阅读说明：本技术 miR-995在鳞翅目害虫防治中的应用 (Application of miR-995 in lepidoptera pest control ) 是由 周紫章 刘庆信 赵云贺 于璇 于 2020-11-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了miR-995在鳞翅目害虫防治中的应用。本发明研究发现,过表达miR-995能够显著减小翅面积,并抑制翅的发育；进一步研究发现,其作用机制为：miR-995直接抑制Hippo信号通路靶基因diap1的表达,进而抑制翅的发育。本发明的miR-995能够显著抑制昆虫翅发育,通过人工合成miR-995或者其类似物,或利用表达miR-995的转基因植物,为RNAi介导的害虫生物防治提供重要的靶标基因资源。将对有翅目害虫的防治提供重要的理论和实践意义,同时具有显著的经济效益和社会效益。(The invention discloses application of miR-995 in lepidoptera pest control. The research of the invention finds that the wing area can be obviously reduced by over-expressing miR-995, and the development of wings can be inhibited; further research shows that the action mechanism is as follows: miR-995 directly inhibits the expression of the target gene flap 1 of the Hippo signaling pathway, thereby inhibiting the development of wings. The miR-995 can obviously inhibit the development of insect wings, and provides an important target gene resource for the biological control of pests mediated by RNAi by artificially synthesizing the miR-995 or an analogue thereof or by using a transgenic plant expressing the miR-995. Provides important theoretical and practical significance for preventing and controlling the winged pests and has obvious economic and social benefits.)

miR-995在鳞翅目害虫防治中的应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术及害虫防治领域，具体涉及miR-995在鳞翅目害虫防治中的应用。

背景技术

翅作为昆虫重要的器官，赋予了昆虫飞行的能力，增加了昆虫取食与交配的空间。目前，有翅目昆虫已成为农业害虫防治中的重点和难点，解析昆虫翅发育调控的分子机制，并寻找抑制翅发育的方法，将对有翅目害虫的防治提供重要的理论和实践意义。

MicroRNA(miRNA)是一类长度约为22nt的小分子非编码RNA，在动物进化中高度保守。miRNA通过识别靶基因mRNA 3’-UTR上的结合位点，引起靶基因的转录抑制或mRNA的降解，进而在转录及转录后水平调控靶基因的表达。研究表明，miRNA参与多种生物学过程，包括细胞分化、增殖、衰老、凋亡、迁移、侵袭、发育和信号转导等。

目前已从线虫、果蝇、小鼠和人的细胞中分离发现了上千种miRNAs，然而，与新miRNA的频频发现相比，miRNA的功能研究相对缓慢。虽然生物信息学的方法预测了一系列miRNAs与靶基因的作用，但是能给出直接证据证明miRNA的靶基因及其功能的miRNA却很少。因此，如何确定miRNA的功能已成为该领域中最艰巨和迫切的任务之一。

近年来，有文献报道miRNA参与调控昆虫翅发育的过程，其中，以果蝇研究最为广泛，有学者研究发现miR-iab-4及其反义链miR-iab-8能抑制超级双胸基因(Ultrabithorax，Ubx)的活性，进而控制翅与平衡棒之间的转换；miR-7通过负调控其靶基因yki的表达影响果蝇翅原基的发育；miR-9a通过抑制靶基因LIM-only的表达，引起翅组织缺失和异位细胞凋亡；miR-12和miR-283则通过调控Hedgehog信号通路引起翅发育畸形。在其他昆虫中，miRNA对翅发育的研究相对较少，通过对袖碟不同发育阶段miRNA表达水平的测序，发现miR-263、miR-193和miR-2788可能在翅发育过程中起潜在的调节作用。

miR-995是众多miRNA中的一员，目前有关miR-995功能的研究很少，miR-995调控昆虫翅发育更是未见有报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供miR-995在调控昆虫翅发育以及鳞翅目害虫防治中的应用。本发明研究发现，过表达miR-995能够显著减小果蝇成虫翅面积，并抑制翅的发育；进一步研究发现，其作用机制为：miR-995直接抑制Hippo信号通路diap1靶基因的表达，进而抑制翅的发育。

基于上述研究，本发明提出如下技术方案：

本发明的第一方面，提供miR-995在制备昆虫翅发育抑制剂中的应用。

优选的，所述昆虫为鳞翅目昆虫。

更优选的，所述鳞翅目昆虫为棉铃虫。

优选的，所述miR-995的核苷酸序列为5′-uagcaccaca ugauucggcu u-3′；(SEQ IDNO.1)。

优选的，所述miR-995通过抑制Hippo信号通路靶基因diap1的表达来抑制昆虫翅发育。

本发明的第二方面，提供miR-995在制备杀虫剂中的应用。

优选的，所述杀虫剂为鳞翅目昆虫杀虫剂。

上述应用中，所述杀虫剂能够抑制昆虫翅的发育，进而限制昆虫的取食和交配空间，降低其生存和繁殖力，实现害虫的生物防治。

本发明的第三方面，提供一种防治害虫的方法，所述方法包括以下步骤：

使害虫体内的miR-995过表达；

或者，将miR-995作为有效成分饲喂或喷施害虫。

优选的，所述害虫为鳞翅目昆虫；更优选的，所述鳞翅目昆虫为棉铃虫。

本发明的第四方面，提供一种昆虫翅发育抑制剂，所述昆虫翅发育抑制剂以有效量的miR-995作为活性成分。

本发明的第五方面，提供一种杀虫剂，所述杀虫剂中包含miR-995。

本发明的有益效果：

本发明首次研究发现，过表达miR-995能够显著减小翅面积，并抑制翅的发育。其作用机制为miR-995抑制Hippo信号通路的靶基因diap1的表达，进而抑制翅的发育。本发明的miR-995能够显著抑制昆虫翅发育，通过人工合成miR-995或者其类似物，或利用表达miR-995的转基因植物，为RNAi介导的害虫生物防治提供重要的靶标基因资源。miR-995抑制昆虫翅发育，限制有翅目害虫的取食和交配空间，能够降低其生存率和繁殖力，将对有翅目害虫的防治提供重要的理论和实践意义，同时具有显著的经济效益和社会效益。

附图说明：

图1：过表达miR-995对果蝇成虫翅面积的影响；图中，“En-gal4>UAS-GFP”表示的是En-gal4处女蝇与UAS-GFP雄蝇的杂交后代；“En-gal4>UAS-miR-995”表示的是En-gal4处女蝇与UAS-miR-995雄蝇的杂交后代。

图2：过表达miR-995对Hippo信号通路靶基因表达的影响。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，目前miRNA的功能研究相对缓慢，如何确定miRNA的功能已成为该领域中最艰巨和迫切的任务之一。虽然已有miRNA调节昆虫翅发育的报道，但由于不同miRNA的表达方式各不相同，功能及作用机制也可能存在显著差异。因此，发现新的调控昆虫翅发育的miRNA，对于有翅害虫的防治而言具有重要的理论和实践意义。

基于此，本发明对能够调控昆虫翅发育的miRNA进行了大量的筛选和深入的研究。结果发现，过表达miR-995能够显著减小翅面积，并抑制翅的发育。

进一步的，本发明还对miR-995抑制昆虫翅发育的作用机制进行了研究。在生物体的生长发育过程中，对组织器官的大小和体积的调控一直以来都是生物学研究的最根本问题之一。Hippo信号通路的发现开始对这一生物学难题进行解答。作为一条控制组织生长和细胞命运的信号通路，Hippo信号通路在进化上从节肢动物到哺乳动物高度保守。由此，本发明对miR-995与Hippo信号通路的作用关系进行了研究，结果发现，miR-995直接抑制Hippo信号通路靶基因diap1的表达，进而抑制翅的发育。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：

一、过表达miR-995显著减小果蝇翅面积

用在果蝇翅posterior(P)区特异表达的En-gal4处女蝇分别与UAS-GFP和UAS-miR-995雄蝇进行杂交，观察后代成虫翅表型。利用体视显微镜对翅进行拍照，并通过ImageJ软件测量P区和anterior(A)区的面积，计算P/A比值，和对照组相比较，并进行统计学分析。由于后代雄果蝇和雌果蝇的个体大小存在差异，因此本研究对雌、雄个体分别进行了统计，本研究结果只展示了雄果蝇成虫的翅及统计结果。

结果如图1所示，对照组P/A值为1.3，过表达miR-995后P/A值下降为0.7。进一步统计分析表明，与对照组果蝇相比，过表达miR-995显著减小翅P区的面积(图1A-C)。

二、过表达miR-995抑制Hippo通路靶基因表达

为了检测过表达miR-995是否调控Hippo信号通路活性，我们使用了diap-lacZ报告果蝇。diap1是Hippo通路的靶基因，diap1-lacZ能反映diap1基因的转录水平。利用En-gal4处女蝇分别与UAS-GFP和UAS-miR-995雄蝇进行杂交，对后代3龄幼虫进行解剖，利用甲醛对翅原基进行固定，用PBST进行漂洗3次，用lacZ抗体检测lacZ蛋白水平。和对照组比较(图2A-A”)，过表达miR-995显著降低diap1-lacZ的水平(图2B-B”)，同时也减小翅原基P区的面积。图2A中Ci蛋白表达的区域为A区，图2A’为翅原基中diap1-lacZ的表达水平，2A”为图2A和2A’的合并图。图2B中RFP区域为En-gal4表达的区域，同时也是miR-995过表达的区域，图2B’为翅原基中diap1-lacZ的表达水平，2B”为图2B和2B’的合并图。

果蝇作为模式昆虫，有自己的优势，目前在果蝇中已经形成了非常成熟的过表达和敲降gene的体系。gal4-UAS系统是目前常用的果蝇二元表达系统，其中，gal4是在酵母中发现的转录激活因子，可以与DNA序列中的特殊位点半乳糖上游激活序列(UAS)结合，诱导UAS下游基因的转录与翻译。利用分别带有gal4和UAS的转基因果蝇品系进行杂交，产生的后代可以条件性表达UAS序列所连接的目的基因。本研究就是借助于gal4-UAS系统。不同的gal4可以在不同区域启动基因的过表达，本研究使用的en-gal4就是在果蝇P区表达，既可以同一个翅的A和P区进行内部对照，也可以可野生型的进行比较。相比于其他非模式昆虫，采用的显微注射的办法过表达某基因，gal4-UAS过表达基因更持久稳定，没有机械损伤。本发明实施例中所采用的En-gal4处女蝇、UAS-GFP雄蝇和UAS-miR-995雄蝇均可通过常规的方法构建得到。

棉铃虫中Hippo信号通路多种元件已被鉴定，并被证实和果蝇中保守。因此推测，miR-995可以作为防治棉铃虫的潜在靶基因。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> miR-995在鳞翅目害虫防治中的应用

<130> 2020

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> Drosophila melanogaster

<400> 1

uagcaccaca ugauucggcu u 21