一种石首鱼开口饵料强化试剂配方及强化方法
阅读说明：本技术 一种石首鱼开口饵料强化试剂配方及强化方法 (Formula and strengthening method of rock-head fish initial feed strengthening reagent ) 是由 谭朋 徐冬冬 陈睿毅 王立改 于 2020-05-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种石首鱼开口饵料强化试剂配方及强化方法,属于海产动物苗种培育技术领域,该强化试剂的制备方法包括：以乳化型大豆分离蛋白和预糊化淀粉制备壁材；以鱼油、羟基化卵磷脂和生育酚制备芯材；然后在4-乙基-2-甲氧基苯酚和酸式磷酸铝钠存在的条件下,将壁材和芯材进行分级均质,得到水乳化型微胶囊试剂；上述微胶囊试剂还包括罗望子胶和α-淀粉酶形成的包衣层。上述方法能抑制试剂中脂质过氧化物含量增长,降低氧化脂肪对开口饵料的毒害作用,提升强化期轮虫/卤虫的密度,能将仔鱼开口率提高到93％以上,提高摄食率和鱼苗成活率。上述强化方法为：在开口饵料投喂前用包括上述方法制得的强化试剂的强化液进行强化操作。(The invention discloses a formula and a strengthening method of a chub initial feed strengthening reagent, belonging to the technical field of marine animal fry breeding, wherein the preparation method of the strengthening reagent comprises the following steps: preparing a wall material by using emulsified soybean protein isolate and pregelatinized starch; preparing a core material by using fish oil, hydroxylated lecithin and tocopherol; then, carrying out grading homogenization on the wall material and the core material in the presence of 4-ethyl-2-methoxyphenol and sodium aluminum acid phosphate to obtain a water-emulsified microcapsule reagent; the microcapsule reagent also comprises a coating layer formed by tamarind gum and alpha-amylase. The method can inhibit the increase of lipid peroxide content in the reagent, reduce the toxic action of oxidized fat on the initial feed, improve the density of rotifer/artemia in the strengthening period, improve the initial feeding rate of the fry to more than 93 percent, and improve the ingestion rate and the survival rate of the fry. The strengthening method comprises the following steps: before the feeding of the initial bait, the strengthening operation is carried out by using the strengthening liquid of the strengthening reagent prepared by the method.)
技术领域
本发明属于海产动物苗种培育技术领域，具体涉及一种石首鱼开口饵料强化试剂配方及强化方法。
背景技术
石首鱼(Drum)是鲈形目(Perciformes)石首鱼科(Sciaenidae)约160种鱼的统称。此鱼出水能叫，夜间发光，头中有像棋子的石头，所以叫石首鱼。石首鱼一般为底栖，肉食性，大部分分布暖海或热带沿海，少数生活于温带或淡水水域。
海水鱼在仔稚鱼阶段的开口饵料只能使用大小为200-300μm的微小动物轮虫以及接下来稍大的卤虫无节幼体(大小为300-500μm)。在人工育苗的过程中，仔鱼开口率低的问题一直非常严重，同时两种动物其营养价值太低，导致大批仔鱼因不能及时摄食或营养不足而死亡，育苗成活率很低。虽然富含亚麻酸和亚油酸，但卤虫、轮虫它们自身不能合成n-3系列高度不饱和脂肪酸(HUFA)，其体内的脂类含量以及n-3系列高度不饱和脂肪酸的组成与它们所摄食的饵料的HUFA组成、含量呈正相关关系。n-3系列高度不饱和脂肪酸对海水仔鱼、稚鱼的生长、发育、存活起着重要的作用，特别是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是最重要的n-3HUFA。但是仔、稚鱼同样不能自身合成这些必需脂肪酸，只能从饵料中摄取。
因此，在投喂之前必须对轮虫进行营养强化，以满足鱼类幼体所必须的营养要素，从而提高海水仔稚鱼的生长速度和成活率、降低仔稚鱼畸形发生率。目前，以强化为目的的饵料强化试剂种类很多，着重增加高不饱和脂肪酸，绝大部分强化试剂使用的是鱼油制品，因为这是已知多种油脂中唯一含有DHA的脂肪，而其中的DHA最初来源于海洋微藻，通过食物链逐级传递至鱼体内。这类鱼油制品多是制成含有多种不饱和脂肪酸和维生素的乳浊液，但这些乳浊液在贮存时，极易被氧化，乳浊液的粒径也不易控制，且容易在水面形成一层油膜，不仅起不到营养强化作用，还会影响轮虫质量，甚至导致轮虫窒息、死亡。因此，提供和开发新的开口饵料强化试剂和强化方法变得具有研究意义和经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能抑制试剂中脂质过氧化物含量增长，降低氧化脂肪对开口饵料的毒害作用，提升强化期轮虫/卤虫的密度，更能将石首鱼仔鱼的开口率从75％左右提高到93％以上，提高轮虫/卤虫的摄食率和鱼苗成活率的石首鱼开口饵料强化试剂的制备方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种石首鱼开口饵料强化试剂的制备方法，包括：以乳化型大豆分离蛋白和预糊化淀粉制备壁材；以鱼油、羟基化卵磷脂和生育酚制备芯材；然后在4-乙基-2-甲氧基苯酚和酸式磷酸铝钠存在的条件下，将上述壁材和芯材进行分级均质，得到水乳化型微胶囊试剂；
上述微胶囊试剂还包括罗望子胶和α-淀粉酶形成的包衣层，上述α-淀粉酶在包衣层中的含量为5-20wt％。
本发明用壁材和包衣层将与水不相容的芯材物质包覆形成水乳化型微胶囊，既能保护芯材中活性物质不被氧化变质以延长其有效储存期，还能增强其在水环境中的分散性，提高轮虫/卤虫的摄食率；该制备方法还能抑制储存期强化试剂中脂质过氧化物含量的增长，降低氧化脂肪对轮虫/卤虫的毒害作用，以提升强化期间轮虫/卤虫的密度，更能将石首鱼仔鱼的开口率从75％左右提高到93％以上，有利于鱼苗成活率的提升，显著增加经济效益。
对本发明而言，分级均质具体操作条件为：初次均质：压力为40-60Mpa，时间为30-60min；二次均质：转速为3500-5000rpm，时间为15-30min。
优选的，初次均质操作环境中，4-乙基-2-甲氧基苯酚和酸式磷酸铝钠的介入量分别为芯材重量的0.03-0.08％和0.05-0.1％。在机械能和壁材与芯材分子链间排斥力共同作用下，均质环境中存在的4-乙基-2-甲氧基苯酚和酸式磷酸铝钠协助体系中疏水基团和亲水基团进行重排，两者协同能与脂质形成水合作用，相互共用水合分子以降低芯材物质的受氧化程度，抑制了储存期强化试剂中脂质过氧化物含量增长，进而降低氧化脂肪对轮虫/卤虫的毒害作用，以提升强化期间轮虫/卤虫的密度。出乎意料的，两者还能进一步提高仔鱼的开口率，具体的能从75％左右提高到93％以上，虽然具体机理有待验证，但能显著提升鱼苗的成活率，有利于提升经济效益。
优选的，二次均质操作环境中，包衣层的添加量为壁材重量的10-35％，其中罗望子胶的含量为45-60wt％，余量为水。
更优选的，包衣层的预制步骤为：将罗望子胶和水混匀，然后在70-90℃下形成凝胶，待温度降至40℃以下后，再向其中添加α-淀粉酶并混匀。α-淀粉酶有助于生物体对淀粉的消化和吸收，既能提高饵料利用率，又能供能以促进生物体的生长。
对本发明而言，壁材的制备温度为35-45℃，混合时间为30-60min；芯材的制备搅拌速率为500-1000rpm，时间为30-60min。
对本发明而言，初次均质操作中，壁材和芯材的重量比为：3-5:1；上述壁材中乳化型大豆分离蛋白的含量为5-15wt％，预糊化淀粉的含量为15-40wt％，余量为水。
对本发明而言，芯材中鱼油、羟基化卵磷脂和生育酚的重量比为2.5-7.5:1-2:0.5。
本发明的目的还在于提供一种由上述制备方法制得的石首鱼开口饵料强化试剂。该强化试剂的粒径为20-300μm，适合卤虫/轮虫摄食；通过加速贮藏试验，在360d的储存期内未出现析油或分层现象，能用于饲喂卤虫和轮虫进行强化，也适用于做为鱼、虾、贝类和蟹类的人工配合饲料的添加剂。
为了达到提高石首鱼仔鱼的开口率、增加育苗成活量和成活率的目的，本发明还提供了一种石首鱼开口饵料的强化方法，上述开口饵料包括轮虫和卤虫无节幼体，包括：在开口饵料投喂前6-12h用强化液进行强化操作；上述强化液中包括上述制备方法制得的强化试剂。
对本发明而言，强化液中包括小球藻、强化试剂和海水，其中小球藻的浓度为 5×107-7×107cell/mL，强化试剂添加量为每50-150万卤虫/轮虫用0.3-1g。
对本发明而言，开口饵料强化时的初始密度为100-300Ind/mL；强化操作的水温为25-27℃，盐度为29-33‰，环境中溶解氧浓度不低于7ppm。
本发明由于采用了壁材和包衣层将与水不相容的芯材物质包覆形成水乳化型微胶囊试剂，因而具有如下有益效果：该强化试剂的制备方法能增强试剂在水环境中的分散性，能抑制储存期强化试剂中脂质过氧化物含量的增长，降低氧化脂肪对轮虫/卤虫的毒害作用，以提升强化期间轮虫/卤虫的密度；所制的强化试剂的粒径为20-300μm，通过加速贮藏试验，在 360d的储存期内未出现析油或分层现象，能用于饲喂卤虫和轮虫进行强化，也适用于做为鱼、虾、贝类和蟹类的人工配合饲料的添加剂；利用上述强化试剂进行的开口饵料的强化方法能将石首鱼仔鱼的开口率从75％左右提高到93％以上，有利于鱼苗的摄食率和成活率的提升，显著提升养殖户的经济效益。
因此，本发明是一种能抑制试剂中脂质过氧化物含量增长，降低氧化脂肪对开口饵料的毒害作用，提升强化期轮虫/卤虫的密度；提高石首鱼仔鱼的开口率、增加育苗成活量和成活率的石首鱼开口饵料强化试剂配方及强化方法。
附图说明
图1为试验例2中不同强化试剂储存期间脂质过氧化物含量的变化示意图；
图2为试验例2中不同强化试剂对轮虫强化后的密度测定结果；
图3为试验例3中不同强化试剂对轮虫强化后的怀卵率测定结果；
图4为试验例3中不同强化试剂对石首鱼体内乙酰CoA羧化酶的活性影响示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
本发明及实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，在此不作详细叙述。
实施例1：
一种石首鱼开口饵料强化试剂的制备方法，包括以下具体步骤：
1)取乳化型大豆分离蛋白、预糊化淀粉，加入蒸馏水混匀后，置于45℃的温度下，搅拌混合45min，待形成乳状液态即得壁材，备用，上述壁材中乳化型大豆分离蛋白含量为12.5wt％，预糊化淀粉的含量为20wt％，余量为水；
2)按重量比4:1.5:0.5的比例取鱼油、羟基化卵磷脂和生育酚混匀，然后在800rpm的速率下搅拌45min，即得芯材；
3)按照重量比为3.5:1的比例取壁材和芯材，搅拌30min后，向体系中添加分别为芯材重量0.065％和0.085％的4-乙基-2-甲氧基苯酚和酸式磷酸铝钠，在45Mpa压力下均质35min，完成初次均质，产物备用；
4)取罗望子胶和蒸馏水混匀，然后在85℃下形成凝胶，待温度降至40℃以下后，向其中添加α-淀粉酶并混匀，得到包衣层，备用，上述包衣层中α-淀粉酶的含量为10.5wt％，罗望子胶的含量为50.5wt％，余量为水；
5)将初次均质产物和包衣层混合，然后在转速为4000rpm的条件下进行30min的二次均质，即得水乳化型微胶囊试剂，上述包衣层的添加量为壁材重量的30％。通过显微镜下观察，所制微胶囊水剂中微胶囊的粒径为20-200μm。
实施例2：
本实施例对强化试剂的制备方法进行了一个方向的优化，其具体的优化措施如下：芯材中还含有破壁酵母粉1-1.5wt％、甘油三酯0.5-1.5wt％、油酸钠0.5-1wt％、维生素D3 0.05-0.5wt％。如破壁酵母粉有利于调控动物肠道有益微生物菌群，且具有天然发酵香味，具有良好诱食效果；维生素和甘油三酯能补充维生素和能量；油酸钠能增强芯材和壁材间的结合紧密度。
本实施例中石首鱼开口饵料强化试剂的制备方法，与实施例1基本一致，不同之处在于：
步骤2)中，芯材制备过程中，向体系中添加了1.25wt％破壁酵母粉、0.75wt％甘油三酯、 0.5wt％油酸钠、0.5wt％维生素D3，然后在800rpm的速率下搅拌45min制得芯材。通过显微镜下观察，所制微胶囊水剂中微胶囊的粒径为65-285μm。
实施例3：
本实施例中石首鱼开口饵料强化试剂的制备方法，与实施例2基本一致，不同之处在于：
步骤1)中，壁材中乳化型大豆分离蛋白含量为10.5wt％，预糊化淀粉的含量为24.5wt％；
步骤2)中，按重量比5.5:1:0.5的比例取鱼油、羟基化卵磷脂和生育酚制得芯材，还向体系中添加了1wt％破壁酵母粉、1.05wt％甘油三酯、0.65wt％油酸钠、0.3wt％维生素D3；
步骤3)中，初次均质体系中4-乙基-2-甲氧基苯酚和酸式磷酸铝钠的介入量分别为芯材重量的0.04％和0.08％，均质操作条件为：压力为40Mpa，时间为45min；
步骤4)中，包衣层中α-淀粉酶的含量为12.5wt％，罗望子胶的含量为52.5wt％；
步骤5)中，二次均质操作条件为：转速为1000rpm，时间为35min，即得水乳化型微胶囊试剂，上述包衣层的添加量为壁材重量的33.5％。通过显微镜下观察，所制微胶囊水剂中微胶囊的粒径为80-260μm。
实施例4：
本实施例对强化试剂的制备方法进行了另一方向的优化，其具体的优化措施如下：向二次均质体系中再添加0.05-0.1wt％的4-甲氧基肉桂酸和0.05-0.15wt％的氧化芳樟醇参与均质操作；两者参与包衣层的均质操作，能协同降低微胶囊在水体中的黏滞性，可能对轮虫的繁殖有增益作用，使得强化期间轮虫的怀卵率得到显著提升，有利于轮虫密度的增加；另外，还能增强石首鱼体内乙酰CoA羧化酶的活性，促进鱼体内脂肪代谢水平的提升，有利于鱼苗生长率和鱼体中高不饱和脂肪酸组成的改善和提升。
本实施例中石首鱼开口饵料强化试剂的制备方法，与实施例2基本一致，不同之处在于：
步骤5)中，将初次均质产物和包衣层混合，然后向体系中再添加0.075wt％的4-甲氧基肉桂酸和0.125wt％的氧化芳樟醇，然后在转速为4000rpm的条件下进行30min的二次均质，即得水乳化型微胶囊试剂。通过显微镜下观察，所制微胶囊水剂中微胶囊的粒径为130-300μm。
实施例5：
一种石首鱼开口饵料的强化方法，包括以下步骤：
1)取小球藻、实施例1所制强化试剂和海水，混合，得到强化液，上述强化液中小球藻的浓度为6.5×107cell/mL，强化试剂添加量为每150万轮虫用0.35g，每50万卤虫用0.9g；
2)在卤虫/轮虫投喂前10h用步骤1)所制的强化液进行强化操作，强化时卤虫/轮虫的初始密度为300Ind/mL，强化操作的水温为27℃，盐度为30‰，环境中溶解氧浓度不低于7ppm，完成强化后即可直接投喂，轮虫的投喂量为5Ind/mL，卤虫的投喂量为0.5Ind/mL。
实施例6：
本实施例中石首鱼开口饵料的强化方法，与实施例5基本一致，不同之处在于：
步骤1)中，强化液所用强化试剂为实施例2所制水乳化型微胶囊试剂。
实施例7：
本实施例中石首鱼开口饵料的强化方法，与实施例5基本一致，不同之处在于：
步骤1)中，强化液所用强化试剂为实施例3所制水乳化型微胶囊试剂。
实施例8：
本实施例中石首鱼开口饵料的强化方法，与实施例5基本一致，不同之处在于：
步骤1)中，强化液所用强化试剂为实施例4所制水乳化型微胶囊试剂。
对比例1：
本实施例中石首鱼开口饵料强化试剂的制备方法，与实施例2基本一致，不同之处在于：
步骤3)中，初次均质体系中4-乙基-2-甲氧基苯酚的介入量为芯材重量的0.065％，未添加酸式磷酸铝钠。
对比例2：
本实施例中石首鱼开口饵料强化试剂的制备方法，与实施例2基本一致，不同之处在于：
步骤3)中，初次均质体系中酸式磷酸铝钠的介入量为芯材重量的0.085％，未添加4-乙基-2-甲氧基苯酚。
对比例3：
本实施例中石首鱼开口饵料强化试剂的制备方法，与实施例2基本一致，不同之处在于：
步骤3)中，初次均质体系中未添加4-乙基-2-甲氧基苯酚和酸式磷酸铝钠。
对比例4：
本实施例中石首鱼开口饵料强化试剂的制备方法，与实施例4基本一致，不同之处在于：
步骤5)中，向二次均质体系中添加了0.075wt％的4-甲氧基肉桂酸，未添加氧化芳樟醇。
对比例5：
本实施例中石首鱼开口饵料强化试剂的制备方法，与实施例4基本一致，不同之处在于：
步骤5)中，向二次均质体系中添加了0.125wt％的氧化芳樟醇，未添加4-甲氧基肉桂酸。
对比例6：
一种石首鱼开口饵料的强化方法，与实施例5基本一致，不同之处在于：
步骤1)中，强化液所用强化试剂为对比例1所制水乳化型微胶囊试剂。
对比例7：
本实施例中石首鱼开口饵料的强化方法，与实施例5基本一致，不同之处在于：
步骤1)中，强化液所用强化试剂为对比例2所制水乳化型微胶囊试剂。
对比例8：
本实施例中石首鱼开口饵料的强化方法，与实施例5基本一致，不同之处在于：
步骤1)中，强化液所用强化试剂为对比例3所制水乳化型微胶囊试剂。
对比例9：
本实施例中石首鱼开口饵料的强化方法，与实施例5基本一致，不同之处在于：
步骤1)中，强化液所用强化试剂为对比例4所制水乳化型微胶囊试剂。
对比例10：
本实施例中石首鱼开口饵料的强化方法，与实施例5基本一致，不同之处在于：
步骤1)中，强化液所用强化试剂为对比例5所制水乳化型微胶囊试剂。
试验例1：
不同强化方法对石首鱼开口率的影响试验
试验方法：分别按照实施例5-7和对比例6-8中的强化方法，对褶皱臂尾轮虫进行强化，并用强化后的轮虫作为开口饵料进行苗种培育，以相同强化条件、未添加强化试剂的强化液进行强化的轮虫做为对照组。分别取相同数量的初孵仔鱼分为6组，每组设3个平行并取平均数记录数据，在25℃左右水温条件下培育，每天早上8点及下午14点吸底换水一次，3 日龄开口，开始投喂轮虫，轮虫在每次换水后投喂一次；待15日龄时，开始投喂相同的人工配方饲料，完成开口阶段培育。统计开口培育阶段仔鱼的开口率和鱼苗的成活率，开口率＝(摄食仔鱼数/初孵仔鱼数)×100％，成活率＝(15日龄时成活仔鱼数/初孵仔鱼数)×100％，结果及分析如下表1。
表1不同强化方法对石首鱼开口率的影响结果
结果表明，按照实施例5-7的强化方法培育得开口饵料能获得较对比例和对照组更高得开口率和成活率，其中实施例5的开口率和成活率较实施例6和7的略低，实施例6和7差异不大；对照组的开口率和成活率最低，说明开口饵料经过不同程度的强化有助于提升石首鱼的开口率和成活率，增长养殖经济效益；实施例6和对比例6-8比较得出，实施例6的开口率和成活率均为最高，对比例6次之，对比例7较对比例8的开口率增长了，但对比例7的成活率显著低于对比例8，说明实施例6所用的强化方法，能将仔鱼的开口率从75％左右提高至93％以上，实施例6中用实施例2的强化试剂的制备方法中介入的4-乙基-2-甲氧基苯酚和酸式磷酸铝钠发挥协同作用，显著提高仔鱼的开口率和成活率，有利于提升经济效益。
试验例2：
不同强化试剂的储存品质试验
试验方法：1)脂质过氧化物含量测定：取实施例1-2、对比例1-3所制的强化试剂10g，在相同湿度75％、相同温度28℃下进行120d的保存试验，每隔20d测定试剂中的脂质过氧化物含量，测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，每组设3个平行并取平均数记录数据。统计并分析脂质过氧化物含量在储存期的变化，结果如图1所示。
图1为不同强化试剂储存期间脂质过氧化物含量的变化示意图。结果显示，实施例1和2间差异不显著，在前80d脂质过氧化物含量处于轻微增长，后40d的增长趋势总体依然较平缓，且总含量一直处于最低水平，最终含量分别为94.8ng/g和90.6ng/g；对比例1前60d处于轻微增长，后60d含量迅速升高，最终含量为123.7ng/g；对比例2和3前40d处于轻微增长，后80d含量迅速升高，且较对比例1上升趋势更快，其中对比例3的最终含量为 140.8ng/g，对比例2的上升趋势最大，最终含量为159.4ng/g；说明实施例1和2的制备方法中介入的4-乙基-2-甲氧基苯酚和酸式磷酸铝钠发挥协同作用，能降低试剂中脂肪的受氧化程度，抑制了储存期强化试剂中脂质过氧化物含量增长，有利于延长试剂的储存期和提升试剂的品质，降低氧化脂肪对轮虫/卤虫的毒害作用。
2)强化期轮虫密度测定：取实施例1-2、对比例1-3所制的强化试剂，经120d储存期后，按照实施例5-6和对比例6-8中的强化方法，对褶皱臂尾轮虫进行强化，以相同强化条件、未添加强化试剂的强化液进行强化的轮虫做为对照组1，以相同强化条件、直接添加实施例2 所制芯材的强化液进行强化的轮虫做为对照组2(芯材经120d储存期)。在进行10h强化以后，取1mL轮虫培养液平均滴到玻璃观察板上，然后用光学显微镜观察并计算轮虫的数量，每个试验组各取3mL轮虫培养液，以3次测量结果的平均数记录数据。结果如图2所示。
图2为不同强化试剂对轮虫强化后的密度测定结果。强化期间，轮虫摄食良好，整体活跃。结果显示，实施例5和6间差异不显著，轮虫密度最高，分别达到609Ind/mL和621Ind/mL；对比例6次之，达到563Ind/mL；对比例8再次，达到537Ind/mL；对比例7最低，达到504Ind/mL；综合图1结果，可能是由于对比例2的试剂在储存期中脂质过氧化物含量较高，氧化脂肪对轮虫/卤虫具有毒害作用，故对比例7得轮虫密度最低。对照组总体表现皆不如实施例和对比例优异，对照组1轮虫密度达到436Ind/mL，对照组2达到485Ind/mL；说明将强化试剂制成微胶囊的形式更利于脂质的保存和轮虫的摄食，能获得更高更优的强化效果；同时也说明实施例1和2的制备方法中介入的4-乙基-2-甲氧基苯酚和酸式磷酸铝钠发挥协同作用，能通过降低试剂中脂肪的受氧化程度，降低氧化脂肪对轮虫/卤虫的毒害作用，达到提升强化期间轮虫/卤虫密度的目的。
试验例3：
不同强化试剂的强化效果试验
试验方法：1)强化期轮虫怀卵率测定：取实施例2和4、对比例4-5所制的强化试剂，按照实施例6、8和对比例9-10中的强化方法，对褶皱臂尾轮虫进行强化，以相同强化条件、未添加强化试剂的强化液进行强化的轮虫做为对照组1，以相同强化条件、直接添加实施例4 所制芯材的强化液进行强化的轮虫做为对照组2。在进行10h强化以后，取1mL轮虫培养液平均滴到玻璃观察板上，然后用1％的甲醛固定，然后用光学显微镜观察并计算轮虫的数量和怀卵率，每个试验组各取3mL轮虫培养液，以3次测量结果的平均数记录数据。怀卵率＝(怀卵轮虫数/轮虫总数)×100％。结果如图3所示。
图3为不同强化试剂对轮虫强化后的怀卵率测定结果。强化期间，轮虫摄食良好，整体活跃。结果显示，实施例8的轮虫怀卵率最高，达到68.3％；对比例9次之，达到64.1％；对比例10再次，达到61.7％；实施例6最低，达到60.6％；对照组总体表现皆不如实施例和对比例优异，对照组1轮虫怀卵率达到43.6％，对照组2达到54.5％；说明将强化试剂制成微胶囊的形式更利于轮虫的摄食，能获得更高更优的强化效果；同时也说明实施例8对应的实施例4的制备方法中介入的4-甲氧基肉桂酸和氧化芳樟醇发挥协同作用，能对轮虫的繁殖有增益作用，虽然具体机理还有待验证，但能使得强化期间轮虫的怀卵率得到显著提升，有利于轮虫密度增加，降低生产成本。
2)乙酰CoA羧化酶活性测定：取实施例2和4、对比例4-5所制的强化试剂，分别按照实施例6、8和对比例9-10中的强化方法，对褶皱臂尾轮虫进行强化，并用强化后的轮虫作为开口饵料进行苗种培育，以相同强化条件、未添加强化试剂的强化液进行强化的轮虫做为对照组。分别取相同数量的初孵仔鱼分为5组，每组设3个平行并取平均数记录数据，在25℃左右水温条件下培育，每天早上8点及下午14点吸底换水一次，3日龄开口，开始投喂轮虫，轮虫在每次换水后投喂一次；待15日龄时，开始投喂相同的人工配方饲料，完成开口阶段培育。分别取3、5、10、15日龄石首鱼，冰上解剖，分离肝脏。同一处理中将每3尾鱼的肝脏分别剪碎等量均匀混合，保存于-20℃冰箱中过夜，将组织样品与PBS按1:9(mg:mL)比例加入玻璃匀浆器中，冰上充分研磨后将匀浆液以5000g离心5-10min，取上清检测，测定试剂盒购自上海仁捷生物科技有限公司。结果如下图4。
图4为不同强化试剂对石首鱼体内乙酰CoA羧化酶的活性影响示意图。结果显示，实施例8的石首鱼体内乙酰CoA羧化酶的活性增长最快，15日龄时达到1.86ng/g；对比例10次之，达到1.48ng/g；对比例9和实施例6差异不显著，分别达到1.20ng/g和1.23ng/g；对照组表现最差，达到1.06ng/g；说明实施例8对应的实施例4的制备方法中介入的4-甲氧基肉桂酸和氧化芳樟醇发挥协同作用，能增强石首鱼体内乙酰CoA羧化酶的活性，促进鱼体内脂肪代谢水平的提升，有利于鱼苗生长率和鱼体中高不饱和脂肪酸组成的改善和提升。
3)石首鱼血浆脂肪酸组成测定：取试验例3测定方法2)中培育的15日龄石首鱼，从尾静脉采血，以3000r/min离心5min，吸取上清液，将同组每5尾鱼血浆等量混合作为1个试样，每个试样取5mL用于血浆脂肪酸组成测定，每组3个重复。先将血浆样品冷冻干燥后，加入十一碳酸(C11:0)标准品作为内标，振荡、提取3次，过滤后挥干，采用GC/FID方法在日本岛津(Shimadzu)GC-2010气相色谱仪上进行定量分析。结果如下表2所示。
表2石首鱼血浆脂肪酸组成测定结果(单位mg/L)
DPA
DHA
Σn3PUFA
Σn6PUFA
ΣPUFA
ΣUFA
实施例6
229.36
2759.21
4225.27
775.49
5000.76
6196.35
实施例8
268.57
3267.71
4863.54
957.41
5820.95
7236.25
对比例9
227.28
2727.61
4159.67
763.25
4922.92
6237.55
对比例10
239.82
2973.92
4462.47
843.36
5305.83
6703.59
对照组
201.35
2170.31
3505.93
615.73
4121.66
5326.11
结果显示，鱼体血浆中多不饱和脂肪酸PUFA和不饱和脂肪酸UFA的含量表现为实施例 8最多，对比例10次之，对比例9和实施例6差异不显著，对照组表现最差；综合图4结果，说明实施例8对应的实施例4的制备方法中介入的4-甲氧基肉桂酸和氧化芳樟醇发挥协同作用，能通过促进和提升鱼体内脂肪代谢水平，达到改善和提升鱼体中多不饱和脂肪酸组成的有益效果，提升了鱼体的营养价值和经济效益。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。