阅读说明：本技术 一种多菌种发酵椰蓉制备生物饲料的方法 (Method for preparing biological feed by fermenting desiccated coconut with multiple strains ) 是由 王学梅 张晓梦 王闫宇 吴军龙 白国松 刘晓烜 孙楠 陈应强 杨雨辉 张昌和 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物饲料技术领域,特别涉及一种多菌种发酵椰蓉制备生物饲料的方法。该方法包括：将椰蓉和豆粕的混合物作为发酵底物,采用酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌组成混合菌种进行有氧发酵2～5天,再添加植物乳杆菌对发酵底物进行厌氧发酵5～15天,通过两步固态发酵从而得到发酵椰蓉生物饲料。三种菌种的活菌数比例为(27～54):(1.9～5.7):36。本发明发酵饲料具有发酵香味,因此能提高畜禽的采食量。通过微生物发酵技术开发海南当地特色的地源性饲料,另外海南属于热带地区,微生物种类繁多,气候适合微生物生长,代谢能力强,能在短时间内能把大量的地源性农业废弃物转化为有用的发酵饲料,从而减少生产开发成本。(The invention relates to the technical field of biological feed, in particular to a method for preparing biological feed by fermenting desiccated coconut with multiple strains. The method comprises the following steps: taking a mixture of the desiccated coconut and the bean pulp as a fermentation substrate, adopting saccharomyces cerevisiae and bacillus subtilis to form a mixed strain for aerobic fermentation for 2-5 days, adding lactobacillus plantarum to carry out anaerobic fermentation on the fermentation substrate for 5-15 days, and carrying out two-step solid state fermentation to obtain the fermented desiccated coconut biological feed. The ratio of viable count of the three strains is (27-54): 1.9-5.7): 36. The fermented feed has the fermented fragrance, so that the feed intake of livestock and poultry can be improved. The method is characterized in that the local characteristic ground source feed of Hainan is developed through a microbial fermentation technology, and Hainan belongs to tropical regions, so that the variety of microorganisms is various, the climate is suitable for the growth of the microorganisms, the metabolic capability is strong, a large amount of ground source agricultural wastes can be converted into useful fermented feed in a short time, and the production and development cost is reduced.)

一种多菌种发酵椰蓉制备生物饲料的方法

技术领域

本发明涉及生物饲料技术领域，特别涉及一种多菌种发酵椰蓉制备生物饲料的方法。

背景技术

近年来，精饲料资源缺少并且价格昂贵，丰富的粗饲料资源因未被合理应用到饲料中而被大量废弃或烧毁，饲料资源匮乏从而影响畜牧业发展。微生物发酵饲料产业的发展是解决饲料短缺的重要途径之一，同时也使得地源性资源开发成为研究的热点。地源性发酵饲料具有独特的营养价值和良好的饲料品质，通过合理的发酵可以降低成本，提高当地养殖场的经济效益和减少环境污染，开发地源性发酵饲料有助于实现生态循环和健康养殖。

海南椰子资源丰富，椰蓉作为海南特色的地源性资源大部分用在食品上，用在饲料上并未做深入研究。椰蓉含有很多活性物质，尤其是脂肪酸含量较高，有很大的饲料开发应用潜力和很高的经济价值，因此通过微生物发酵椰蓉生产畜禽饲料，有利于海南饲料资源开发利用。

目前，还未见有采用椰蓉制备生物饲料的技术。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种多菌种发酵椰蓉制备生物饲料的方法。该方法利用复合微生物通过两步固体发酵椰蓉制备一种新型的营养丰富、适口性好、活菌含量高的高品质生物饲料，从而减少饲料抗生素添加剂的使用和环境污染，使得动物性食品安全得到保障，为海南椰蓉资源开发利用提供一定的理论依据和实践基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种椰蓉饲料的制备方法，包括如下步骤：以椰蓉和豆粕的混合物为发酵底物，先采用酿酒酵母菌和枯草芽孢杆菌组成混合菌种对发酵底物进行有氧发酵2～5天，然后再加入植物乳杆菌进行厌氧发酵5～15天，通过两步固态发酵得到发酵椰蓉生物饲料；

所述酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌的体积比例为(27～54):(1.9～5.7):36。

作为优选，有氧发酵3天，所述厌氧发酵10天。

作为优选，酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌的体积比例为54:3.8:36。

作为优选，酿酒酵母菌的菌液浓度为2.7×10⁸CFU/mL，枯草芽孢杆菌的菌液浓度为1.9×10⁷CFU/mL，植物乳杆菌的菌液浓度为3.6×10⁸CFU/mL。

作为优选，以质量百分含量计，酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌在发酵底物中的添加量为6％～10％。

优选地，以质量百分含量计，酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌在发酵底物中的添加量为10％。

作为优选，以质量百分含量计，有氧发酵的含水量为36％～40％。

优选地，以质量百分含量计，所述有氧发酵的含水量为36％。

作为优选，发酵底物中椰蓉(新鲜样本)与豆粕的质量比为(1～2)：(1～2)。

优选地，发酵底物中椰蓉(新鲜样本)与豆粕的质量比为1：1。

作为优选，酿酒酵母菌为活化后的酿酒酵母菌，酿酒酵母菌的活化方法为：将酿酒酵母菌接种到YPD液体培养基中，在30℃条件下培养8～12小时后，再次接种到YPD液体培养基中，在30℃、150r/min的条件下培养12～16小时。

作为优选，枯草芽孢杆菌为活化后的枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌的活化方法为：将枯草芽孢杆菌接种到LB液体培养基中，在37℃条件下培养8～12小时后，再次接种到LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养12～16小时。

作为优选，植物乳杆菌为活化后的植物乳杆菌，植物乳杆菌的活化方法为：将植乳乳杆菌置于MRS肉汤中，在37℃条件下厌氧培养8～12小时后，再次接种到MRS肉汤中，在37℃条件下厌氧过夜培养12～16小时。

本发明还提供了由上述方法制得的椰蓉饲料。

本发明提供了一种多菌种发酵椰蓉制备生物饲料的方法及椰蓉饲料。该方法包括如下步骤：将椰蓉和豆粕的混合物作为发酵底物，采用酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌复合菌种进行有氧发酵2～5天，再添加植物乳杆菌对发酵底物进行厌氧发酵5～15天，从而得到椰蓉发酵饲料。三种菌的活菌数比例为(27～54):(1.9～5.7):36。开发海南当地源性资源发酵饲料具有如下优势：

①由于发酵饲料具有良好的发酵香味，因此能提高畜禽的采食量。

②通过发酵技术开发利用海南当地特色的地源性饲料，海南属于热带地区，微生物种类繁多，气候适合微生物生长，代谢能力强，能在短时间内能把大量的农业废弃物等地源性资源转化为优质发酵饲料，从而减少生产开发成本。

③受限的条件少，海南具有得天独厚的自然环境，发酵饲料产出效率高。饲料生产不需要占用很大空间。发酵过程中产生大量的有益微生物及代谢产物和消化酶，有利于调节机体肠道的微生态平衡，提高动物机体对营养物质的消化、吸收和利用。

④有效利用当地的农业废弃物资源，减少浪费和对环境的污染，降低生产成本，是目前有发展潜力又受养殖户欢迎的生态健康型饲料。

附图说明

图1示菌株3镜检图(10×100)；

图2示菌株3的PCR图；M﹕DL2000 DNA Marker；3﹕菌株3；

图3示菌株3的系统进化树；

图4示菌株16的镜检图(10×100)；

图5示菌株16的PCR图；M﹕DL2000 DNA Marker；16﹕菌株16；

图6示菌株16的系统进化树；

图7示菌种添加量和水分含量交互作用对粗蛋白影响的响应面(7-1)和等高线(7-2)；

图8示菌种添加量和菌种比交互作用对粗蛋白影响的响应面(8-1)和等高线(8-2)；

图9示水分含量和菌种比交互作用对粗蛋白影响的响应面(9-1)和等高线(9-2)；

图10示菌种添加量和水分含量交互作用对粗脂肪影响的响应面(10-1)和等高线(10-2)；

图11示菌种添加量和菌种比交互作用对粗脂肪影响的响应面(11-1)和等高线(11-2)；

图12示水分含量和菌种比交互作用对粗脂肪影响的响应面(12-1)和等高线(12-2)；

图13示椰蓉发酵工艺流程。

具体实施方式

本发明公开了一种多菌种发酵椰蓉制备生物饲料的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本研究通过以自然发酵椰蓉作为分离源，分离筛选生产动物饲料所需菌种并进行分子生物学及生理生化实验鉴定，得到国家农业部允许使用的微生物添加剂菌种即酿酒酵母和植物乳杆菌。采用两步发酵以椰蓉和豆粕为底料，酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌为菌种通过两步发酵制备发酵饲料，利用响应面法进行发酵椰蓉饲料工艺流程及发酵条件的优化，并得到最佳的发酵工艺，为今后椰蓉的开发利用奠定基础。

椰蓉中饲用发酵微生物的筛选：利用YPD培养基和MRS培养基从发酵的椰蓉中分离筛选纯化及生理生化鉴定得到两株发酵菌，分别命名为菌株3和菌株16。菌株3在YPD琼脂培养基上菌落形态为圆形，乳白色，不透明，表面光滑且粘稠和有发酵的香气，从形态学上初步判定为酵母菌，经美蓝染色为蓝色，能利用葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖，不能利用木糖、乳糖、山梨醇、核糖、***糖，氮源同化实验和无维生素培养实验呈阴性，经过26S rDNA基因序列比对和同源性分析得知：菌株3为酿酒酵母。菌株16在添加碳酸钙的MRS琼脂培养基上呈乳白色、不透明、圆形光滑并且具有溶钙圈的单个菌落，从形态学上初步判定为乳酸菌，革兰氏染色为阳性，能乳糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、水杨苷、麦芽糖、棉子糖、纤维二糖、七叶苷，明胶液化、接触酶实验为阴性，经过16S rDNA基因序列比对和同源性分析得知：菌株16为植物乳杆菌。所获得的菌种属于国家农业部允许使用的微生物饲料添加剂菌种。

利用响应面法对复合菌种发酵椰蓉饲料的工艺进行优化研究，以含水量、菌种添加量、菌种比为影响为主要因素。发酵工艺参数：含水量为36％、38％、40％，菌种添加量为6％、8％、10％，菌种比为酵母菌﹕枯草芽孢杆菌﹕植物乳杆菌＝54﹕3.8﹕36、酵母菌﹕枯草芽孢杆菌﹕植物乳杆菌＝54﹕5.7﹕36、酵母菌﹕枯草芽孢杆菌﹕植物乳杆菌＝27﹕1.9﹕36，有氧发酵3天、5天，厌氧发酵5天、10天、15天。考虑到不同的条件之间的互作影响。选取粗蛋白和粗脂肪作为响应值，以及不同指标测定的最大化对应的条件差异。选取最佳优化发酵条件为有氧发酵3天、厌氧发酵10天，菌种添加量10％、水分含量为36％、菌种比为酵母菌﹕芽孢杆菌﹕植物乳杆菌＝54:3.8:36。该条件下得到发酵饲料粗蛋白含量35.25％，粗脂肪含量31.56％。响应面模型所得的优化椰蓉发酵饲料工艺参数准确可靠，具有良好的实际生产与应用。

在本发明中，采用购买的酿酒酵母菌、植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌按照上述方法发酵椰蓉能够达到相近的发酵效果。

本发明提供的多菌种发酵椰蓉制备生物饲料的方法中所用原料、菌种、培养基、试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1椰蓉中酵母菌、乳酸菌的分离、筛选及鉴定

1.样品处理

将椰蓉置于一个灭过菌的瓶中，进行有氧发酵3天。取样进行菌种的筛选。

2.菌种的分离纯化及鉴定

(1)酵母菌的分离纯化及鉴定

挑取一些发酵中的椰蓉放入装有YPD液体培养基装入5mL的EP管中培养24h后，取样稀释梯度涂布到YPD固体培养基，在28℃恒温培养箱培养2d，直至长出乳白色菌落，挑取具有典型酵母菌落特征的菌落，经镜检为纯种后进行2-3代的传代纯化培养。根据《酵母菌的特征与鉴定手册》，初步判定为酵母菌。用接种环接入YPD液体培养基，以备进行下一步的实验。

(2)乳酸菌的分离纯化及鉴定

取一些发酵椰蓉放入装有MRS肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱中厌氧培养，增殖培养24h。取增值后的MRS肉汤进行梯度稀释后，并转涂到添加碳酸钙的MRS固体培养基平板上，在37℃恒温培养箱中厌氧培养48h后，培养基上培养产生碳酸钙溶解圈，挑取疑似单菌落于干净的载玻片上，然后在其上加一滴3％H₂O₂。若有气泡产生则为阳性反应，无气泡为阴性反应。去掉阳性反应的菌株，将阴性反应的菌株经革兰氏染色为革兰氏阳性菌后，进行2-3代的传代纯化培养。用接种环转接入MRS液体培养基以备进行下一步的实验。

3.菌种的DNA提取及PCR鉴定

(1)酵母菌的DNA提取及PCR鉴定

取YPD液体培养纯化的菌液在离心机中13000r/min离心1min，弃掉上清收集菌体。并根据酵母基因组DNA提取试剂盒说明书方法提取DNA。将所提取到的基因组DNA收集，编号，放于-20℃冰柜保藏好备用。引物序列信息见表1；酵母菌26SrDNA PCR扩增体系见表2。

表1酵母菌的引物序列

表2酵母菌26SrDNA PCR反应体系(25μL)

调整好反应程序，将上述混合液混匀、离心，放置到PCR仪上，进行扩增。扩增循环程序为﹕95℃，5min；95℃，1min，51℃，1min；72℃，1min，共30个循环；72℃，10min。反应结束后，所得产物用2％琼脂糖凝胶电泳，并作空白对照，在凝胶成像系统中检测。

(2)乳酸菌的DNA提取及PCR鉴定

将1mL培养好的细菌悬液置于1.5mL离心管中，12000r/min离心2min，用PBS洗涤菌体2-3次，再10000r/min离心2分钟后弃去上清液。加500μLTE缓冲液吹打，取100μL于200μLPCR管中，10000r/min离心2min，弃去上清液。加100μL TE缓冲液吹打。微波炉(800W)预热2min后将PCR管用微波炉加热40-150s；5000r/min离心2min收集上清液即为DNA。引物序列信息见表3，乳酸菌16S rDNA PCR扩增体系见表4。

表3乳酸菌的引物序列

表4乳酸菌16S rDNA PCR反应体系(25μL)

循环参数如下﹕94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后72℃末端延伸10min。反应结束后，所得产物用2％琼脂糖凝胶电泳，并作空白对照，在凝胶成像系统中检测。

4.测序及序列分析：使用Blast在线软件进行相似性分析，测序结果查询GenBank数据库，使用MEGA5.0软件创建系统进化树。

5.保种：将获得的酵母菌和乳酸菌菌株进行甘油保种保存，置于-80℃保存样品。

6.生化实验

(1)酵母菌的生理生化鉴定

①酵母菌的糖酵解

将菌株接种于YEPD琼脂培养基上，并于28℃的恒温培养箱中活化24h，通过用接种环挑取单个菌落穿刺入细菌微量生化反应管，用灭菌密封膜密封后，在28℃的恒温培养箱中培养48h，记录结果。

②氮源同化

测试的氮源为硝酸钾，该实验主要考察酵母菌在以硝酸钾为唯一氮源的生长情况，向碳源基础培养基中加入硝酸钾，加入量达到50mmol/L，空白对照为不加测试氮源的碳源基础培养基，每天观察培养皿中是否有菌落生长。

③无维生素培养基中的生长

用接种环将活化的菌液划线接种于维生素平板培养基，做三个平行实验，用酵母完全培养基接菌作为对照，在28℃恒温培箱中静置培养48h，每天观察培养基是否有菌落生长。

(2)乳酸菌的生理生化鉴定

①乳酸菌的糖酵解

将菌株接种在MRS琼脂培养基上，并在37℃恒温培养箱中静置厌氧活化48h，通过用接种环挑取单个菌落穿刺入乳酸菌成套生化鉴定管，用灭菌密封膜密封后，在37℃恒温培养箱中培养48h，记录结果。

②明胶液化

将活化好菌株接种到明胶培养基中，空白对照为不接菌株。将实验组于37℃培养箱中培养观察，并记录结果。将实验组和对照组放入冰箱中，待对照组凝固时，观察现象。若明胶凝块全部或全部在20℃以下变为可流动的液体，则为阳性；若明胶表明无凹陷，且为稳定的凝块，则为阴性，分别记为“+”和“-”。

7.结果

(1)酵母菌分离筛选及鉴定

从发酵的椰蓉中经过多次分离纯化，再通过对菌株的观察和镜检，得到一株酵母，命名为3。菌株3在YPD琼脂培养基上菌落形态为圆形，乳白色，不透明，表面光滑且粘稠和有发酵的香气，美蓝染色为蓝色，见镜检图(见图1)。根据《酵母菌的特征与鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》提供的生理生化实验方法，进行了糖类发酵试验、氮源同化试验、无维生素培养试验。实验结果表明﹕菌株3能利用葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖，不能利用木糖、乳糖、山梨醇、核糖、***糖，氮源同化实验和无维生素培养实验呈阴性(见表5)。

表5酵母菌的生理生化鉴定

注﹕-表示反应呈阴性；+表示反应呈阳性

通过对菌株3进行酵母菌基因组DNA的提取和26SrDNAD1/D2区域的PCR扩增，凝胶成像系统下显示的图像见(图2)，测序结果显示扩增出的序列长为625bp。

根据序列PCR扩增的测序结果，在NCBI网站上进行BLAST比对，选取与菌株3同源性较高的菌株的基因序列构建系统进化树(见图3)。结合形态特征和生理生化特性，将菌株3鉴定为酿酒酵母菌。

(2)乳酸菌的分离筛选及鉴定

从发酵的椰蓉中经过多次的分离纯化，再通过对菌株的观察和镜检得到一株乳酸菌，命名为菌株16，菌株16在添加碳酸钙的MRS琼脂培养基上呈乳白色、不透明、圆形光滑并且具有溶钙圈的单个菌落。革兰氏染色为阳性，镜检为短杆状(见图4)。

生理生化实验表明(见表6)，菌株16能利用乳糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、水杨苷、麦芽糖、棉子糖、纤维二糖、七叶苷，明胶液化、接触酶实验为阴性。根据《乳酸细菌分类及实验方法》和《常见细菌系统鉴定手册》，初步鉴定菌株16为乳酸菌属。

表6乳酸菌的生理生化鉴定

注﹕-表示反应呈阴性；+表示反应呈阳性

菌株16基因组DNA 16SrDNA的PCR扩增产物电泳，凝胶成像系统下显示的图像见(图5)，测序结果显示扩增出的16SrDNA序列长为1500bp。

根据16rDNA序列PCR扩增测序结果，在NCBI网站上进行BLAST比对，选取与菌株16同源性较高的菌株的基因序列构建系统进化树(见图6)。结合形态特征和生理生化特性，将菌株16鉴定为植物乳杆菌。

实施例2椰蓉饲料发酵工艺

采用实施例1获得的酿酒酵母、植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌一起发酵椰蓉和豆粕，具体步骤如下：

1.菌种活化

将保种的酿酒酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌进行活化。将酿酒酵母接种到YPD液体培养基中，置于30℃培养箱中过夜培养后，再次接种到YPD液体培养基中放入30℃、150r/min的摇床中培养，并测定活菌数。将植乳乳杆菌置于MRS肉汤中，置于37℃培养箱中厌氧过夜培养后，再次接种到MRS肉汤中37℃厌氧过夜培养，并测定活菌数。将枯草芽孢杆菌接种到LB液体培养基中，置于37℃培养箱中过夜培养后，再次接种到LB液体培养基中放入37℃、150r/min的摇床中培养，并测定活菌数。

结果显示，酿酒酵母菌的菌液浓度为2.7×10⁸CFU/mL，枯草芽孢杆菌的菌液浓度为1.9×10⁷CFU/mL，植物乳杆菌的菌液浓度为3.6×10⁸CFU/mL。

2.椰蓉发酵工艺

发酵底物：椰蓉、豆粕(质量比1:1)；

菌种添加量为10％；

水分含量为36％；

酿酒酵母﹕枯草芽孢杆菌﹕植物乳杆菌的菌种体积比为54:3.8:36。

整个发酵过程为：先添加酿酒酵母和枯草芽孢杆菌有氧发酵3天，再添加植物乳杆菌厌氧发酵10天。

实施例3椰蓉饲料发酵工艺

采用实施例1获得的酿酒酵母、植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌一起发酵椰蓉和豆粕，具体步骤如下：

2.菌种活化

将保种的酿酒酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌进行活化。将酿酒酵母接种到YPD液体培养基中，置于30℃培养箱中过夜培养后，再次接种到YPD液体培养基中放入30℃、150r/min的摇床中培养，并测定活菌数。将植乳乳杆菌置于MRS肉汤中，置于37℃培养箱中厌氧过夜培养后，再次接种到MRS肉汤中37℃厌氧过夜培养，并测定活菌数。将枯草芽孢杆菌接种到LB液体培养基中，置于37℃培养箱中过夜培养后，再次接种到LB液体培养基中放入37℃、150r/min的摇床中培养，并测定活菌数。

结果显示，酿酒酵母菌的菌液浓度为2.7×10⁸CFU/mL，枯草芽孢杆菌的菌液浓度为1.9×10⁷CFU/mL，植物乳杆菌的菌液浓度为3.6×10⁸CFU/mL。

3.椰蓉发酵工艺

发酵底物：椰蓉、豆粕(质量比1:1)；

菌种添加量为8％；

水分含量为40％；

酿酒酵母﹕枯草芽孢杆菌﹕植物乳杆菌的菌种体积比为54:5.7:36；

整个发酵过程为：先添加酿酒酵母和枯草芽孢杆菌有氧发酵3天，再添加植物乳杆菌厌氧发酵10天。

试验例1椰蓉饲料发酵工艺比较

1.Box-Behnken试验设计

采用Design Exper8.0软件进行中心组合设计(Box-Behnken Design)对微生物发酵椰蓉的影响显著因子进行优化，结合因素效应和试验中的实际情况。并进行结果分析，得到二次回归方程。各因素及水平见表7，BBD试验设计见表8。菌种比例为酿酒酵母﹕枯草芽孢杆菌﹕植物乳杆菌。

表7 BBD试验设计因素水平

表8 BBD试验设计

试验号	A	B	C
				1	10	36	54﹕3.8﹕36
2	6	38	27﹕1.9﹕36
				3	8	36	27﹕1.9﹕36
4	8	36	54﹕5.7﹕36
				5	8	38	54﹕3.8﹕36
6	6	36	54﹕3.8﹕36
				7	8	38	54﹕3.8﹕36
8	10	40	54﹕3.8﹕36
				9	10	38	27﹕1.9﹕36
10	8	38	54﹕3.8﹕36
				11	8	40	27﹕1.9﹕36
12	6	38	54﹕5.7﹕36
				13	8	40	54﹕5.7﹕36
14	8	38	54﹕3.8﹕36
				15	6	40	54﹕3.8﹕36
16	8	38	54﹕3.8﹕36
				17	10	38	54﹕5.7﹕36

2.发酵试验设计

通过BBD试验设计出17个处理，进行分步发酵。椰蓉和豆粕的比例为1﹕1，每个处理设置三个重复，两个平行。先添加酿酒酵母和枯草芽孢杆菌进行耗氧发酵，再添加植乳乳杆菌进行厌氧发酵，每两个小时翻动饲料，利于充分发酵，见表9。

表9发酵条件试验设计

发酵条件	发酵时间(天)	菌种添加
			有氧发酵	3、5	酿酒酵母，枯草芽孢杆菌
厌氧发酵	5、10、15	植乳乳杆菌

3.测定方法

饲料常规养分测定：参照张丽英主编的《饲料分析及饲料质量检测技术》(第3版)(张丽英，2007)。主要测定指标有粗蛋白(CP)采用凯氏定氮法进行测定、粗灰分(CA)采用灰化法进行测定、粗脂肪(EE)采用粗脂肪测定仪测定、水分及干物质(DM)采用烘箱干燥测定。

表10椰蓉发酵饲料感官评定标准

活菌数测定：在装有225ml生理盐水灭过菌的锥形瓶中放入25g发酵饲料。在室温下，将锥形瓶放到摇床中160rpm，30min摇匀。进行适当的梯度稀释，保存。做进行酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌，细菌总数的菌落计数。

pH测定：在装有90ml的无菌水的锥形瓶中放入10g的发酵饲料样品，搅拌均匀，置于冰箱冷藏过夜，用pH计测定溶液的pH。

4.数据分析

试验数据首先采用Excel 2010进行初步整理，利用SAS软件进行单因素方差分析，结果用平均值±标准差表示，以p<0.05差异显著性判断标准。

5.结果

(1)原料的营养成分分析及pH：

表11椰蓉与豆粕常规养分分析及pH

组分(％)	椰蓉/％	豆粕/％	原料混合/％
				粗蛋白	6.01	42.62	24.83
粗脂肪	57.1	1.9	33.76
				粗灰分	1.34	5.77	4.29
水分	34.87	8.72	24.95
				干物质	65.13	91.28	75.05
pH	4.47	5.9	5.34
				粗纤维	15	5.83	-
中性洗涤纤维	22.38	14.24	-
				酸性洗涤纤维	12.96	10.12	-
总能(MJ/kg)	28.88	-	-

注：-表示未检测

(2)椰蓉和豆粕的脂肪酸检测

表12椰蓉和豆粕的脂肪酸分析

注：-表示未检测

(3)发酵饲料的品质评定

①感官评定

由表13可知，通过视觉、嗅觉、触觉等感官指标对椰蓉发酵饲料进行饲料检验，根据发酵椰蓉感官评分筛选出1号(菌种添加量为10％、水分含量为36％、菌种比为54:3.8:36)和13号(菌种添加量为8％、水分含量为40％、菌种比为54﹕5.7﹕36)为最优。考虑到实际生产成本和实际应用，确定整个发酵过程为有氧发酵3天，厌氧发酵10天。

表13感官评定的结果

②常规养分及pH值

表14有氧发酵3天椰蓉发酵饲料常规养分及pH

注﹕同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，字母相同或无字母标注表示差异不显著(p>0.05)。

表15厌氧发酵10天椰蓉发酵饲料常规养分及pH

注﹕同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，字母相同或无字母标注表示差异不显著(p>0.05)。

表16有氧发酵3天活菌数

注﹕同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，字母相同或无字母标注表示差异不显著(p>0.05)。

表17厌氧发酵10天活菌数

注﹕同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，字母相同或无字母标注表示差异不显著(p>0.05)。

(4)卫生指标

表18沙门氏菌和大肠杆菌的检测结果

注﹕-表示未检测出

表19黄曲霉毒素B₁酶联免疫检测结果

由表18、19可知，在整个发酵过程中，饲料卫生指标中未检测出沙门氏菌和大肠杆菌。国家关于豆粕黄曲霉毒素B1的含量最高限量为30μg/kg，本试验中检测黄曲霉毒素均未超标。

(5)响应面试验设计结果

①椰蓉发酵饲料粗蛋白和粗脂肪的Box-Behnken结果

表20BBD试验设计及结果

②粗蛋白二元回归方程的方差分析结果

表21粗蛋白二元回归方程的各项方差分析结果

注﹕*为显著，**为极显著

表22粗蛋白方差分析结果

参数	数值	参数	数值
				标准差	1.42	复相关系数	0.9025
均值	31.41	校正相关系数	0.7773
				变异系数	4.53	预测相关系数	-0.2986
预测残差平方	188.52	信噪比	8.651

经回归拟合后，得到以粗蛋白(Y1)为响应值的回归方程为

Y1＝33.12+0.28×A-1.40×B-0.55×C-0.95×A×B-3.91×A×C-1.54×B×C-2.83×A^2+0.021×B^2-0.82×C^2

由表21，22可知模型的p值小于0.05，表明该模型二次方显著，失拟项不显著(p＝0.0550)。表明了模型中并没有异常数据，从表中回归方程复相关系数为0.9025，校正相关系数为0.7773，变异系数为4.53％，信噪比为8.651，说明该回归方程拟合程度良好。各因素对粗蛋白影响大小顺序﹕水分含量>菌种比>菌种添加量。通过对回归方程的方差分析得出﹕一次项B显著(p<0.05)，A、C不显著(p>0.05)，二次项A²显著(p<0.05)，B²、C²不显著(p>0.05)，交互项AC极显著(p<0.01)，AB、BC不显著(p>0.05)，说明该回归方程能够很好地描述各因素与响应值之间的真实关系。

③椰蓉发酵饲料的粗蛋白最优条件确定和模型验证

由图7可知，当菌种比为代码0时，随着菌种添加量的增加，粗蛋白先升高后有所降低，随着水分含量的增加，粗蛋白出现变化小幅度的降低，基本保持稳定。

由图8可知，当水分含量为代码0的时候，随着菌种比的增加，粗蛋白也随之增加。随着菌种添加量的增加，粗蛋白随之增加。

由图9可知，当菌种添加量为代码0时，随着菌种比的增加，粗蛋白也增加。随着水分比例的增加，粗蛋白随之增加。

④粗脂肪二元回归方程的方差分析结果

表23粗脂肪二元回归方程的方差分析结果

注﹕*为显著，**为极显著

表24粗脂肪方差分析结果

参数	数值	参数	数值
				标准差	0.37	复相关系数	0.9245
均值	28.78	校正相关系数	0.8275
				变异系数	1.28	预测相关系数	0.2854
预测残差平方	8.94	信噪比	12.088

经回归拟合后，得到以粗脂肪(Y2)为响应值的回归方程为

Y2＝28.52+0.16×A-0.2×B-0.51×C-0.44×A×B+0.37×A×C-1.00×B×C+0.32×A^2+0.72×B^2-0.49×C^2

由表23，24可知模型的p值小于0.01，表明该模型二次方极显著，失拟项不显著(p＝0.3200)，表明了模型中并没有异常数据，从表中回归方程复相关系数为0.9245，校正相关系数为0.8275，变异系数为1.28％，信噪比为12.088，说明该回归方程拟合程度良好。各因素对粗脂肪的影响大小顺序：菌种比>水分含量>菌种添加量。通过对回归方程的方差分析得出﹕一次项C极显著(p<0.01)，A、B不显著，二次项B²极显著(p<0.01)，C²显著(p<0.05)，A²不显著(p>0.05)，交互项BC、AB显著(p<0.05)，AC不显著(p>0.05)，说明该回归方程能很好地描述各因素与响应值之间的真实关系。

⑤椰蓉发酵饲料的粗脂肪最优条件确定和模型验证

由图10可知，当菌种比为代码0时，粗脂肪随着水分含量的增加出现先小幅度降低后增加，粗脂肪随着菌种添加量的增加而增加，等高线图为椭圆，说明菌种添加量和水分含量互作显著。

由图11可知，当水分含量为代码0时，粗脂肪随着菌种比例的升高而降低。随着菌种添加量的增加，粗脂肪减少趋势平缓不明显，有小幅度的减少。

由图12可知，当菌种添加量为代码0时，随着菌种比的增加，粗脂肪也随之增加。随着水分比例的升高，粗脂肪也随着升高。

根据软件Design-Expert对椰蓉发酵饲料中的粗蛋白和粗脂肪的模型计算，将两个响应值的重要性设定为同等重要，选取模型中最优发酵条件，得出最佳菌种添加量为代码0.69，水分比例为代码-1，菌种比例为代码0.08，在此条件下粗蛋白为33.90％，粗脂肪为30.10％。

为检验响应面方法所得结果的可靠性，采用上述优化发酵条件进行椰蓉发酵饲料，并考虑实际生产应用的不同条件下能耗的问题，将发酵工艺修正为﹕菌种添加量为10％，水分含量为36％，菌种比为酵母菌﹕枯草芽孢杆菌﹕植物乳杆菌为54:3.8:36，即实施例2发酵工艺，在此条件下重复3次，实际测得粗蛋白为35.25％，粗脂肪为31.56％，因此，响应面模型所得的优化椰蓉发酵饲料工艺参数准确可靠，具有较好的生产与应用。

上述方案流程图见图13。

实施例4

采用购买的酿酒酵母菌BNCC336054(北纳生物公司)、植物乳杆菌BNCC192567(北纳生物公司)与枯草芽孢杆菌BNCC223658(北纳生物公司)一起发酵椰蓉，工艺同实施例2，由以下实验结果可知采用购买的菌种同样能够达到相近的发酵效果。

酿酒酵母菌的菌液浓度为1.3×10⁸CFU/mL，枯草芽孢杆菌的菌液浓度为1.6×10⁷CFU/mL，植物乳杆菌的菌液浓度为2.2×10⁸CFU/mL。

4.椰蓉发酵工艺

发酵底物：椰蓉、豆粕(质量比1:1，椰蓉为新鲜样品)；

菌种添加量为10％；

水分含量为36％；

酿酒酵母﹕枯草芽孢杆菌﹕植物乳杆菌的菌种体积比为54:3.8:36。

整个发酵过程为：先添加酿酒酵母和枯草芽孢杆菌组成混合菌种有氧发酵3天，再添加植物乳杆菌厌氧发酵10天。

结果显示，上述发酵方法得到的发酵产物所测得粗蛋白为34.62％；粗脂肪为30.16％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。