阅读说明：本技术 一种核型多角体病毒防治棉铃虫的农药及其制备方法和应用 (Pesticide for preventing and treating cotton bollworm by using nuclear polyhedrosis virus and preparation method and application thereof ) 是由 柴连琴 荆玉谱 张林杰 刘鹏飞 孟景会 张海燕 王喆 于 2020-06-12 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物防治棉铃虫技术领域,通过在棉铃虫核型多角体病毒中添加含有蜕皮酮的露水草提取物能够大大提高防治老熟棉铃虫的效果,同时防治低龄棉铃虫效果比传统方法更好。按每只6龄棉铃虫5毫克露水草提取物(30％蜕皮酮)和2.0×10<Sup>6</Sup> PIB核型多角体病毒的用量,可以显著增强核型多角体病毒防治老熟棉铃虫效果。本发明所提供的农药,3龄以下幼虫48小时内死亡率达到100％；对于防控老熟棉铃虫起效快、效率高、减少产卵量,对防控次年棉铃虫的爆发具有显著作用,填补了目前没有有效杀灭棉铃虫的空白。(The invention belongs to the technical field of biological prevention and control of cotton bollworms, and can greatly improve the effect of preventing and controlling mature cotton bollworms by adding a dew grass extract containing ecdysone into cotton bollworm nuclear polyhedrosis virus, and simultaneously has better effect of preventing and controlling the cotton bollworms with low age than the traditional method, wherein 5mg of dew grass extract (30 percent of ecdysone) and 2.0 × 10 are added for each cotton bollworm with 6 ages 6 The usage amount of the PIB nuclear polyhedrosis virus can obviously enhance the effect of the nuclear polyhedrosis virus on preventing and treating the aged cotton bollworm. The pesticide provided by the invention has the mortality rate of 100% in 48 hours for larvae below 3 years old; the composition has the advantages of quick response, high efficiency and reduced egg laying amount for preventing and controlling the aged cotton bollworms, has obvious effect on preventing and controlling the next-year cotton bollworm outbreak, and fills the blank that the cotton bollworms are not effectively killed at present.)

一种核型多角体病毒防治棉铃虫的农药及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物防治棉铃虫技术领域，具体涉及一种核型多角体病毒防治棉铃虫的农药及其制备方法和应用。

背景技术

棉铃虫是一种危害严重的杂食性害虫，5~6龄的老熟棉铃虫幼虫进入暴食期，对作物的危害最大。棉铃虫又是昆虫中产卵量最多的物种，单头雌蛾最多可产3000多个卵，如果防治不到位，一只越冬雌蛹来年平均1年能繁殖上千万只幼虫，多则上亿只，因此少量漏网的老熟棉铃虫就完全具备毁灭性的破坏效果。但目前不论是化学农药还是生物农药对防治老熟棉铃虫效果都较差。随着转基因Bt棉广泛种植，棉铃虫虽然在一定程度上减少了对棉田的危害，但其转而危害玉米、小麦等多种作物及番茄、辣椒等蔬菜，同时大田中已经出现抗性棉铃虫，因而对国家粮食安全仍然造成很大的威胁，依然是重点防控害虫。化学农药虽然防治2-3龄幼虫，起效较快，但存在极大的生物安全和生态安全风险，因此急需开发防治老熟棉铃虫的生物农药。核型多角体病毒是最早商品化的病毒类生物农药，是鳞翅目昆虫重要病原微生物，病虫粪便和死虫能传染其它幼虫，也可通过卵传到子代，但适用于3龄以下的低龄幼虫，对于3龄以上尤其是处于6龄的老熟棉铃虫几乎没有防治效果。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明目的在于提供一种核型多角体病毒防治棉铃虫的农药及其制备方法和应用。有效杀灭棉铃虫，防控棉铃虫的爆发。

本发明所采用的技术方案为：

一种核型多角体病毒生物防治棉铃虫的农药，有效成分为核型多角体病毒和含有蜕皮酮的露水草提取物。所述农药的有效量为核型多角体病毒和蜕皮酮的含量比为2.0×10⁶ -2.5×10⁶PIB：1.5-1.8mg。

优选地，一种核型多角体病毒生物防治棉铃虫的农药，有效成分为核型多角体病毒和含有蜕皮酮的露水草提取物。所述农药的有效量为核型多角体病毒和蜕皮酮的含量比为2.0×10⁶PIB：1.5mg。

优选地，一种核型多角体病毒生物防治棉铃虫的农药，所述含有蜕皮酮的露水草提取物蜕皮酮的质量分数为30%。

一种核型多角体病毒生物防治棉铃虫的农药的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）、用一定量的水溶解含有所述有效量蜕皮酮的露水草提取物，混匀得到露水草提取物溶液；

（2）、将所述露水草提取物溶液和含有所述有效量的核型多角体病毒的溶液混合，得到所述农药。

优选地，一种核型多角体病毒生物防治棉铃虫的农药的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）、用水溶解含有1.6-2.0Kg蜕皮酮的露水草提取物，混匀得到露水草提取物溶液；

（2）、将所述露水草提取物溶液和含有2.8×10¹²PIB-3.5×10¹²PIB核型多角体病毒的溶液混合，得到所述农药。

一种核型多角体病毒农药在生物防治棉铃虫中的应用。

优选地，一种核型多角体病毒农药在生物防治棉铃虫中的应用，每亩施药方法为：将含有1.6-2.0Kg蜕皮酮和2.8×10¹²PIB-3.5×10¹²PIB核型多角体病毒的农药稀释为一定的体积混匀喷洒。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供的核型多角体病毒农药，按每只6龄棉铃虫饲喂5毫克露水草提取物（30％蜕皮酮）和2.0×106 PIB核型多角体病毒的用量，防治效果最佳，能够有效杀灭棉铃虫。

2、本发明所提供的核型多角体病毒防治棉铃虫的农药，杀虫起效快，6龄棉铃虫第3天死亡率显著；提高杀虫效率，可使第4天存活率下降28.4%；第5天存活率为52.5%，第7天存活率仅剩34.7%。通常核型多角体病毒用于3龄前幼虫的防治，对于3龄后防治效果很差，本方法如果用于3龄前幼虫的防治，48小时内死亡率达到100%。因此该方法对于降低老熟棉铃虫对当年作物的危害、减少产卵量、及防控次年棉铃虫的爆发具有显著作用。同时对3龄前棉铃虫的杀灭作用比传统的农药效果好。

附图说明

图1饲喂5毫克露水草提取物（30％蜕皮酮）和2.0×10⁶ PIB核型多角体病毒时3龄棉铃虫的生存率

图2饲喂蜕皮酮纯品20E和2.5×10⁶ PIB核型多角体病毒6龄棉铃虫的生存率

图3病毒感染诱导VHDLR表达上调

图4沉默VHDLR导致病毒感染量下降

图5抗体封闭VHDLR降低病毒感染。

具体实施方式

实施例1：

一种核型多角体病毒防治棉铃虫的农药，有效成分为核型多角体病毒和含有蜕皮酮的露水草提取物。二者按照一定的比例进行混合。

为了鉴定不同比例和浓度的核型多角体病毒以及露水草提取物对6龄棉铃虫的影响，按照表1进行实验，测定生存率。分为12组，每组50头。结果见表1。其中本发明提供的较佳的实施方案即其中之一的浓度的农药的实验方法如下，其他组实验方法类似，可以按照本领域人员推知。

用5毫升60度水溶解21克含有30％蜕皮激素的露水草提取物（购买自西安瑞盈生物科技有限公司），加25度水至100毫升，然后分别吸取25微升所述露水草提取物和25微升含有8.5×10⁷ PIB/mL的核型多角体病毒的PBS溶液混合，喷洒于6.15 cm²的正常饲料上饲喂6龄单头棉铃虫，当喷洒药物的食物吃完后，添加正常饲料后常规饲养。所述正常饲料的制备过程为：

1、600毫升水溶解3克山梨酸，与80克黄豆粉、150克麦麸、30克酵母粉搅拌均匀；

2、800毫升水中加入20克琼脂，加热融化后加入40克干酪素，搅拌均匀放置降温至40°C；

3、100毫升水中加入3克抗坏血酸、1.715克复合维生素、8克葡萄糖、20克蔗糖，搅拌均匀，

4、把1、2、3混合在一起，再加入2毫升甲醛和4毫升乙酸，搅拌均匀,放置4°C备用。

表1：饲喂不同浓度的核型多角体病毒以及露水草提取物（30%蜕皮酮）时6龄棉铃虫的生存率

从表1统计结果可以看出，按每只6龄棉铃虫5mg露水草提取物（30%蜕皮酮）和2.0×10⁶PIB核型多角体病毒的用量，可取得较好的防治效果。特别地，以此配比为例，第4天存活率下降为71.66%，和仅饲喂核型多角体病毒HaNPV的棉铃虫在第4天存活率为86.11%相比，死亡率增加14.45%；第7天存活率下降为34.67%，而仅饲喂HaNPV的棉铃虫在第4天存活率为66.67%相比，死亡率增加32%。单独添加露水草提取物（30%蜕皮酮）对棉铃虫的存活率没有明显影响，而添加了露水草提取物（30%蜕皮酮）的核型多角体病毒HaNPV，可导致6龄棉铃虫死亡时间缩短，显效加快，大大提高杀虫效率，从而可以不仅降低老熟棉铃虫对当年作物的危害，而且减少化蛹率，对防控次年棉铃虫的爆发具有重要作用。

本发明提供的农药，用于3龄前幼虫的防治，分为三组，每组50只，一组饲喂露水草提取物（30%蜕皮酮）5mg /只，一组饲喂核型多角体病毒HaNPV2.0×10⁶PIB，一组为饲喂5mg露水草提取物（30%蜕皮酮）和2.0×10⁶ PIB核型多角体病毒，实验方法如前所述。如图1，仅饲喂露水草提取物的3龄棉铃虫48小时存活率为96.3％，对棉铃虫存活率影响较小；仅饲喂HaNPV 12小时的存活率为97.3％，48小时存活率为71％；但二者同时添加后，3龄棉铃虫在12小时的存活率下降为71％，48小时存活率为0。露水草提取物（30%蜕皮酮）显著提高了HaNPV杀灭3龄棉铃虫的效率， 缩短HaNPV导致的棉铃虫死亡时间，显效加快，大大减轻对作物危害。

为了确定本发明提供的农药的有效成分，采用蜕皮酮纯品（购买自Sigma-Aldrich公司，货号：H5142）和核型多角体病毒进行实验。分为两组，每组50只。图2可见，在第7天存活率出现显著差异。说明非常少量的纯品20E就能够加速病毒引起的棉铃虫死亡，露水草提取物能够发挥作用在于其中含有蜕皮酮。本发明提供的农药能够发挥作用的原理在于，蜕皮酮能够诱导病毒受体VHDLR的上调表达。我们的研究发现VHDLR 是该病毒感染的膜上受体，当沉默该基因或用抗体封闭时病毒无法感染宿主细胞。

实验方法：取6龄取食期幼虫40头，饥饿处理12h，喂食含有1×10⁸ PIB的核型多角体病毒HaNPV的饲料，饲料用量于12小时吃完。之后按照诱导时间分别取诱导0h、3h、6h、12h、18h、24h、36h和48h的幼虫各5头，收集血淋巴，提取RNA以及蛋白，实时定量PCR和Western blot 分别检测HaNPV诱导不同时间VHDLR的表达变化。相对表达量是实时定量通用2-△△Ct算法，然后除以对照组的相对倍数。

从图3实验结果可以看出：核型多角体病毒HaNPV感染能够诱导VHDLR的mRNA和蛋白上调表达。

基因沉默方法：利用体外合成的VHDLR双链RNA，取6龄末期幼虫20头，每组10头，注射VHDLR 双链RNA 2.5ug/5ul，对照组注射dsGFP；注射后24h，再注射双链RNA 2.5ug/5ul。2次干扰共48h，之后实验组和对照组分别取5头幼虫提取血淋巴RNA。每组剩下的5头幼虫同时注射HaNPV出芽病毒5ul，BV诱导12h后取血淋巴，200rcf 离心3min，弃上清，加1×PBS清洗3次，提取血细胞RNA，反转录后用qPCR和Western blot检测。相对表达量是实时定量通用2-△△Ct算法，然后除以对照组的相对倍数。

从图4实验结果可以看出：当VHDLR基因沉默时（图4A），实时定量PCR检测到病毒的F基因也随之下降（图4B），Western blot检测到VHDLR蛋白降低（图4C），病毒F蛋白也随之降低，结果和mRNA一致，说明病毒的感染依赖于VHDLR的表达。

抗体封闭方法：检测VHDLR兔抗IgG蛋白浓度，用PBS将其稀释成浓度不同的4组：0，5，10，50（μg/ml）；每组抗体取50µl，加入等量BV，4℃孵育10min；之后取4组棉铃虫6龄12h的幼虫，每组10头。分别注射10µl抗体-病毒混合物，于28℃恒温培养箱中饲育6h后取样，用于后续的检测。病毒感染率是显微镜下观察BV-F蛋白的荧光，有荧光的感染细胞数除以视野中的总数百分比。图5C为提取的是VHDLR不同抗体封闭后，等量病毒感染后血细胞中的总蛋白，然后检测了VHDLR的量和病毒marker蛋白BV-F的量。

从图5实验结果可以看出：A和B，抗体封闭VHDLR，病毒感染随着抗体浓度增加而减少；C. Western blot 从蛋白水平随着VHDLR抗体浓度的增加，病毒F在细胞中的蛋白量下降。

随着抗体浓度的增加，免疫组化结果检测到的病毒F的量随着降低（图5A）；病毒感染率和VHDLR抗体封闭浓度呈反比（图5B），Western blot检测到VHDLR蛋白虽然存在，但结合位点被抗体封闭，因而在细胞中的病毒F蛋白感染量也随之下降（图5C），说明VHDLR作为受体介导HaNPV对宿主细胞的感染。

VHDLR仅在棉铃虫体内蜕皮酮20E最高时的6龄72-96小时脂肪体和中肠组织中表达，其他发育时期，20E处于较低水平时VHDLR根本没有表达；蜕皮酮能够上调VHDLR的表达，蜕皮酮是典型的类固醇激素，20E受体由核受体EcR和USP形成，20E通过激活EcR-USP异源二聚体促进VHDLR的转录；当用RNA干扰技术分别沉默EcRB1或USP1时，20E不能够上调VHDLR的表达；20E还能够促进VHDLR的磷酸化促进和配体的结合。

6龄期20E处于高滴度，而VHDLR受体受20E上调，因而表达也较高，但病毒自身带有ecdysteroid UDP-glucosyltransferase，可以使20E失活。因而可以看出病毒在促进自身传播的同时又不至于使宿主立即死亡，达到最利于病毒生存的平衡。因而通过20E增加受体的表达，打破这种平衡，会导致由于受体过高表达使病毒的感染超过宿主的承受而加速死亡。

实施例2：

一种核型多角体病毒防治棉铃虫的农药的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）、用水溶解含有1.6-2.0Kg蜕皮酮的露水草提取物，混匀得到露水草提取物溶液；

（2）、将所述露水草提取物溶液和含有2.8×10¹²PIB-3.5×10¹²PIB核型多角体病毒的溶液混合，得到所述农药。

一种核型多角体病毒农药在生物防治棉铃虫中的应用。每亩施药方法为：将制备的核型多角体病毒农药进行稀释，将含有1.6-2.0Kg蜕皮酮和2.8×10¹²PIB-3.5×10¹²PIB核型多角体病毒的农药制备为500-1000mL，稀释为一定的体积例如20-30Kg混匀喷洒。