阅读说明：本技术 一种检测抗胰腺癌天然抗体的组合物、试剂盒和方法 (Composition, kit and method for detecting anti-pancreatic cancer natural antibody ) 是由 韩传伟 胡颖 于 2020-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于检测抗胰腺癌天然抗体的组合物、由该组合物制成的试剂盒、使用该组合物或该试剂盒检测样品中抗胰腺癌天然抗体浓度的方法、以及该组合物或该试剂盒在样品抗胰腺癌天然抗体检测中的应用。本发明利用与目标抗胰腺癌天然抗体完全互补的3种线性抗原多肽,实现对样品中抗胰腺癌天然抗体的定性和定量检测,可用于筛查富含抗胰腺癌天然抗体的健康人血浆和体外实验研究。(The invention relates to a composition for detecting anti-pancreatic cancer natural antibodies, a kit prepared from the composition, a method for detecting the concentration of anti-pancreatic cancer natural antibodies in a sample by using the composition or the kit, and application of the composition or the kit in detection of the anti-pancreatic cancer natural antibodies in the sample. The invention realizes qualitative and quantitative detection of the anti-pancreatic cancer natural antibody in a sample by using 3 linear antigen polypeptides completely complementary with the target anti-pancreatic cancer natural antibody, and can be used for screening healthy human plasma rich in the anti-pancreatic cancer natural antibody and in-vitro experimental research.)

一种检测抗胰腺癌天然抗体的组合物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，涉及一种检测抗胰腺癌天然抗体的组合物、试剂盒和方法。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的主要杀手之一。据最新统计，全球每年新发癌症患者高达一千五百万人左右,因癌症而死亡的人数每年达八百万以上。在中国，每年新患癌症的人数大约300多万，发病率最高的肿瘤是肺癌，每年患病人数约80万，其次是胃癌，每年患病人数约40多万。在恶性程度上，胰腺癌占据首位，平均一年生存率不足25％，五年生存率不足5％。肿瘤患者生存率低的主要原因有二：一是难以早期发现，二是缺乏有效的治疗手段。

根据近年来有关天然抗体的研究报道，人血中50％以上的抗体属于天然抗体，主要由B1淋巴细胞自动分泌产生,不需要特异性抗原刺激。天然抗体参与机体的各种生理调节和免疫功能稳定,充当固有免疫和特异免疫系统之间的桥梁。值得注意的是，某些天然抗体具有免疫监视功能，随时清除体内形成的恶性变细胞,维持内环境稳定。因此，保持一定水平的天然抗体可以起到防癌作用。据此推测，天然抗体缺乏或阴性者发生肿瘤的风险可能明显高于正常人群。建立检测天然抗癌抗体方法有助于研发肿瘤发生发展规律，找到有效***的方法。最近，某生物技术有限公司引进了人血浆天然抗癌抗体检测技术。项目研究发现,5％～10％的健康人血浆中富含天然抗癌抗体，这些个体因免疫监视功能极强，终生患癌症的风险极小。通过实验室研究证明,富含天然抗癌抗体的健康人血浆可以明显抑制多种癌细胞的生长与增殖，包括原发性肝癌、胃癌，鼻咽癌,肺癌及口腔癌等。在某人民医院通过病例对照临床研究发现,富含天然抗癌抗体血浆对B期弥漫型和多发性肝癌具有明显的治疗效果，对原发性肝癌术后复发病人也非常有效。经过历时3年的随访研究证明，经过单纯介入治疗的B期肝癌患者,中位数生存时间为20个月，而介入治疗联合输注富含天然抗癌抗体血浆，患者的中位数生存时间超过30个月。该治疗方法的最大优势在于不会产生耐药，也没有明显的副作用，具有广阔的临床价值和应用前景。

胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，居消化道癌症死因的第2位，仅次于结直肠癌。约75％患者的胰腺癌发生在胰头，90％患者的病理诊断为胰管上皮腺癌，其确切病因尚未明确。胰腺癌的治疗是以手术为主的综合治疗，但预后极差，手术后5年生存率一般为10％～15％。胰腺癌的其他治疗还包括放射治疗、化学治疗以及介入治疗等，但效果均不理想。因此，治疗胰腺癌新方法的研发是一个亟待解决的重大医疗问题。

三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(ATP-binding casssette transporters，ABC转运蛋白)能够介导多种底物分子在细胞内外运输。根据序列同源性及跨膜域拓扑结构，将ABC转运蛋白分为7个亚家族(ABC A-G)。迄今为止，在人类发现的ABC家族已有49个成员，与药物转运相关的蛋白主要集中于ABCB、ABCC和ABCG这几个亚家族中。研究发现，ABC转运蛋白泵功能与肿瘤细胞内药物聚集的降低有关，是肿瘤细胞产生耐药性的主要原因，成为肿瘤细胞免受化疗药物攻击的重要防御机制。ABCC5属于ABC转运蛋白超家族成员之一，这种转运蛋白能够结合三磷酸腺苷并利用能量驱动各种不同分子跨细胞膜转运。研究表明，ABCC5在胰腺癌细胞中高度表达，可能是胰腺癌化疗不敏感的原因之一。此外，组织化学研究证实，成纤维细胞生长因子2型受体(Fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)也在胰腺癌细胞中高度表达，与病人的预后关系密切，可以做为免疫靶向治疗的重要靶点分子。

本发明主要提供一组用于检测人血浆中抗ABCC5和FGFR2天然抗体浓度的线性多肽抗原组合物，由此组合物制备的试剂盒，以及使用所述抗原多肽组合物或该试剂盒检测人血浆中抗胰腺癌天然抗体的方法，阐明其应用价值与前景。所述抗原多肽衍生自人ABCC5和FGFR2蛋白序列，其中两条来自ABCC5转运蛋白(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)，一条来自FGFR2受体蛋白(SEQ ID NO:3)。表1和表2所示的斜体和下划线区域代表抗原多肽氨基酸序列。这些抗原表位能够分别与人血浆中ABCC5和FGFR2天然抗体发生特异性结合。

表1.人ABCC5蛋白序列

表2.人FGFR2蛋白序列

本发明所定义的“抗胰腺癌天然抗体”是指自然存在于健康人体内的抗体或抗体混合物，可能参与抑制包括胰腺癌在内的多种恶性肿瘤的发生与发展。检测抗胰腺癌天然抗体具有提示肿瘤发病风险价值,有利于进一步开发早期诊断和***的技术手段。在本发明的特定实施方案中，所述抗胰腺癌天然抗体是指能识别SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的一个或多个抗原表位序列的天然抗体或天然抗体混合物。

本发明人利用免疫信息学方法和表位制图技术，分析ABCC5和FGFR2蛋白序列上的人类白细胞二类抗原(Human leukocyte antigen II,HLA-II)表位和B细胞表位，甄别具有高度亲和力的氨基酸序列，进而设计能被绝大多数人类抗原提呈细胞识别的HLA-II限制性表位及线性抗原多肽。

本发明根据蛋白表位的生物学特性，针对多个表位进行免疫信息学预测和模拟，经过分析与抗原性相关的各种参数，分别设计了两种在空间结构和构型上与人血浆中目标抗体完全互补的线性抗原多肽，其氨基酸序列见表3。

表3.检测人血浆中ABCC5和FGFR2天然抗体的线性抗原多肽序列

经固相化学法合成上述三种抗原多肽，并用于制备ELISA抗体检测试剂盒，按设定的流程规范检测健康个体血浆中ABCC5和FGFR2天然抗体浓度。上述抗原多肽在实际应用中可制备成简单易用的便捷试剂盒，以玻璃、医用塑料等非金属材料真空密封包装，4摄氏度环境下可保存6个月以上。简言之，将所述三种抗原多肽包被在马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板上。在40-45摄氏度(40-45℃)烤箱中干燥后，用非金属包装材料真空密封包装，制成试剂盒。

因此，根据本发明之一，提供用于检测ABCC5和FGFR2天然抗体的检测试剂，其包含选自下述三种抗原多肽：

H-GLSLDASMHSQLRILDSKFRRTRPLEC-OH(SEQ ID NO:1)；

H-YHHGLSALKPIRTTSKHQHPVDNAGLFSCD-OH(SEQ ID NO:2)；和H-DYWTNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPD-OH(SEQ ID NO:3)。

在一些实施方案中，所述检测试剂由所述三种抗原多肽组成。

在一些实施方案中，所述三种抗原多肽为高纯度制品，优选为纯度>90％的化学合成制品。

在一些实施方案中，当所述检测试剂包含三种抗原多肽时，所述三种抗原多肽混合使用。混合使用时，所述三种抗原多肽可以按重量浓度(3:3:4)比例混合。在优选的实施方案中，所述三种抗原多肽以(3:3:4)重量浓度比例混合。

根据本发明的另一个方面，提供包括上述检测试剂组成的试剂盒。

在一些实施方案中，所述试剂盒包括微量检测板，所述检测试剂被包被在微量检测板的孔内。

在一些实施方案中，在所述试剂盒中，将包被有上述检测试剂的微量检测板干燥后，用非金属医用包装材料真空密封包装。在一些实施方案中，所述微量检测板是马来酰亚胺(Maleimide)活化96孔微量检测板。

在另一些优选的实施方案中，所述非金属医用包装材料为玻璃或医用塑料。

在另一些实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。在一些实施方案中，阳性对照和/或阴性对照被包被在微量检测板上。

根据本发明的另一个方面，提供一种使用上述检测试剂或上述试剂盒检测样品中ABCC5和FGFR2天然抗体的方法，优选该方法为体外的、非诊断目的的检测技术。

在一些实施方案中，所述方法包括使用上述检测试剂通过抗原抗体结合反应检测待测样品中ABCC5和FGFR2天然抗体浓度。

在优选的实施方案中，所述“通过抗原抗体结合反应检测待测样品中ABCC5和FGFR2天然抗体浓度”是通过酶联免疫吸附测定(ELISA)方法实现的。

在更优选的实施方案中，所述酶联免疫吸附测定为夹心法ELISA。

在一些实施方案中，所述方法的实施步骤包括：(1)使用包被有上述检测试剂的马来酰亚胺(Maleimide)活化96孔微量检测板进行分步加样分析并用酶标仪检测每孔中的光密度值(OD)；(2)并用阳性样品比值(PSR)表示抗体水平。

在更优选的实施方案中，上述步骤(1)包括将待测样品设双复孔，同时设2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，用分析液将血浆稀释，并稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，洗板，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟，每孔添加50μl终止液10-12％硫酸溶液(10-12％H₂SO₄)，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。

在更优选的实施方案中，所述样品为人血浆，更优选为单一个体血浆。

在更优选的实施方案中，个体血浆为来自单一健康个体的血浆。

在更优选的实施方案中，上述步骤(1)的具体操作步骤为：

1.操作前，将所使用的三种抗原多肽用67％乙酸分别溶解为5.0毫克/毫升(mg/ml)储存液,然后放置-20摄氏度(误差在±2摄氏度范围内)冰箱中保存。

2.操作开始时，首先将所使用的抗原多肽用包被液稀释为10～30微克/毫升(μg/ml)的工作液，该包被液为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间。

3.用工作液包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板(ThermoScientific,美国)，4摄氏过夜孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液为含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间。

4.然后按一下步骤分步加样和分析：

a)待测血浆样品设双复孔，另设2个阴性对照孔(NC，参照物为不含ABCC5和FGFR2天然抗体的阴性对照液，如牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司提供)，藉此可反映所使用的抗原多肽在ABCC5和FGFR2天然抗体阴性反应体系中的实验指标值)和2个阳性对照孔(PC，参照物为抗人ABCC5和FGFR2抗体的混合物，藉此可反映所使用的抗原多肽在ABCC5和FGFR2天然抗体阳性反应体系中的实验指标值)。

b)用分析液将待测血浆样品1:200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，即含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间，每孔加100μl,20-25摄氏度室温孵育1-2小时，然后洗板3遍。

c)用分析液(即含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，酸碱度为7.0～7.4之间)稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(用以验证血浆中被检测的物质是否是特异性抗体)，抗体稀释比例为1:20000～1:50000，每孔加100μl，20-25摄氏度室温孵育1-2小时。

d)用洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0～7.4之间)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟。

e)每孔加50μl终止液12％硫酸溶液(12％H₂SO₄)，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。检测过程在加入终止液后10分钟内完成，由此定量分析个体血浆中ABCC5和FGFR2天然抗体水平。

在进行群体随机抽样分析时，可针对每一个体检测所得数据进行分析，采用阳性样品比值(Positive Sample Ratio，PSR)判定血浆中ABCC5和FGFR2天然抗体相对水平。

在一些实施方案中，上述步骤(2)中的阳性样品比值(PSR)计算方法如下：

PSR＝[待测样品OD值–OD_NC值]/[阳性标准品OD值–OD_NC值]，NC为各样本的阴性对照。

在本发明的另一个方面，提供上述检测试剂、上述试剂盒或上述方法在检测样品中ABCC5和FGFR2天然抗体中的应用。在一些实施方案中，所述应用是体外的、非诊断目的。

在本发明的另一个方面，还提供上述检测试剂在制备用于检测样品中ABCC5和FGFR2天然抗体的试剂中的应用。

在优选的实施方案中，所述样品为人血浆，更优选为单一个体血浆。

在更优选的实施方案中，个体血浆为来自单一健康个体的血浆。

基于以上方案，本发明提供了精度高、操作简易、成本适中的ABCC5和FGFR2天然抗体检测技术，并在此基础上，进一步提供了对ABCC5和FGFR2天然抗体的半定量(或相对定量)的分析和应用方案，进而为发展基于健康人血浆ABCC5和FGFR2天然抗体的全新早期诊断肿瘤和早期实施治疗策略奠定重要基础。

本发明提供了一种简便的人血浆ABCC5和FGFR2天然抗体检测手段，可用于定性或相对定量检测ABCC5和FGFR2天然抗体水平，辅助量化测定不同个体的血浆ABCC5和FGFR2天然抗体水平。ABCC5和FGFR2天然抗体水平下降或者阴性个体可能具有较高的胰腺癌发病风险，具有预测胰腺癌发病风险和早期诊断ABCC5和FGFR2胰腺癌的重要价值。用本发明产品检测出的血浆ABCC5和FGFR2天然抗体阴性个体，可能具有较高的胰腺癌发病风险，可以对其进行临床随访和追踪，适于进一步开发早期发现胰腺癌和实施治疗的技术手段。

本发明的ABCC5和FGFR2天然抗体方法可用于胰腺癌生物学研究，探讨胰腺癌发生机制、瘤细胞免疫“逃逸”机制及免疫监视机制等。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的主要目的和其它优点可通过在说明书中所特别指出的方案来实现和获得。

附图说明

图1是细胞活度变化结果的示意图。

实施例

1、健康人血浆ABCC5和FGFR2天然抗体筛查

在广东省某血站筛查健康献血者血浆样品中ABCC5和FGFR2天然抗体水平。本实验所采用的三条多肽抗原(见表3)系应用化学固相合成，纯度为95％，具体进行如下操作步骤：

(1)操作前，每种抗原用67％乙酸溶解为5.0mg/ml储存液,并放置-20摄氏度冰箱中保存。

(2)操作开始时，首先用包被液将三种抗原分别稀释为20微克/ml，然后按重量体积混合，比例为3:3:4。该包被液为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度(pH值)为7.2。

(3)然后将混合后的三种抗原多肽包被在马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔检测板上(Thermo Scientific,美国)，4摄氏度过夜孵育15小时后，用洗液洗板3遍,所述洗液为含有0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度pH值为7.2。

(4)然后分步加样分析如下：

a)每种抗原检测待测血浆样本时均设双复孔，另设2个阴性对照孔(NC，参照物为牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司提供)和2个阳性对照孔(PC，参照物为抗人ABCC5和FGFR2抗体的混合物，由Sigma-Aldrich公司提供)。

b)用分析液将血浆1:200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度(pH)为7.2，每孔加100μl，室温孵育1.5小时。

c)以前述洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度为7.2)洗板3遍后，用分析液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(由Sigma-Aldrich公司提供)，抗体工作浓度为1:30000，每孔加100μl，室温孵育1.5小时。

d)以前述洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测酸碱度PH值为7.2)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液(Life Technologies公司提供)，室温避光孵育25分钟。

e)每孔加50μl终止液12％硫酸溶液(12％H₂SO₄)，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm，加入终止液后10分钟内检测完毕，后续步骤将依据此结果针对每一个体进行ABCC5和FGFR2天然IgG抗体的定量对比分析。

3.天然IgG抗体阳性与阴性血浆

针对前述检测所得数据进行分析时，采用阳性样品比值(Positive sampleratio，PSR)判定血浆中ABCC5和FGFR2天然IgG抗体水平，PSR计算公式为：PSR＝[待测样品OD值–OD_NC值]/[阳性标准品OD值–OD_NC值]，NC为各样本的阴性对照。

通过筛查100份健康人血浆，选出PSR值最高和最低的血浆各两份，在过滤灭菌时分别混合，从而获得高抗体混合血浆(血浆组1)和低抗体混合血浆(血浆组2)，分装后在-20度冰箱中保存，用于细胞培养之前室温解冻。

4.胰腺癌细胞活度实验

选择胰腺癌细胞株SW1990细胞(由中国医学科学院肿瘤医院提供)进行活度实验。用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(GIBCO公司提供)在96孔培养板上培养SW1990细胞，每孔接种2500个细胞/100微升，每组血浆处理的细胞接种9个复孔。细胞在37度(℃)和95％二氧化碳(CO₂)条件下培养24小时，然后去除上清液，加入100微升含有20％人血浆的RPMI1640培养基，继续培养48小时，试剂空白孔仅加入100微升细胞培养基。为了检测细胞活度，加入10微升CCK-8细胞计数液(Sigma-Aldrich公司提供)，再孵育2小时后用96孔读扳机450nm波长检测光密度(OD)值,并计算细胞活度。细胞活度＝[血浆1OD值–空白OD值]/[血浆2OD值–空白OD值]。如表4和图1所示,富含抗胰腺癌抗体的健康人血浆对SW1990细胞活度具有显著的抑制作用。

表4.富含抗胰腺癌抗体的健康人血浆对SW1990细胞活度的影响

注：每组9个复孔，t检验自由度为16。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的主要目的和其它优点可通过在说明书、权利要求书中所特别指出的方案来实现和获得。

序列表

<110> 青岛海兰深生物科技有限公司

<120> 一种检测抗胰腺癌天然抗体的组合物、试剂盒和方法

<130> 2020

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial Sequence (人工序列)

<400> 1

Gly Leu Ser Leu Asp Ala Ser Met His Ser Gln Leu Arg Ile Leu Asp

1 5 10 15

Ser Lys Phe Arg Arg Thr Arg Pro Leu Glu Cys

20 25

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence (人工序列)

<400> 2

Tyr His His Gly Leu Ser Ala Leu Lys Pro Ile Arg Thr Thr Ser Lys

1 5 10 15

His Gln His Pro Val Asp Asn Ala Gly Leu Phe Ser Cys Asp

20 25 30

<210> 3

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial Sequence (人工序列)

<400> 3

Asp Tyr Trp Thr Asn Thr Glu Lys Met Glu Lys Arg Leu His Ala Val

1 5 10 15

Pro Ala Ala Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro Asp

20 25