4,5-b]吡啶-3-基(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酸盐(化合物I-14)。

本发明的化合物可按照常规方法制备为药用盐的形式。

所述药用盐为有机酸、无机酸盐。

所述无机酸是指盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸或硝酸等。

所述有机酸是指乙酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸或草酸等。

本发明的第二方面，提供了一种所述三萜类衍生物的制备方法，包括以下步骤：

将2-氰基-3,12-二氧代齐墩果烷-1,9(11)-二烯-28-羧酸化合物CDDO溶解在二氯甲烷中，加入催化量的二甲基甲酰胺，冰浴下缓慢滴加过量的草酰氯，继续反应，缓慢恢复至室温反应，将反应液浓缩并蒸干，所得粗品直接用于下步反应；将上述粗品溶解在干燥的二氯甲烷中，冰浴下依次加入过量的胺类催化剂和过量的胺类化合物，反应后缓慢升至室温继续反应，反应完全后将反应液水洗、盐洗，加入无水硫酸钠干燥，经柱纯化后得到通式I所示的三萜类衍生物；

或，将2-氰基-3,12-二氧代齐墩果烷-1,9(11)-二烯-28-羧酸化合物CDDO溶解在二氯甲烷中，加入催化量的二甲基甲酰胺，冰浴下缓慢滴加过量的草酰氯，加入完毕后继续反应，缓慢恢复至室温反应，然后向反应液内加入过量醇类物质，继续反应，经柱纯化后得到通式I所示的三萜类衍生物；

或，将2-氰基-3,12-二氧代齐墩果烷-1,9(11)-二烯-28-羧酸化合物CDDO溶解在氯仿中，加入过量的三乙胺在室温下搅拌反应，然后加入过量的磷酸酯类物质，并搅拌反应，经柱纯化后得到通式I所示的三萜类衍生物。

所述胺类催化剂为三乙胺。

所述胺类化合物为苄胺、(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯、(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯、氨基环己烷、(R)-1,2,3,4-四氢萘-1-胺、(S)-1,2,3,4-四氢萘-1-胺、2-(1H-咪唑-4-基)吡啶、2-(1H-咪唑-4-基)吡啶。

所述醇类物质为乙醇、正丙醇中的一种。

所述磷酸酯类物质为2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)。

本发明的第三方面，提供了一种所述三萜类衍生物作为程序性细胞坏死抑制剂的用途。

所述三萜类衍生物，或其异构体、盐或溶剂合物的前体药物，具有式I或II所示的通式结构：

R₁为以下基团中的一种：羟基、氨基(-NH₂)、卤素(F、Cl、Br、I)、-NHR₃、-NHCOOR₄、-OR₅、-NR₆R₇；

R₃为以下基团中的一种：C1～C20烷基、苯基、苄基、萘基、烷基上的至少一个氢被卤素取代的C1～C20烷基、环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、1,2,3,4-四氢萘基、-(CH₂)nNHCOOCR₈R₉R₁₀；n为1～4的整数，R₈、R₉、R₁₀同时或不同时为氢、甲基、乙基、正丙基；

R₄为以下基团中的一种：C1～C20烷基、苯基、萘基；

R₅为以下基团中的一种：C1～C20烷基、苯基、苯并***基、吡啶并***基；

R₆、R₇与C或杂原子N组成C3～C8的环，或上述C3～C8的环上的至少一个氢被吡啶取代的基团；

R₂为以下基团中的一种：羟基、C1～C20烷基、烷基上的至少一个氢被氟取代的C1～C20烷基。

较优选的，所述三萜类衍生物中，

R₁为以下基团中的一种：羟基、氨基(-NH₂)、卤素(F、Cl、Br、I)、-NHR₃、-NHCOOR₄、-OR₅、

R₃为以下基团中的一种：甲基、乙基、正丙基、正戊基、苯基、苄基、萘基、-CH₂Br、-CH₂CH₂Br、环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、1,2,3,4-四氢萘基、-CH₂NHCOOC(CH₃)₃、-CH₂CH₂NHCOOC(CH₃)₃、-CH₂CH₂CH₂NHCOOC(CH₃)₃；

R₄为以下基团中的一种：甲基、乙基、正丙基、正戊基、苯基、萘基；

R₅为以下基团中的一种：甲基、乙基、正丙基、正戊基、苯基、苯并***基()、吡啶并***基()；

R₂为以下基团中的一种：羟基、甲基、乙基、正丙基、正戊基、-CF₃、-CF₂CH₃。

最优选的，所述三萜类衍生物选自以下结构中的一种：

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酸；(化合物CDDO)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-N,2,2,6a,6b,9,9,12a-八甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-1)

甲基(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酸盐；(化合物I-2)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-N-乙基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-3)

N-(((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-dioxo-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-基)-2,2-二氟丙酰胺；(化合物II-1)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-N-苄基-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-4)

叔丁基(2-(((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十八氢苉-4a-羧酰胺基)氨基甲酸乙酯；(化合物I-5)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-N-(2-溴乙基)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-6)

4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-N-环己基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-7)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢萘4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-8)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-N-((S)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢萘4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-9)

(4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-8a-(1H-咪唑-1-羰基)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-3,13-二氧-3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八碳氢吡啶-2-甲腈；(化合物I-10)

(4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-3,13-二氧代-8a-(4-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-1-羰基)-3,4,4a，5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八碳二氢吡啶-2-腈；(化合物I-11)

(4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-3,13-二氧代-8a-(4-(吡啶-3-基)-1H-咪唑-1-羰基)-3,4,4a，5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八碳二氢吡啶-2-腈；(化合物I-12)

1H-苯并[d][1,2,3]***-1-基(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶并4a(2H)-羧酸盐；(化合物I-13)

3H-[1,2,3]***并[4,5-b]吡啶-3-基(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酸盐(化合物I-14)。

进一步，本发明的第四方面，提供了一种所述三萜类衍生物，或其异构体、盐或溶剂合物的前体药物在制备抗程序性细胞坏死的药物中的应用。

所述三萜类衍生物，或其异构体、盐或溶剂合物的前体药物，具有式I或II所示的通式结构：

R₁为以下基团中的一种：羟基、氨基(-NH₂)、卤素(F、Cl、Br、I)、-NHR₃、-NHCOOR₄、-OR₅、-NR₆R₇；

R₃为以下基团中的一种：C1～C20烷基、苯基、苄基、萘基、烷基上的至少一个氢被卤素取代的C1～C20烷基、环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、1,2,3,4-四氢萘基、-(CH₂)nNHCOOCR₈R₉R₁₀；n为1～4的整数，R₈、R₉、R₁₀同时或不同时为氢、甲基、乙基、正丙基；

R₄为以下基团中的一种：C1～C20烷基、苯基、萘基；

R₅为以下基团中的一种：C1～C20烷基、苯基、苯并***基、吡啶并***基；

R₆、R₇与C或杂原子N组成C3～C8的环，或上述C3～C8的环上的至少一个氢被吡啶取代的基团；

R₂为以下基团中的一种：羟基、C1～C20烷基、烷基上的至少一个氢被氟取代的C1～C20烷基。

较优选的，所述三萜类衍生物中，

R₁为以下基团中的一种：羟基、氨基(-NH₂)、卤素(F、Cl、Br、I)、-NHR₃、-NHCOOR₄、-OR₅、

R₃为以下基团中的一种：甲基、乙基、正丙基、正戊基、苯基、苄基、萘基、-CH₂Br、-CH₂CH₂Br、环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、1,2,3,4-四氢萘基、-CH₂NHCOOC(CH₃)₃、-CH₂CH₂NHCOOC(CH₃)₃、-CH₂CH₂CH₂NHCOOC(CH₃)₃；

R₄为以下基团中的一种：甲基、乙基、正丙基、正戊基、苯基、萘基；

R₅为以下基团中的一种：甲基、乙基、正丙基、正戊基、苯基、苯并***基()、吡啶并***基(

)；

R₂为以下基团中的一种：羟基、甲基、乙基、正丙基、正戊基、-CF₃、-CF₂CH₃。

最优选的，所述三萜类衍生物选自以下结构中的一种：

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酸；(化合物CDDO)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-N,2,2,6a,6b,9,9,12a-八甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-1)

甲基(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酸盐；(化合物I-2)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-N-乙基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-3)

N-(((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-dioxo-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-基)-2,2-二氟丙酰胺；(化合物II-1)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-N-苄基-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-4)

叔丁基(2-(((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十八氢苉-4a-羧酰胺基)氨基甲酸乙酯；(化合物I-5)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-N-(2-溴乙基)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-6)

4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-N-环己基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-7)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢萘4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-8)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-N-((S)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢萘4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-9)

(4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-8a-(1H-咪唑-1-羰基)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-3,13-二氧-3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八碳氢吡啶-2-甲腈；(化合物I-10)

(4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-3,13-二氧代-8a-(4-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-1-羰基)-3,4,4a，5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八碳二氢吡啶-2-腈；(化合物I-11)

(4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-3,13-二氧代-8a-(4-(吡啶-3-基)-1H-咪唑-1-羰基)-3,4,4a，5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八碳二氢吡啶-2-腈；(化合物I-12)

1H-苯并[d][1,2,3]***-1-基(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶并4a(2H)-羧酸盐；(化合物I-13)

3H-[1,2,3]***并[4,5-b]吡啶-3-基(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酸盐(化合物I-14)。

进一步，本发明的第五方面，提供了一种所述三萜类衍生物，或其异构体、盐或溶剂合物的前体药物在制备治疗脑缺血/再灌注损伤的药物中的应用。

所述三萜类衍生物，或其异构体、盐或溶剂合物的前体药物，具有式I或II所示的通式结构：

R₁为以下基团中的一种：羟基、氨基(-NH₂)、卤素(F、Cl、Br、I)、-NHR₃、-NHCOOR₄、-OR₅、-NR₆R₇；

R₃为以下基团中的一种：C1～C20烷基、苯基、苄基、萘基、烷基上的至少一个氢被卤素取代的C1～C20烷基、环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、1,2,3,4-四氢萘基、-(CH₂)nNHCOOCR₈R₉R₁₀；n为1～4的整数，R₈、R₉、R₁₀同时或不同时为氢、甲基、乙基、正丙基；

R₄为以下基团中的一种：C1～C20烷基、苯基、萘基；

R₅为以下基团中的一种：C1～C20烷基、苯基、苯并***基、吡啶并***基；

R₆、R₇与C或杂原子N组成C3～C8的环，或上述C3～C8的环上的至少一个氢被吡啶取代的基团；

R₂为以下基团中的一种：羟基、C1～C20烷基、烷基上的至少一个氢被氟取代的C1～C20烷基。

较优选的，所述三萜类衍生物中，

R₁为以下基团中的一种：羟基、氨基(-NH₂)、卤素(F、Cl、Br、I)、-NHR₃、-NHCOOR₄、-OR₅、

R₃为以下基团中的一种：甲基、乙基、正丙基、正戊基、苯基、苄基、萘基、-CH₂Br、-CH₂CH₂Br、环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、1,2,3,4-四氢萘基、-CH₂NHCOOC(CH₃)₃、-CH₂CH₂NHCOOC(CH₃)₃、-CH₂CH₂CH₂NHCOOC(CH₃)₃；

R₄为以下基团中的一种：甲基、乙基、正丙基、正戊基、苯基、萘基；

R₅为以下基团中的一种：甲基、乙基、正丙基、正戊基、苯基、苯并***基(

)、吡啶并***基(

)；

R₂为以下基团中的一种：羟基、甲基、乙基、正丙基、正戊基、-CF₃、-CF₂CH₃。

最优选的，所述三萜类衍生物选自以下结构中的一种：

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酸；(化合物CDDO)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-N,2,2,6a,6b,9,9,12a-八甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-1)

甲基(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酸盐；(化合物I-2)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-N-乙基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-3)

N-(((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-dioxo-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-基)-2,2-二氟丙酰胺；(化合物II-1)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-N-苄基-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-4)

叔丁基(2-(((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十八氢苉-4a-羧酰胺基)氨基甲酸乙酯；(化合物I-5)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-N-(2-溴乙基)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-6)

4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-N-环己基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-7)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢萘4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-8)

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-N-((S)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢萘4a(2H)-羧酰胺；(化合物I-9)

(4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-8a-(1H-咪唑-1-羰基)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-3,13-二氧-3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八碳氢吡啶-2-甲腈；(化合物I-10)

(4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-3,13-二氧代-8a-(4-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-1-羰基)-3,4,4a，5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八碳二氢吡啶-2-腈；(化合物I-11)

(4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-3,13-二氧代-8a-(4-(吡啶-3-基)-1H-咪唑-1-羰基)-3,4,4a，5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八碳二氢吡啶-2-腈；(化合物I-12)

1H-苯并[d][1,2,3]***-1-基(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶并4a(2H)-羧酸盐；(化合物I-13)

3H-[1,2,3]***并[4,5-b]吡啶-3-基(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酸盐(化合物I-14)。

上面给出的通式I或II的定义中，汇集所用术语一般定义如下：

术语烷基是指含1至20个碳原子的直链或支链饱和脂肪烃基团，例如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基等。

术语烷基上的至少一个氢被卤素取代的C1～C20烷基如-CH₂Br、-CH₂CH₂Br。

术语C3～C8的环如咪唑基、哌啶基等。

术语C3～C8的环上的至少一个氢被吡啶取代的基团如

术语烷基上的至少一个氢被氟取代的C1～C20烷基如-CF₃、-CF₂CH₃等。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明的三萜类衍生物或其异构体、盐或溶剂合物的前体药物可以作为程序性细胞坏死抑制剂，有效抑制细胞发生程序性坏死；可以用于制备程序性细胞坏死相关缺血性疾病的防治药物。

附图说明

图1为实施例13制备的化合物对注射TNF-α的小鼠总体生存率和体温的影响示意图，其中，A为小鼠总体生存率统计示意图，B为小鼠体温记录示意图。

图2为MCAO大鼠脑梗死指标统计示意图，其中，A为神经功能评估示意图，B为大鼠脑梗死比例统计示意图。

图3为MCAO大鼠大脑中脑梗死的代表性TTC染色图。

图4为MCAO大鼠大脑中海马区和皮层的HE染色图：缺血性大脑皮层cortex(放大倍数：×200)，缺血性脑海马区CA3(放大倍数：×100)和缺血性脑海马区CA1(放大倍数：×200)。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-N,2,2,6a,6b,9,9,12a-八甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺的制备：

将30mg 2-氰基-3,12-二氧代齐墩果烷-1,9(11)-二烯-28-羧酸(Bardoxolone，CDDO，购自鹰谷试剂网(www.integle.com)，厂家为毕得医药科技有限公司，规格1g)溶解在5mL二氯甲烷中，加入催化量的二甲基甲酰胺，冰浴下缓慢滴加16μL草酰氯，加入完毕后继续反应10分钟，缓慢恢复至室温反应1小时。将反应液浓缩并蒸干，所得粗品直接用于下步反应。

将上述粗品溶解在5mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下依次加入16μL三乙胺和20μL甲胺，反应10分钟后缓慢升至室温，继续反应4小时，将反应液水洗、盐洗，加入无水硫酸钠干燥，经柱纯化后得25mg白色固体即三萜类衍生物化合物I-1，收率77％。

实施例2

甲基(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酸盐的制备

将30mg CDDO溶解在5mL二氯甲烷中，加入催化量的二甲基甲酰胺，冰浴下缓慢滴加16μL草酰氯，加入完毕后继续反应10分钟，缓慢恢复至室温反应1小时。向反应液内加入过量甲醇，继续反应1小时。经柱纯化后得29mg白色固体即三萜类衍生物化合物I-2，收率96％。

实施例3

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-N-乙基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺的制备

将40mg CDDO溶解在10mL二氯甲烷中，加入催化量的二甲基甲酰胺，冰浴下缓慢滴加25μL草酰氯，加入完毕后继续反应10分钟，缓慢恢复至室温反应1小时。将反应液浓缩并蒸干，所得粗品直接用于下步反应。将上述粗品溶解在10mL干燥二氯甲烷中，冰浴下依次加入25μL三乙胺和40μL乙胺，反应10分钟后缓慢升至室温，继续反应4小时，将反应液水洗、盐洗，加入无水硫酸钠干燥，经柱纯化后得30mg白色固体即三萜类衍生物化合物I-3，收率71％。

实施例4

N-(((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-dioxo-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-基)-2,2-二氟丙酰胺的制备

化合物直接购买自MCE小分子抑制剂库(https://www.medchemexpress.cn/)，同义名称：RTA-408；目录号：HY-12212，HPLC纯度：99.4％。

实施例5

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-N-苄基-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺的制备

将30mg CDDO溶解在5mL二氯甲烷中，加入催化量的二甲基甲酰胺，冰浴下缓慢滴加16μL草酰氯，加入完毕后继续反应10分钟，缓慢恢复至室温反应1小时。将反应液浓缩并蒸干，所得粗品直接用于下步反应。将上述粗品溶解在10mL干燥二氯甲烷中，冰浴下依次加入16μL三乙胺和20μL苄胺，反应10分钟后缓慢升至室温，继续反应4小时，将反应液水洗、盐洗，加入无水硫酸钠干燥。经柱纯化后(石油醚/乙酸乙酯5:1)得25mg白色固体即三萜类衍生物化合物I-4，收率74％。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ:0.90(s,3H,CH₃),0.99(s,3H,CH₃),1.00(s,3H,CH₃),1.15(s,3H,CH₃),1.16(s,3H,CH₃),1.24(s,3H,CH₃),1.29-1.36(m,2H,CH₂),1.46(s,3H,CH₃),1.49-1.75(m,10H,5CH₂),1.83-1.88(dt,1H,J₁＝4.9Hz,J₂＝13.5Hz,8-CH_a),1.96-2.01(dt,1H,J₁＝3.5Hz,J₂＝13.5Hz,8-CH_b),2.91-2.93(dt,1H,J₁＝4.2Hz,J₂＝13.5Hz,14b-CH),3.00-3.01(1H,d,J＝4.2Hz,14a-CH),4.43-4.51(m,2H,NCH₂),5.96(s,1H,13-CH),6.18-6.20(t,1H,J＝5.6Hz,NH),7.26-7.30(m,5H,Ar-H),8.04(s,1H,12-CH).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:18.24,21.56,21.73,23.13,24.70,26.62,27.00,27.74,30.63,31.66,32.01,33.26,34.11,34.61,36.11,42.11,42.53,43.69,45.01,45.85,46.50,47.70,49.49,114.40,114.58,123.95,127.45,127.98,128.69,138.85,165.79,168.71,176.92,196.56,198.95.MS(ESI):581.402(M+H)⁺,603.343(M+Na)⁺,619.317(M+K)⁺.

实施例6

叔丁基(2-(((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十八氢苉-4a-羧酰胺基)氨基甲酸乙酯的制备

将60mg CDDO溶解在15mL二氯甲烷中，加入催化量的二甲基甲酰胺，冰浴下缓慢滴加35μL草酰氯，加入完毕后继续反应10分钟，缓慢恢复至室温反应1小时。将反应液浓缩并蒸干，所得粗品直接用于下步反应。将上述粗品溶解在15mL干燥二氯甲烷中，冰浴下依次加入30μL三乙胺和40μL(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯，反应10分钟后缓慢升至室温，继续反应4小时，将反应液水洗、盐洗，加入无水硫酸钠干燥，经柱纯化后(石油醚/乙酸乙酯5:1)得58mg白色固体即三萜类衍生物化合物I-5，收率92％。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ:0.92(s,3H,CH₃),1.02(s,3H,CH₃),1.04(s,3H,CH₃),1.19(s,3H,CH₃),1.28(s,3H,CH₃),1.35(s,3H,CH₃),1.26-1.30(m,4H,2CH₂),1.47(s,9H,3CH₃),1.50(s,3H,CH₃),1.53-1.81(m,8H,4CH₂),1.83-1.86(dt,1H,J₁＝4.5Hz,J₂＝13.5Hz,8-CH_a),2.01-2.05(dt,1H,J₁＝3.9Hz,J₂＝13.5Hz,8-CH_b),2.97-2.99(dt,1H,J₁＝3.0Hz,J₂＝14.2Hz,14b-CH),3.11-3.11(1H,d,J＝3.0Hz,14a-CH),3.28-3.36(m,2H,CH₂),3.41-3.42(m,2H,NCH₂),5.99(s,1H,13-CH),6.85(s,1H,NH),8.08(s,1H,12-CH).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:14.21,18.24,21.56,21.72,23.02,23.10,24.80,26.60,26.98,27.84,28.39,30.62,31.66,33.30,34.00,34.64,35.99,42.14,42.54,45.01,45.86,46.41,47.74,49.41,60.40,114.39,114.57,124.05,157.22,165.80,171.17,178.10,196.58,199.01.MS(ESI):656.428(M+Na)⁺,672.394(M+K)⁺.

实施例7

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-N-(2-溴乙基)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺的制备

将50毫克CDDO溶解在15毫升二氯甲烷中，加入催化量的二甲基甲酰胺，冰浴下缓慢滴加35微升草酰氯，加入完毕后继续反应10分钟，缓慢恢复至室温反应1小时。将反应液浓缩并蒸干，所得粗品直接用于下步反应。将上述粗品溶解在15毫升干燥二氯甲烷中，冰浴下依次加入30微升三乙胺和40微升(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯，反应10分钟后缓慢升至室温，继续反应4小时，将反应液水洗、盐洗，加入无水硫酸钠干燥，经柱纯化(石油醚/乙酸乙酯4:1～3:1)后得45.5毫克白色固体即三萜类衍生物化合物I-6，收率80％。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ:0.90(s,3H,CH₃),1.01(s,3H,CH₃),1.01(s,3H,CH₃),1.16(s,3H,CH₃),1.25(s,3H,CH₃),1.34(s,3H,CH₃),1.47(s,3H,CH₃),1.51-1.58(m,4H,2CH₂),2.99-3.02(dt,1H,J₁＝4.5Hz,J₂＝14.2Hz,14b-CH),3.18-3.19(1H,d,J＝4.5Hz,14a-CH),3.83-3.86(dt,2H,J₁＝3.4Hz,J₂＝9.3Hz,CH₂),4.18-4.23(dd,2H,J₁＝9.3Hz,J₂＝9.3Hz,CH₂),5.96(s,1H,13-CH),8.04(s,1H,12-CH).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:19.19,22.99,23.12,23.77,24.62,26.62,27.00,27.49,28.94,30.39,31.65,32.02,33.06,33.29,34.40,35.69,38.76,40.94,42.12,42.52,45.02,45.84,47.77,49.26,114.39,114.59,124.09,165.78,167.77,173.13,196.60,199.17.

实施例8

4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-N-环己基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六碳氢吡啶-4a(2H)-羧酰胺的制备

将50mg CDDO溶解在15毫升二氯甲烷中，加入催化量的二甲基甲酰胺，冰浴下缓慢滴加35微升草酰氯，加入完毕后继续反应10分钟，缓慢恢复至室温反应1小时。将反应液浓缩并蒸干，所得粗品直接用于下步反应。将上述粗品溶解在15毫升干燥二氯甲烷中，冰浴下依次加入30微升三乙胺和30微升氨基环己烷，反应10分钟后缓慢升至室温，继续反应4小时，将反应液水洗、盐洗，加入无水硫酸钠干燥，经柱纯化后(石油醚/乙酸乙酯5:1)得43毫克白色固体即三萜类衍生物化合物I-7，收率74％。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ:0.90(s,3H,CH₃),0.99(s,3H,CH₃),1.01(s,3H,CH₃),1.05-1.08(m,1H,CH),1.09-1.16(m,2H,CH₂),1.18(s,3H,CH₃),1.25(s,3H,CH₃),1.31(s,3H,CH₃),1.36-1.38(m,1H,CH),1.44-1.47(dt,1H,J₁＝3.3Hz,J₂＝14.2Hz,CH),1.48(s,3H,CH₃),1.51-1.54(dt,1H,J₁＝3.3Hz,J₂＝13.5Hz,CH),1.57-1.72(m,8H,4CH₂),1.76-1.81(m,5H,2CH₂,CH),1.84-1.91(m,2H,2CH),1.93-1.99(dt,1H,J₁＝3.9Hz,J₂＝13.5Hz,8-CH_b),2.85-2.87(dt,1H,J₁＝4.4Hz,J₂＝13.5Hz,14b-CH),3.06-3.07(d,1H,J＝4.4Hz,14a-CH),3.80-3.82(m,1H,CH),5.57-5.58(d,1H,J＝8.0Hz,NH),5.97(s,1H,13-CH),8.04(s,1H,12-CH).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:18.24,21.56,21.74,23.00,23.14,24.91,24.95,25.53,26.62,27.00,27.76,30.64,31.67,31.95,33.21,33.29,33.32,34.17,34.62,36.12,42.13,42.54,45.02,45.96,46.28,47.73,48.03,49.48,114.38,114.60,123.99,165.72,168.65,175.95,196.56,199.03.MS(ESI):573.467(M+H)⁺,595.398(M+Na)⁺.

实施例9

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢萘4a(2H)-羧酰胺的制备

将60mg CDDO溶解在15mL二氯甲烷中，加入催化量的二甲基甲酰胺，冰浴下缓慢滴加35μL草酰氯，加入完毕后继续反应10分钟，缓慢恢复至室温反应1小时。将反应液浓缩并蒸干，所得粗品直接用于下步反应。将上述粗品溶解在15mL干燥二氯甲烷中，冰浴下依次加入30μL三乙胺和50μL(R)-1,2,3,4-四氢萘-1-胺，反应10分钟后缓慢升至室温，继续反应4小时，将反应液水洗、盐洗，加入无水硫酸钠干燥，经柱纯化后(石油醚/乙酸乙酯5:1)得52mg白色固体即三萜类衍生物化合物I-8，收率84％。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ:0.90(s,3H,CH₃),0.96(s,3H,CH₃),1.02(s,3H,CH₃),1.18(s,3H,CH₃),1.26(s,3H,CH₃),1.29-1.36(m,2H,CH₂),1.40(s,3H,CH₃),1.50(s,3H,CH₃),1.53-1.57(m,3H,CH₂,CH),1.60(m,5H,2CH₂,CH),1.67-1.69(m,1H,CH),1.73-1.76(m,2H,CH₂),1.79-1.80(m,4H,2CH₂),1.83-1.90(m,2H,CH₂),1.93-2.03(m,2H,8-CH₂),2.73-2.85(m,3H,CH₂,14b-CH),3.07-3.08(d,1H,J＝4.5Hz,14a-CH),5.20-5.23(m,1H,CH),5.94-5.96(d,1H,J＝8.2Hz,NH),5.97(s,1H,13-CH),7.12-7.21(m,4H,Ar-H),8.03(s,1H,12-CH).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:18.28,20.10,21.57,21.80,22.90,23.13,24.99,26.66,27.03,27.82,29.27,30.42,30.64,31.72,32.14,33.25,34.18,34.60,36.19,42.16,42.56,45.03,46.00,46.57,47.34,47.74,49.62,114.36,124.04,126.37,127.36,128.35,129.43,136.77,137.75,165.62,168.81,176.15,196.52,198.84.MS(ESI):621.416(M+H)⁺,643.386(M+Na)⁺,659.359(M+K)⁺.

实施例10

(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-庚甲基-10,14-二氧代-N-((S)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢萘4a(2H)-羧酰胺的制备

将50mg CDDO溶解在15mL二氯甲烷中，加入催化量的二甲基甲酰胺，冰浴下缓慢滴加35μL草酰氯，加入完毕后继续反应10分钟，缓慢恢复至室温反应1小时。将反应液浓缩并蒸干，所得粗品直接用于下步反应。将上述粗品溶解在15mL干燥二氯甲烷中，冰浴下依次加入30μL三乙胺和45μL(S)-1,2,3,4-四氢萘-1-胺，反应10分钟后缓慢升至室温，继续反应4小时，将反应液水洗、盐洗，加入无水硫酸钠干燥，经柱纯化(石油醚/乙酸乙酯5:1)后得45mg白色固体即三萜类衍生物化合物I-9，收率73％。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ:0.86(s,3H,CH₃),1.01(s,3H,CH₃),1.02(s,3H,CH₃),1.17(s,3H,CH₃),1.18-1.20(dt,1H,J₁＝3.5Hz,J₂＝13.3Hz,CH),1.25(s,3H,CH₃),1.32-1.33(dt,1H,J₁＝4.0Hz,J₂＝14.0Hz,CH),1.39(s,3H,CH₃),1.48-1.50(m,5H,CH₂,CH₃),1.55-1.57(dt,1H,J₁＝2.8Hz,J₂＝13.5Hz,CH),1.60-1.62(dt,1H,J₁＝2.8Hz,J₂＝13.3Hz,CH),1.67-1.74(m,3H,CH,CH₂),1.76-1.84(m,7H,CH,3CH₂),1.89-1.95(dt,1H,J₁＝4.6Hz,J₂＝13.3Hz,8-CH_a),2.04-2.07(dt,1H,J₁＝4.0Hz,J₂＝13.5Hz,8-CH_b),2.07-2.08(m,1H,CH),2.75-2.80(dt,1H,J₁＝6.2Hz,J₂＝16.8Hz,2’-CH_a),2.81-2.86(dt,1H,J₁＝6.2Hz,J₂＝17.1Hz,2’-CH_b),3.01-3.03(dt,1H,J₁＝4.5Hz,J₂＝13.0Hz,14b-CH),3.16-3.17(d,1H,J＝4.5Hz,14a-CH),5.20-5.23(m,1H,CH),5.91-5.92(d,1H,J＝8.2Hz,NH),5.96(s,1H,13-CH),7.10-7.18(m,4H,Ar-H),8.04(s,1H,12-CH).¹³CNMR(75MHz,CDCl₃)δ:18.24,20.17,21.55,21.64,23.11,23.37,24.88,26.67,27.00,27.80,29.29,30.41,30.65,31.72,33.28,34.21,34.69,35.97,42.17,42.52,45.01,46.38,47.38,47.74,49.41,114.37,114.57 124.13,126.33,127.33,128.44,129.31,136.72,137.67,165.78,168.15,176.13,196.56,198.81.MS(ESI):621.393(M+H)⁺.

实施例11

(4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-8a-(1H-咪唑-1-羰基)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-3,13-二氧-3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八碳氢吡啶-2-甲腈的制备

将50mg CDDO溶解在15mL二氯甲烷中，加入催化量的二甲基甲酰胺，冰浴下缓慢滴加35μL草酰氯，加入完毕后继续反应10分钟，缓慢恢复至室温反应1小时。将反应液浓缩并蒸干，所得粗品直接用于下步反应。将上述粗品溶解在15mL干燥二氯甲烷中，冰浴下依次加入30μL三乙胺和21mg咪唑，反应10分钟后缓慢升至室温，继续反应4小时，将反应液水洗、盐洗，加入无水硫酸钠干燥，经柱纯化后得40mg白色固体即三萜类衍生物化合物I-10，收率63％。

实施例12

(4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-3,13-二氧代-8a-(4-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-1-羰基)-3,4,4a，5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八碳二氢吡啶-2-腈的制备

将50mg CDDO溶解在15mL二氯甲烷中，加入催化量的二甲基甲酰胺，冰浴下缓慢滴加35μL草酰氯，加入完毕后继续反应10分钟，缓慢恢复至室温反应1小时。将反应液浓缩并蒸干，所得粗品直接用于下步反应。将上述粗品溶解在15mL干燥二氯甲烷中，冰浴下依次加入30μL三乙胺和44mg 2-(1H-咪唑-4-基)吡啶，反应10分钟后缓慢升至室温，继续反应4小时，将反应液水洗、盐洗，加入无水硫酸钠干燥，经柱纯化后得40mg白色固体即三萜类衍生物化合物I-11，收率63％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:0.93(s,3H,CH₃),0.95(s,3H,CH₃),0.99(s,3H,CH₃),1.04(s,3H,CH₃),1.15(s,3H,CH₃),1.21(s,3H,CH₃),1.42(s,3H,CH₃),1.22-1.42(m,3H,CH,CH₂),2.08-2.30(m,3H,CH,8-CH₂),2.99-3.02(d,1H,J＝4.2Hz,14a-CH),3.12-3.13(m,1H,14b-CH),6.26(s,1H,13-CH),7.31-7.34(dd,1H,J₁＝6.4Hz,J₂＝4.0Hz,Ar-H),7.88-7.90(m,1H,Ar-H),7.95-7.97(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),8.26(s,1H,12-CH),8.58-8.59(d,1H,J＝4.0Hz,Ar-H),8.68(s,1H,Ar-H),8.74(s,1H,Ar-H).MS(ESI):619.54(M+H)⁺.HPLC纯度:>98％,Rt＝6.538分钟,UV 210nm,80％甲醇,流速:0.5mL/min.

实施例13

(4aR,6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bS)-4,4,6a,6b,11,11,14b-七甲基-3,13-二氧代-8a-(4-(吡啶-3-基)-1H-咪唑-1-羰基)-3,4,4a，5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-十八碳二氢吡啶-2-腈的制备

将50mg CDDO溶解在15mL二氯甲烷中，加入催化量的二甲基甲酰胺，冰浴下缓慢滴加35μL草酰氯，加入完毕后继续反应10分钟，缓慢恢复至室温反应1小时。将反应液浓缩并蒸干，所得粗品直接用于下步反应。将上述粗品溶解在15mL干燥二氯甲烷中，冰浴下依次加入30μL三乙胺和44mg 2-(1H-咪唑-4-基)吡啶，反应10分钟后缓慢升至室温，继续反应4小时，将反应液水洗、盐洗，加入无水硫酸钠干燥，经柱纯化后得45mg白色固体即三萜类衍生物化合物I-12，收率71％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:0.95(s,6H,2CH₃),1.00(s,3H,CH₃),1.08(s,3H,CH₃),1.16(s,3H,CH₃),1.20(s,3H,CH₃),1.43(s,3H,CH₃),2.20-2.30(m,3H,CH,8-CH₂),2.90-3.05(d,1H,J＝4.2Hz,14a-CH),3.16-3.17(m,1H,14b-CH),6.26(s,1H,13-CH),7.43-7.46(dd,1H,J₁＝4.0Hz,J₂＝7.9Hz,Ar-H),8.28-8.30(m,1H,Ar-H),8.49-8.50(d,1H,J＝4.1Hz,Ar-H),8.59(s,1H,12-CH),8.68(s,1H,Ar-H),8.72(s,1H,Ar-H),9.16(s,1H,Ar-H).MS(ESI):619.54(M+H)⁺.HPLC纯度:>98％,Rt＝12.983分钟,UV 210nm,70％甲醇,流速:0.5mL/min.

实施例14

1H-苯并[d][1,2,3]***-1-基(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶并4a(2H)-羧酸盐的制备

将50mg CDDO溶解在15mL氯仿中，加入40μL三乙胺将反应在室温下搅拌10分钟。然后加入77mg HATU，并搅拌4小时。用乙酸乙酯萃取反应物，用饱和食盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥。将合并的有机相蒸干，得到粗产物，经硅胶柱色谱纯化，使用PE/EtOAc(5:1～3:1)作为洗脱剂，得到56mg白色固体产物即三萜类衍生物化合物I-13，收率：90.4％。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ:0.99(s,3H,CH₃),1.09(s,6H,2CH₃),1.19(s,3H,CH₃),1.27(s,3H,CH₃),1.33-1.37(m,1H,CH),1.42-1.48(m,5H,CH₂,CH₃),1.51(s,3H,CH₃),1.63-1.65(m,2H,CH₂),1.72-1.74(m,2H,CH₂),1.78-1.84(m,3H,CH,CH₂),1.99-2.06(m,3H,CH,CH₂),2.18-2.23(dt,1H,J₁＝3.2Hz,J₂＝14.7Hz,8-CH_a),2.25-2.31(dt,1H,J₁＝4.4Hz,J₂＝13.7Hz,8-CH_b),3.18-3.19(d,1H,J＝4.7Hz,14a-CH),3.20-3.24(dt,1H,J₁＝4.7Hz,J₂＝13.5Hz,14b-CH),6.00(s,1H,13-CH),7.36-7.37(d,1H,J＝8.5Hz,4’-PhH),7.43-7.45(dd,1H,J₁＝7.7Hz,J₂＝8.5Hz,5’-PhH),7.54-7.57(dd,1H,J₁＝7.7Hz,J₂＝8.5Hz,6’-PhH),8.04(s,1H,12-CH),8.07-8.08(d,1H,J＝8.5Hz,7’-PhH).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:18.23,21.58,21.63,22.81,23.03,24.82,26.62,26.96,28.28,30.61,31.71,31.92,32.89,33.10,34.24,35.35,42.22,42.62,45.06,46.04,47.83,49.52,107.89,114.36,114.66,120.67,123.89,124.87,128.69,128.80,143.62,165.47,168.80,174.04,196.48,197.88.MS(ESI):609.366(M+H)⁺.

实施例15

3H-[1,2,3]***并[4,5-b]吡啶-3-基(4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-氰基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-10,14-二氧代-1,3,4,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-十六氢吡啶-4a(2H)-羧酸盐的制备

将50mg CDDO溶解在15mL氯仿中，加入40μL三乙胺将反应在室温下搅拌10分钟。然后加入76mg HBTU，并搅拌4小时。用乙酸乙酯萃取反应物，用饱和食盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥。将合并的有机相蒸干，得到粗产物，经硅胶柱色谱纯化，使用PE/EtOAc(5:1～3:1)作为洗脱剂，得到56.9mg白色固体产物即三萜类衍生物化合物I-14，收率：92％。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ:0.97(s,3H,CH₃),1.08(s,3H,CH₃),1.10(s,3H,CH₃),1.19(s,3H,CH₃),1.28(s,3H,CH₃),1.33-1.37(m,1H,CH),1.42-1.49(m,3H,CH,CH₂),1.51(s,3H,CH₃),1.64-1.67(m,1H,CH),1.69-1.72(m,1H,CH),1.75-1.85(m,4H,2CH₂),2.01-2.07(m,2H,CH₂),2.12-2.23(m,2H,2CH),2.33-2.38(dt,1H,J₁＝4.3Hz,J₂＝13.5Hz,8-CH_b),3.23-3.25(m,2H,14a-CH,14b-CH),6.01(s,1H,13-CH),7.43-7.45(dd,1H,J₁＝4.2Hz,J₂＝8.4Hz,5’-PhH),8.06(s,1H,12-CH),8.41-8.43(dd,1H,J₁＝1.4Hz,J₂＝8.4Hz,4’-PhH),8.66-8.67(dd,1H,J₁＝1.2Hz,J₂＝4.4Hz,6’-PhH).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:18.26,21.58,21.66,22.86,23.01,24.86,26.68,27.00,28.22,30.60,31.74,31.97,32.68,33.10,34.18,35.43,42.30,42.60,45.04,46.08,47.69,47.76,49.60,114.38,114.63,120.86,123.93,135.07,140.72,151.61,165.65,168.91,173.65,195.55,198.09.MS(ESI):610.361(M+H)⁺,632.333(M+Na)⁺.

实施例16

抗细胞坏死活性试验

对本发明实施例1～15制备的三萜类衍生物进行了抗细胞坏死活性试验，主要采取的方法为CellTiter Glo试剂盒检测法。

受测细胞选用L-929(小鼠成纤维细胞)和HT-29(人结肠癌细胞)。培养基为DMEM+10％FBS+1％双抗，细胞培养条件是36.5±0.5℃，5％二氧化碳。

本发明实施例1～15制备的三萜类衍生物抗坏死诱导和细胞活力测定，将本发明实施例1～15制备的三萜类衍生物用DMSO(Merck)溶解并配制成50mM的溶液，然后用DMSO将上述溶液稀释到待测浓度，一般采取三倍稀释。将待测细胞用z-VAD-fmk(20μM)和Smac模拟物(10μM)或环己酰亚胺(5μg/mL)预处理30分钟，然后用TNF-α(20ng/mL)预处理12或10分钟，可以诱导细胞程序性坏死，在16～24h内对细胞进行检测。TNF-α(20ng/mL)和Smac模拟物(10nM)可诱导细胞凋亡，在24h后对细胞进行检测。将本发明实施例1～15制备的三萜类衍生物均先制备成1mM的母液，之后稀释100倍至10μM，作为初始浓度，之后按3倍梯度稀释，即10μM、3.3μM、1.1μM、0.37μM、0.12μM、0.04μM。将稀释好的化合物添加于上述组合之一，并孵育细胞16小时或24小时，使用CellTiter-Glo细胞活力试剂盒检查细胞活力。

试验结果见表1，其中，样品是指相应实施例中制备的三萜类衍生物。

表1.三萜类衍生物的抗细胞坏死活性

以上实验结果表明，本发明实施例1～15制备的三萜类衍生物具有良好抗细胞坏死活性，均在微摩尔水平。实施例12和实施例13具有优异的抗坏死活性，达到了纳摩尔水平。实施例12化合物活性相对于CDDO在HT-29细胞株中提高了5倍，在L-929细胞株中大于16倍；实施例13化合物在HT-29细胞株提高了4倍，在L-929细胞株中提高了至少11倍。因此，本发明实施例1～15制备的三萜类衍生物及其盐类可以用作程序性细胞坏死抑制剂，可用于制备程序性细胞坏死的药物。

实施例17

小鼠全身炎症反应综合征(SIRS)的保护活性，对本发明制备的三萜类衍生物进行了抗SIRS实验。

对于TNF-α诱导的SIRS，从常州卡文实验动物中心(中国江苏省)购入雌性C57BL/6小鼠(6-8周龄)，并在无病原体的环境中(温度：21-26℃，湿度：40-70％)养殖。

将实施例13制备的三萜类衍生物悬浮在0.5％的羧甲基纤维素钠溶液中，并加入3％吐温-80研磨，制备成乳剂。将过夜禁食的小鼠随机分为对照组和治疗组(每组n＝12)。在药物治疗组中，在TNF-α注射前2小时通过灌胃小鼠给予不同浓度的(10mg/Kg和20mg/Kg)实施例13制备的三萜类衍生物。在无内毒素的PBS中稀释鼠TNF-α，并以200μL体积进行静脉注射(给药浓度250μg/kg或400μg/kg)。在给鼠TNF-α前15分钟腹腔注射200μg Z-VAD-fmk，在给TNF-a后1小时腹腔注射75μg Z-VAD-fmk，用电子温度计监测体温。

图1为实施例13制备的化合物对注射TNF-α的小鼠总体生存率和体温的影响示意图，其中，A为小鼠总体生存率统计示意图，B为小鼠体温记录示意图。从图A中可以看出，不给实施例13制备的化合物的组(Vehicle)小鼠在20小时内全部死亡，给予实施例13制备的化合物的组(10mg/Kg)小鼠在60小时仍有6只存活，给予实施例13制备的化合物的组(20mg/Kg)小鼠则全部存活。从图B中可以看出，对照组(Vehicle)的小鼠体温降低迅速，在20小时内记录到的最低体温在26℃以下，给药组的小鼠体温在出现一段时间的下降后又迅速地恢复至正常水平，说明实施例13制备的化合物扭转了TNF-a诱导的细胞坏死所导致的小鼠机能失调。以上实验说明实施例13制备的化合物具有良好的抗TNF-a诱导的细胞坏死作用。

实施例18

MCAO大鼠模型的建立：

对本发明实施例1～15制备的三萜类衍生物进行了MCAO大鼠模型试验。

从常州卡文实验动物中心(中国江苏省)购入体重180-220g的健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，并在无病原体的环境中(温度21-26℃，湿度40-70％)饲养。用10％水合氯醛(300mg/kg，腹腔内)麻醉大鼠，将单丝尼龙缝合线***颈内动脉(ICA)，然后推进以阻塞左大脑中动脉(MCA)。闭塞2小时后，小心地拆下线以实现24小时的再灌注。Shamoperated的小鼠接受相同的外科手术，除了动脉阻塞。

使用随机数表将所有大鼠随机分为以下六组：sham operated(sham)、I/R(vehicle)、I/R+RTA-402(实施例4制备的化合物，此处命名为RTA-402)(100mg/kg)、I/R+CDDO-3-P-Im(实施例13制备的化合物I-12，此处命名为CDDO-3-P-Im)(100mg/kg)and I/R+尼莫地平(1mg/kg)组。尼莫地平是中风的一线治疗方法，是一种作用于L型电压门控钙通道的药物，可引起血管平滑肌细胞的血管舒张(Daou,B.J.et al.,Clinical andexperimental aspects of aneurysmal subarachnoid hemorrhage.CNS Neurosci Ther,2019,25(10),1096-1112)。因此，尼莫地平(Nimodipine)被用作阳性对照。

神经功能缺损评分：使用Zea-Longa评分系统在再灌注24小时后评估神经功能缺损。参照文献方法进行操作(Bederson,J.B.et al.,Rat middle cerebral arteryocclusion:evaluation of the model and development of a neurologicexamination.Stroke 1986,17(3),472-476)。评分系统如下：0＝无神经功能受损迹象，活动正常；1＝无法完全伸展对侧前爪；2＝走路时向对面转圈；3＝转储到相反的一侧；4＝不能自发消失并失去知觉。

梗死体积评估：再灌注24小时后，每组六只动物进行颈脱位，处死后断头，取出大脑立即测量梗塞体积。将动物大脑切成2毫米厚的冠状切片5-6片，在4℃下浸入4％多聚甲醛4h后暴露于在TTC下进行染色。将未染色的区域定义为梗塞并使用显微镜图像分析软件(Image-Pro Plus)进行测量，计算脑梗塞的比例(脑梗塞比例＝梗塞面积/全脑面积×100％)。

HE染色：再灌注24小时后，将大鼠用10％水合氯醛麻醉，灌注生理盐水和4％多聚甲醛，处死后断头。取出大脑脱水并用石蜡包埋，急速冷冻后切成5μm的冠状切片。随后，对脑切片进行脱蜡和水合以进行HE染色。

试验结果见图2至图4所示。图2为MCAO大鼠脑梗死指标统计示意图，其中，A为神经功能评估示意图，B为大鼠脑梗死比例统计示意图。图3为MCAO大鼠大脑中脑梗死的代表性TTC染色图。图4为MCAO大鼠大脑中海马区和皮层的HE染色图：缺血性大脑皮层cortex(放大倍数：×200)，缺血性脑海马区CA3(放大倍数：×100)和缺血性脑海马区CA1(放大倍数：×200)。图2和图3中，在MCAO大鼠中，实施例4制备的化合物(100mg/kg)和实施例13制备的化合物(100mg/kg)具有防止I/R损伤的作用。

再灌注24小时后，首先检查了神经功能评分，以确定神经功能缺损。与I/R组相比，实施例4和实施例13两组的神经功能缺损评分显着降低(图2中A)。通过2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)染色测量脑缺血区域的梗塞体积，实施例4制备的化合物或实施例13制备的化合物的预处理可减少梗塞体积(图2中B和图3)。在100mg/kg的剂量下，实施例4制备的化合物的治疗将梗塞体积从36.8±3.2％降低至13.7±2.9％，远高于参考药物尼莫地平(26.8±1.7％)的作用。与尼莫地平相比，实施例13制备的化合物可将梗死面积减少至22.8±3.7％。

在再灌注后24小时，通过HE染色对来自缺血海马体和皮质的切片进一步确定了实施例4制备的化合物和实施例13制备的化合物对其保护作用。I/R组细胞减少，排列不规则，观察到核***症。相反，实施例4制备的化合物和实施例13制备的化合物预处理在一定程度上逆转了病理变化，表明本发明制备的三萜类衍生物可以保护大脑免受I/R损伤。缺血性大脑皮层cortex(放大倍数：×200)，缺血性脑海马区CA3(放大倍数：×100)和缺血性脑海马区CA1(放大倍数：×200)，每组n＝6。(与I/R组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。)

以上实验结果表明，本发明实施例1～15制备的三萜类衍生物具有防止大鼠I/R损伤的作用。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。