一种新型控蚜剂、RNAi与球孢白僵菌联合应用控蚜的方法
阅读说明：本技术 一种新型控蚜剂、RNAi与球孢白僵菌联合应用控蚜的方法 (Novel aphid control agent, RNAi (ribonucleic acid interference) and beauveria bassiana combined application aphid control method ) 是由 王进军 牛金志 张君 尚峰 叶超 张永军 于 2020-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及害虫防治和基因工程技术领域,公开了一种新型控蚜剂：包含蚜虫的dsRNA与球孢白僵菌孢子；还公开了一种RNAi与球孢白僵菌联合应用控蚜的方法,是采用所述的新型控蚜剂处理植株防治蚜虫。本发明将生防真菌和RNAi技术联合应用开发出一种新型的控蚜剂,该控蚜剂有显著的增效机制,能克服单独使用真菌或RNAi技术控蚜的缺陷,控蚜能力能达到80％。使用该新型控蚜剂直接在田间对农作物进行喷雾处理即可有效防治蚜虫。本发明适用范围广,只需要合成蚜虫的不同目标基因的dsRNA,就可以将相应的dsRNA与球孢白僵菌的孢子悬浮液混合一起进行喷雾处理,该方法可广泛应用于豌豆蚜、桃蚜以及褐色桔蚜等蚜虫。(The invention relates to the technical field of pest control and genetic engineering, and discloses a novel aphid control agent: dsRNA containing aphid and beauveria bassiana spore; also discloses a method for controlling aphids by combining RNAi and beauveria bassiana, which is to treat plants by adopting the novel aphid control agent to control aphids. The invention develops a novel aphid controlling agent by combining the biocontrol fungus and the RNAi technology, the aphid controlling agent has an obvious synergistic mechanism, can overcome the defect of controlling aphids by singly using the fungus or the RNAi technology, and the aphid controlling capacity can reach 80 percent. The novel aphid control agent can be directly used for spraying crops in the field to effectively control aphids. The method has wide application range, can mix the corresponding dsRNA with the spore suspension of the beauveria bassiana for spray treatment only by synthesizing the dsRNA of different target genes of the aphid, and can be widely applied to aphids such as pea aphid, peach aphid, brown orange aphid and the like.)
技术领域
本发明涉及害虫防治和基因工程技术领域，具体涉及一种新型控蚜剂、RNAi与球孢白僵菌联合应用控蚜的方法。
背景技术
蚜虫对植物的危害包括直接取食和传播病毒两个方面。目前，蚜虫的危害和抗药性在生产中日益严重，亟需研发新型控蚜策略和技术。球孢白僵菌Beauveria bassiana是一种应用广泛的生防微生物，其具有寄主范围广、防控毒力强等特点，在害虫防控中极具应用潜力。其中，球孢白僵菌在玉米螟、松毛虫上应用最为广泛。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来得到广泛使用的一种重要基因沉默手段，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、同源RNA高效特异性降解的现象，是通过dsRNA的介导特异性的降解对应序列的mRNA。由于使用RNAi技术可以特异性抑制特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和基因治疗领域。RNAi技术因特异性强、无污染、基因靶标多等优势，具有开发为“新一代杀虫剂”的潜力。
目前一般是单独采用白僵菌或者RNAi技术进行害虫防控，单独使用白僵菌存在真菌本身见效缓慢的问题。单独使用其中一种防治方法效果欠佳，未见有将两者联合起来防治蚜虫的报道。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种新型控蚜剂、RNAi与球孢白僵菌联合应用控蚜的方法。
本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
一种新型控蚜剂，包含蚜虫的dsRNA与球孢白僵菌孢子。
所述控蚜剂是蚜虫的dsRNA溶液与球孢白僵菌孢子悬浮液的混合溶液。
优选地，所述蚜虫的dsRNA是指蚜虫的gene4714基因、gene15782基因、gene20844基因中的一个或多个基因对应的dsRNA或多个dsRNA组合。
优选地，所述蚜虫是指豌豆蚜或桃蚜或褐色桔蚜。
进一步优选地，所述的dsRNA为Apds15782或Apds20844或Apds4714或Apds4714+Apds15782或Apds15782+Apds20844或Apds4714+Apds20844或Mpds4714+Mpds15782或Acds4714+Acds15782。
一种RNAi与球孢白僵菌联合应用控蚜的方法，是采用上述任一所述的新型控蚜剂处理植株防治蚜虫。
优选地，是采用上述的新型控蚜剂对植株进行喷雾处理，防治蚜虫。
本发明的有益效果是：本发明将生防真菌和RNAi技术联合应用开发出一种新型的控蚜剂，该控蚜剂有显著的增效机制，能克服单独使用真菌或RNAi技术控蚜的缺陷，控蚜能力能达到80％。使用该新型控蚜剂直接在田间对农作物进行喷雾处理即可有效防治蚜虫。本发明适用范围广，只需要合成蚜虫的不同目标基因的dsRNA，就可以将相应的dsRNA与球孢白僵菌的孢子悬浮液混合一起进行喷雾处理，该方法可广泛应用于豌豆蚜、桃蚜以及褐色桔蚜等蚜虫。
附图说明
图1是豌豆蚜Apgene4714、Apgene20844、Apgene15782单基因干扰与球孢白僵菌联合控蚜实验的豌豆蚜存活率曲线。
图2是豌豆蚜多基因干扰与球孢白僵菌联合控蚜实验的豌豆蚜存活率曲线。
图3是豌豆蚜虫尸保湿培养验证球孢白僵菌侵染实验结果。
图4是豌豆蚜Apgene14740、Apgene14741、Apgene16968和Apgene15105单基因干扰与球孢白僵菌联合控蚜实验的豌豆蚜存活率曲线。
图5是桃蚜双基因干扰与球孢白僵菌联合控蚜实验的桃蚜存活率曲线。
图6是褐色桔蚜双基因干扰与球孢白僵菌联合控蚜实验的褐色桔蚜存活率曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
主要试剂来源：
2×Taq Master Mix(近岸蛋白质科技有限公司,中国)
reagent(Invitrogen公司,美国)，胶回收纯化试剂盒(Takara公司,日本)
TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo fisherScientific公司，美国)，包含：
5×TranscrptAid Reaction Bμffer、TranscriptAid Enzyme Mix。
PrimeScriptTM RT Reagent Kit(Takara公司,日本)
实施例1
基于豌豆蚜转录组测序数据，分析在球孢白僵菌侵染0h、36h和72h共3个时间点的基因表达情况，并比对分析不同时间点的差异表达基因。感染球孢白僵菌Bb07的豌豆蚜转录组测序共获得567个差异基因，对这些差异表达基因进行NR注释，结果发现，与免疫和代谢相关的基因在36h vs 0h间大部分上调表达，而在72h vs 36h间这些基因大部分下调表达。因此，共筛选出7个靶标基因：Apgene4714、Apgene14740、Apgene14741、Apgene16968、Apgene15105、Apgene20844和Apgene15782。其中，Apgene4714为未鉴定基因，在36h和72h均显著上调；Apgene14740与Apgene14741是组织蛋白酶基因，KEGG分析显示其参与溶酶体通路；Apgene16968为表皮蛋白基因，在球孢白僵菌侵染昆虫时，昆虫表皮是第一道屏障；Apgene15105属于细胞色素P450家族基因，球孢白僵菌侵染昆虫会产生毒素，昆虫则需要通过解毒来抵御侵染；Apgene20844是锌指蛋白类基因，与昆虫的渗透压有关；Apgene15782是胰蛋白酶类丝氨酸蛋白酶基因，参与昆虫免疫反应。
实施例2豌豆蚜基因干扰与球孢白僵菌联合控蚜一、豌豆蚜dsRNA的合成按照如下步骤操作：
1)根据转录组数据，利用蚜虫在线数据库(https://bipaa.genouest.org/is/aphidbase/)得到豌豆蚜(学名：Acyrthosiphon pisum)Apgene4714，Apgene20844和Apgene15782基因的cDNA序列，设计含有T7启动子的Apgene4714，Apgene20844，Apgene15782基因特异性引物，上、下游引物序列分别为：
T7-Apgene4714-S1(SEQ ID NO:1):
TAATACGACTCACTATAGGGAAGACACCTAGTGGCTTGT；
T7-Apgene4714-A1(SEQ ID NO:2):
TAATACGACTCACTATAGGGTTGCAGCAGTGTTCAGATT；
T7-Apgene20844-S1(SEQ ID NO:3)：
TAATACGACTCACTATAGGGGGCATTTAGCAAATCATAC；
T7-Apgene20844-A1(SEQ ID NO:4)：
TAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCGAGAATACACTTT；
T7-Apgene15782-S1(SEQ ID NO:5)：
TAATACGACTCACTATAGGGCCGAAGACCAGAAGAAGAT；
T7-Apgene15782-A1(SEQ ID NO:6)：
TAATACGACTCACTATAGGGCGACTCTATCCGAAACTCC。
2)利用reagent按照使用说明书提取豌豆蚜的总RNA，然后利用反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit按照使用说明书将1μg总RNA反转录成为cDNA，反转录体系为20μl，其中包括：总RNA 1μl(约1μg)，5×PrimeScriptTM Bμffer 4μl，PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1μl，Oligo dT Primer(50μM)1μl，Random 6mers(100μM)1μl，RNase Free ddH2O 12μl。利用得到的cDNA分别扩增Apgene4714，Apgene20844和Apgene15782基因：
Apgene4714基因PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃条件下延伸10min。PCR反应体系共25μl，包括：浓度为1000ng/μl的cDNA模板1μl，浓度为0.15-0.25μM的上、下游引物各1μl，2×Taq Master Mix 12.5μl以及RNase Free ddH2O 9.5μl。
Apgene20844基因PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃条件下延伸10min。PCR反应体系与Apgene4714基因的一致。
Apgene15782基因PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃条件下延伸10min。PCR反应体系与Apgene4714基因的一致。
3)将步骤2)中的PCR产物用胶回收纯化试剂盒纯化回收之后作为合成dsRNA的转录模板，用体外合成RNA试剂盒TranscriptAid T7 HighYieldTranscription Kit按照使用说明书转录合成并纯化得到豌豆蚜上述基因的dsRNA溶液；dsRNA合成反应体系为20μl，其中包括：PCR回收产物2.5μl(约1μg)、5×TranscrptAid Reaction Bμffer 4μl、浓度为100mM的ATP/CTP/GTP/ΜTP Mix 8μl、TranscriptAid Enzyme Mix 2μl和DEPC-treatedH2O 3.5μl；反应条件为：37℃孵育6h。
同时利用上述方法合成并纯化得到GFP(绿色荧光蛋白)的dsRNA溶液作为阴性对照，步骤2)中扩增GFP基因使用的上、下游引物序列分别为：
GFP-ds-T7F(SEQ ID NO:7)：
TAATACGACTCACTATAGGGCAGTTCTTGTTGAATTAGATG；
GFP-ds-T7R(SEQ ID NO:8)：
TAATACGACTCACTATAGGGTTTGGTTTGTCTCCCATGATG。
得到的豌豆蚜Apgene4714，Apgene20844和Apgene15782基因的dsRNA序列如下：
Apgene4714基因的dsRNA序列(Apds4714,SEQ ID NO:9)：
AAGACACCTAGTGGCTTGTATGAATCATCCGCTCATCGATATTTATTTTGTCCTATAAAAGAGCAAGTCTAACACTCCGTAACACATAGTCTACCTTACAATTGTCGAAATAACTCTATCAACTCACAATTCAAGAGTTAACGTTTAAACAACTACAACATCAACATGAATCGTAACTTGTCTTTGTTTCTTTTGGTCGTCGCAGTGGTTTTGCTGGTCGCAGCCACAACGATCGATGCAGAGTGTCGCTGGCTCGACTGCCATGCACATTCGGCCGGCGACTGGTGCAACATTCTTGGACCCGGCTGGAAGGTGAAGAATTGGCGACGGTGTAACGGATTGCTTGGAAAATCTGAACACTGCTGCAA。
Apgene20844基因的dsRNA序列(Apds20844,SEQ ID NO:10)：
GGCATTTAGCAAATCATACTAAGGCCCATGCCAGAAAAAATTCATATATATGTGATATCTGTAATAAAGTTTTTGATCAAAAATGGTATTTAAAATGCCATATGAGGACACATACTGCAGAAAAATCTTATAAATGTGATATTTGTAATAAACTATATTCTCGAAAAGATAGTTTAAAAACTCATAAAAAGATACATATTGGAGAAAAGACATTTAAATGTGATGTCTGTGGTAAAGGATTTTATCAAGCACAACAATTAAGAGGCCACGTGAGAACACATACTGGAGAAAAACCGTATCAATGTGAAATCTGTGGTAGATTATTTAATCAAACATCAAATTTAAGAAACCACAGAATTACACATACTGGAATAAAGTCGTATTCATGTGACATCTGTAATAAAGTGTATTCTCGACCAG。Apgene15782基因的dsRNA序列(Apds15782,SEQ ID NO:11)：
CCGAAGACCAGAAGAAGATTATGTGAGCAAGAGTGCAAGAAATTGTAATGCTTTCCCAGAAAGTATTAGCACTAATAATCATCTTGATATATGTAAGTTCGTTGCTTTAGAACCAATAGTATGCTGTCCGGCGATGACTAATGAACCGTTTATAGAAAAACCAGAAAGTAATAATGAAAATTCAATATCCGCCGATAAAAAATGTCATGATTATTTCAAATTAAAGCACAAAATTCAAAGTGAGGTGCCATTTGAGTCTCAGTTACCTCCGTTGCCAGTTGTGGGTGGCATACCGGCTAACATAAAACAGTTTCCACATATGGCGCTGATAGGCTATGGTGACACCACAGCAGATGGAGAGGATTGGAGATGCGGAGGTTCGCTGATAAGCGAAAGATGGATATTATCTGCAGCGCACTGTCAACAGAGTTCTGGGAATCTGGTGGCTCGTTGGGTTCGCCTCGGAGTTTCGGATAGAGTCG。
GFP基因的dsRNA序列(dsGFP,SEQ ID NO:12)：
CAGTTCTTGTTGAATTAGATGGCGATGTTAATGGGCAAAAATTCTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAATTTTATTTGCACTACTGGGAAGCTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTCTCAAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTACAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAAATGGAATACAACTATAACTCACATAATGTATACATCATGGGAGACAAACCAAA。
二、球孢白僵菌孢子悬浮液的配制
培养球孢白僵菌：取从桃蚜中分离得到的球孢白僵菌菌种Bb07(西南大学生物技术中心生防微生物创新团队惠赠，本实验室保存)，采用PDA培养基，在温度为25±1℃，相对湿度为75％-80％的条件下培养。
取15ml无核酸酶离心管若干，1.5ml无核酸酶离心管若干，过滤纱布若干，刮孢器1个，镊子1个，0.05％Tween 80 100ml，无核酸酶黄色和蓝色枪头各1盒，然后放置高压灭菌锅中，120℃灭菌15-20min，灭菌后1-2小时内使用。将高压灭菌锅灭菌的器具放在超净工作台中和工作台一起灭菌10-15分钟，然后用75％的酒精擦拭双手。取适量的0.05％Tween 80于15ml无核酸酶离心管中，然后取适量的培养10-14天的球孢白僵菌于0.05％Tween 80中，通过涡旋震荡仪将孢子从菌丝上洗下来，溶在0.05％Tween 80中；将充分震荡的孢子悬浮液通过纱布将菌丝以及培养基残体过滤掉，留下孢子悬浮液；然后将孢子悬浮液进行比例稀释(5倍/10倍)，利用血球计数板计数，每次计数数3次求均值，最后按照公式计算原始球孢白僵菌孢子悬浮液孢子浓度，并稀释至所需要使用的浓度以备用。
三、利用喷雾塔将dsRNA和球孢白僵菌孢子悬浮液的混合液接种至豌豆蚜
按照如下步骤操作：
(1)稀释前面合成的dsRNA至所需浓度，将得到的球孢白僵菌孢子悬浮液稀释至2×109孢子/ml。共设置如下实验组：
0.05％Tween 80组：1ml 0.05％Tween 80+1ml无核酸酶水；
Bb07组：1ml孢子悬浮液(2×109孢子/ml Bb07)+1ml无核酸酶水；
dsGFP组：1ml 0.05％Tween 80+1ml dsGFP(2004ng/μl)；
dsGFP+Bb07：1ml dsGFP(2004ng/μl)+1ml孢子悬浮液(2×109孢子/ml Bb07)；
Apds4714组：1ml 0.05％Tween 80+1ml Apds4714(2004ng/μl)；
Apds4714+Bb07：1ml Apds4714(2004ng/μl)+1ml孢子悬浮液(2×109孢子/mlBb07)；
Apds20844组：1ml 0.05％Tween 80+1ml Apds20844(2004ng/μl)；
Apds20844+Bb07：1ml Apds20844(2004ng/μl)+1ml孢子悬浮液(2×109孢子/mlBb07)；
Apds15782组：1ml 0.05％Tween 80+1ml Apds15782(2004ng/μl)；
Apds15782+Bb07：1ml Apds15782(2004ng/μl)+1ml孢子悬浮液(2×109孢子/mlBb07)；
Apds4714+Apds15782：1ml 0.05％Tween 80+500μl Apds4714(4008ng/μl)+500μlApds15782(4008ng/μl)；
Apds4714+Apds20844：1ml 0.05％Tween 80+500μl Apds4714(4008ng/μl)+500μlApds20844(4008ng/μl)；
Apds15782+Apds20844：1ml 0.05％Tween 80+500μl Apds15782(4008ng/μl)+500μl Apds20844(4008ng/μl)；
Apds4714+Apds15782+Bb07：1ml孢子悬浮液(2×109孢子/ml Bb07)+500μlApds4714(4008ng/μl)+500μl Apds15782(4008ng/μl)；
Apds4714+Apds20844+Bb07：1ml孢子悬浮液(2×109孢子/ml Bb07)+500μlApds4714(4008ng/μl)+500μl Apds20844(4008ng/μl)；
Apds15782+Apds20844+Bb07：1ml孢子悬浮液(2×109孢子/ml Bb07)+500μlApds15782(4008ng/μl)+500μl Apds20844(4008ng/μl)。
(2)准备实验用豌豆蚜：取干净的一次性培养皿，剪取便利贴粘性部分，并将便利贴粘性区域朝上固定在培养皿底部，挑取40头豌豆蚜成蚜，背部朝上固定于便利贴粘性区域。每个实验组3个培养皿。
(3)喷雾处理和饲养：取前面制备好的实验组溶液各2ml，将粘有豌豆蚜的培养皿放在Potter喷雾塔托盘上，使用Potter喷雾塔(英国BURKARD精密实验室喷雾塔Potter)进行喷雾处理；静置30min后，将处理过的蚜虫从培养皿上取下转移至纱笼中的新鲜蚕豆苗植株上，在于25±1℃、湿度85±10％和光照:黑暗＝14h:10h的条件下饲养，每隔12h记录豌豆蚜生存状态至168h。所述的纱笼是在每株蚕豆苗盆栽外罩上由PVC材料和纱网共同组成的自制纱笼，以防止豌豆蚜逃逸。
四、存活率以及表型观察：
1、豌豆蚜单基因干扰与球孢白僵菌Bb07联合控蚜评估
结果如图1所示，Apds4714+Bb07、Apds15782+Bb07和Apds20844+Bb07分别与Bb07组相比，开始死亡的时间点没有提前，但168h累积死亡率中，Apds15782+Bb07(p＝0.0471)和Apds20844+Bb07(p＝0.0106)分别与Bb07组相比具有显著性差异，Apds4714+Bb07与Bb07组相比不存在显著性差异(p＝0.3175)，但具有协同增效趋势。
2、豌豆蚜多基因干扰与球孢白僵菌Bb07联合控蚜评估
结果如图2所示，处理12h后，Apds4714+Apds15782+Bb07以及Apds4714+Apds20844+Bb07处理组开始出现死亡，且在24h后，Apds4714+Apds15782+Bb07，Apds15782+Apds20844+Bb07以及Apds4714+Apds20844+Bb07处理组均比处理组Bb07组存活率更低，在168h后，Apds4714+Apds15782+Bb07，Apds15782+Apds20844+Bb07，Apds4714+Apds20844+Bb07，Bb07组，dsGFP+Bb07各组的累积存活率如下：17.903％,39.339％,23.256％,46.215％,42.742％，通过数据发现，一方面RNAi加球孢白僵菌的方法可以使蚜虫致死效率更快，且最后的累积存活率更低(即死亡率更高)，与单独使用球孢白僵菌相较而言，死亡率最多的提升了28.3％。同时，通过将虫尸保湿培养发现，虫尸表面确实长满了菌丝(如图3)，证明豌豆蚜是被球孢白僵菌侵染致死。
针对豌豆蚜里筛选出来的“Apds4714+Apds15782+Bb07”组合效果最优，因此在褐色桔蚜和桃蚜里也开展了联合控蚜评估试验。
实施例3豌豆蚜其它基因干扰试验
按照实施例2的方法对豌豆蚜Apgene14740、Apgene14741、Apgene16968和Apgene15105基因也进行了实验，合成了相应的dsRNA，并设置实验组合：
Apds14740组：1ml 0.05％Tween 80+1ml Apds14740(2004ng/μl)；
Apds14740+Bb07：1ml Apds14740(2004ng/μl)+1ml孢子悬浮液(2×109孢子/mlBb07)；
Apds14741组：1ml 0.05％Tween 80+1ml Apds14741(2004ng/μl)；
Apds14741+Bb07：1ml Apds14741(2004ng/μl)+1ml孢子悬浮液(2×109孢子/mlBb07)；
Apds15105组：1ml 0.05％Tween 80+1ml Apds15105(2004ng/μl)；
Apds15105+Bb07：1ml Apds15105(2004ng/μl)+1ml孢子悬浮液(2×109孢子/mlBb07)；
Apds16968组：1ml 0.05％Tween 80+1ml Apds16968(2004ng/μl)；
Apds16968+Bb07：1ml Apds16968(2004ng/μl)+1ml孢子悬浮液(2×109孢子/mlBb07)。
实验结果如图4所示，对Apgene14740、Apgene14741、Apgene16968和Apgene15105基因进行干扰或者与球孢白僵菌Bb07联合控蚜并不能显著地降低豌豆蚜成活率。
实施例4桃蚜双基因干扰与球孢白僵菌联合控蚜一、桃蚜dsRNA的合成
按照实施例2中豌豆蚜dsRNA的合成方法来合成桃蚜Mpgene4714和Mpgene15782基因的dsRNA：Mpgene4714和Mpgene15782基因的特异性引物，上、下游引物序列分别为：T7-Mpgene4714-S1(SEQ ID NO:13):
TAATACGACTCACTATAGGGACTGCCATGCACATTCAGC；
T7-Mpgene4714-A1(SEQ ID NO:14):
TAATACGACTCACTATAGGGTTAAACGAGTCGTAGTGTCTT；
T7-Mpgene15782-S1(SEQ ID NO:15):
TAATACGACTCACTATAGGGCCCATTTGTCTCAACTCAG；
T7-Mpgene15782-A1(SEQ ID NO:16):
TAATACGACTCACTATAGGGTTCCAGGTGTATCCTTGTC。
Mpgene4714基因的PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃条件下延伸10min。
Mpgene15782基因的PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃条件下延伸10min。
其余步骤(包括PCR反应体系、dsRNA合成反应体系和反应条件等)与实施例2相同。Mpgene4714基因的dsRNA序列为(Mpds4714,SEQ ID NO:17)：
ACTGCCATGCACATTCAGCCGGCAACTGGTGCAACATACTCGGACCCGGCTGGAAGGTCAAAACTTGGAGACGTTGTAACGGTTTGCTGGGAAAATCTGAACAGTGCTGCAAATGATAACATTTTTTAGTGTTTATTTTTTTCGTATACTTATAACTCTGTATGTTTATATACCTACATATTTGATACCAGTGCATACGATATGTTGTAAGACACTACGACTCGTTTAA。
Mpgene15782基因的dsRNA序列为(Mpds15782,SEQ ID NO:18)：
CCCATTTGTCTCAACTCAGATCCATATTTAACACCAATAAAACAGATAGTTACTGGTTGGGGAAGAATTTCAACGGCTGGACCACTTAGTGATAATTTGTTAAAAGTGGATTTGGATATTTTTCCGGTGAATCGGTGTAATGAAAGTTATTTTTCATATAATAATCAAAAATTACGGTTTGGCATACTACCCGACAGCATGATATGTGCGGGTTCGTTTGATGGTGAAAGAGACGGTTGTTCGGTACGAACTATGAAAGTTGGTGATTCAGGAGGTCCACTTCAATTAGAACATGTCAACTACGGGGGCATGTATACACAATACGGGATTACATCTTTTGGGAAATTTTGTGCTGACAAGGATACACCTGGAA。
二、基因干扰与球孢白僵菌联合控蚜
按照实施例2中的方法配制球孢白僵菌孢子悬浮液、配制多个实验组溶液对桃蚜利用Potter喷雾塔进行喷雾处理。实验组合如下：
Mpds4714+Mpds15782：1ml 0.05％Tween 80+500μl Mpds4714(4008ng/μl)+500μlMpds15782(4008ng/μl)；
Mpds4714+Mpds15782+Bb07：1ml孢子悬浮液(2×109孢子/ml Bb07)+500μlMpds4714(4008ng/μl)+500μl Mpds15782(4008ng/μl)。
桃蚜双基因干扰联合Bb07结果如图5所示，4个对照组(0.05％Tween 80、dsGFP组、Bb07组和dsGFP+Bb07)的168h累积存活率正常，分别为88.0％、87.5％、55.0％和57.5％。在Mpds4714+Mpds15782中，桃蚜存活率于72h呈下降趋势，168h累积存活率为69.0％；Mpds4714+Mpds15782与dsGFP组相比具有显著性差异(p＝0.0196)。在Mpds4714+Mpds15782+Bb07中，桃蚜存活率于48h呈下降趋势，168h累积存活率为12.5％，与Bb07组相比，蚜虫初始死亡时间一致，但其累积存活率降低42.5％。Mpds4714+Mpds15782+Bb07与Bb07组相比具有极显著性差异(p＝0.0004)。
实施例5褐色桔蚜双基因干扰与球孢白僵菌联合控蚜一、褐色桔蚜dsRNA的合成
按照实施例2中豌豆蚜dsRNA的合成方法来合成褐色桔蚜Acgene4714和Acgene15782基因的dsRNA：Acgene4714和Acgene15782基因的特异性引物，上、下游引物序列分别为：
T7-Acgene4714-S1(SEQ ID NO:19):
TAATACGACTCACTATAGGGATGAATCGCAACTTGTCTA；
T7-Acgene4714-A1(SEQ ID NO:20):
TAATACGACTCACTATAGGGCCCAACAATCCGTTACACC；
T7-Acgene15782-S1(SEQ ID NO:21):
TAATACGACTCACTATAGGGCCGATAATGGCTAATGGAC；
T7-Acgene15782-A1(SEQ ID NO:22):
TAATACGACTCACTATAGGGTTGTAAAGCGAAGGTGGTT。
Acgene4714基因的PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃条件下延伸10min。
Acgene15782基因的PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃条件下延伸10min。
其余步骤(包括PCR反应体系、dsRNA合成反应体系和反应条件等)与实施例2相同。
Acgene4714基因的dsRNA序列为(Acds4714,SEQ ID NO:23)：
ATGAATCGCAACTTGTCTATGTTTCTTTTGGTCGCCGCGTTGGTTTTGCTGGTTGCAACCACAATGATCGATGCTGAGTGCCGCTGGCTGGACTGCCACGCACATTCAGCTGGCGACTGGTGCAACATACTTGGACCCGGTTGGAGGATCAAATCTTGGCGTCGGTGTAACGGATTGTTGGG。
Acgene15782基因的dsRNA序列为(Acds15782,SEQ ID NO:24)：
CCGATAATGGCTAATGGACCGTTAATTGCAGAAAATAATAAAGACAATTTAATAACTGTCGATAAAAAATGTAATGAATATTTCAAATTAGCGAATAGAATTCAATCTAAAACTATATCGAGTATTCAGTCTGCTGATGATGGTCCGTATTCAGCTGTGGGTGGTACACCAGCTAACATAAAGCAGTTTCCACACATGGCACTAATAGGATTTGGTGAAAACACAGAAGATAGTGAGGATTGGAGATGTGGGGGCTCGCTGATCAGCGAAAGGTGGATATTGACGGCAGCGCACTGTCAACAAACGAATTCAGGGAGTATGGCTCGTTGGGCTCGCCTCGGAGTTACAGACAGAGTCATTAATAAAGACAGTATAGTTCAGCCAAAAGACTATCGAATAATGCATCATGAAATACATCCTGATTACAAACCACCTTCGCTTTACAA。
二、基因干扰与球孢白僵菌联合控蚜
按照实施例2中的方法配制球孢白僵菌孢子悬浮液、配制多个实验组溶液对褐色桔蚜利用Potter喷雾塔进行喷雾处理。
褐色桔蚜双基因干扰联合Bb07结果如图6显示，4个对照组(0.05％Tween 80、dsGFP组、Bb07组和dsGFP+Bb07)的168h累积存活率正常，分别为90.2％、89.9％、71.1％和70.7％。在Acds4714+Acds15782中，褐色桔蚜存活率于24h呈下降趋势，168h累积存活率为78.3％；Acds4714+Acds15782与dsGFP组无显著性差异(p＝0.1691)。在Ac4714+Acds15782+Bb07中，褐色桔蚜存活率于24h呈下降趋势，168h累积存活率为19.0％，与Bb07组相比，蚜虫初始死亡时间一致，但其累积存活率降低52.1％；Acds4714+Acds15782+Bb07与Bb07组相比具有极显著性差异(p＝0.0006)。
实施例6田间应用一、参照实施例2的方法，配制豌豆蚜dsRNA+Bb07的混合溶液，对要防治豌豆蚜的植株进行喷雾处理，dsRNA+Bb07的混合溶液可以是如下组合中的一种：Apds4714+Bb07，Apds15782+Bb07，Apds20844+Bb07，Apds4714+Apds15782+Bb07，Apds15782+Apds20844+Bb07，Apds4714+Apds20844+Bb07。
二、参照实施例4的方法，配制桃蚜dsRNA+Bb07的混合溶液，对要防治桃蚜的植株进行喷雾处理，dsRNA+Bb07的混合溶液可以采用Mpds4714+Mpds15782+Bb07。
三、参照实施例5的方法，配制褐色桔蚜dsRNA+Bb07的混合溶液，对要防治褐色桔蚜的植株进行喷雾处理，dsRNA+Bb07的混合溶液可以采用Acds4714+Acds15782+Bb07。
序列表
<110> 西南大学
<120> 一种新型控蚜剂、RNAi与球孢白僵菌联合应用控蚜的方法
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
taatacgact cactataggg aagacaccta gtggcttgt 39
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taatacgact cactataggg ttgcagcagt gttcagatt 39
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taatacgact cactataggg ggcatttagc aaatcatac 39
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
taatacgact cactataggg ctggtcgaga atacacttt 39
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taatacgact cactataggg ccgaagacca gaagaagat 39
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
taatacgact cactataggg cgactctatc cgaaactcc 39
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
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taatacgact cactataggg cagttcttgt tgaattagat g 41
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
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taatacgact cactataggg tttggtttgt ctcccatgat g 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aagacaccta gtggcttgta tgaatcatcc gctcatcgat atttattttg tcctataaaa 60
gagcaagtct aacactccgt aacacatagt ctaccttaca attgtcgaaa taactctatc 120
aactcacaat tcaagagtta acgtttaaac aactacaaca tcaacatgaa tcgtaacttg 180
tctttgtttc ttttggtcgt cgcagtggtt ttgctggtcg cagccacaac gatcgatgca 240
gagtgtcgct ggctcgactg ccatgcacat tcggccggcg actggtgcaa cattcttgga 300
cccggctgga aggtgaagaa ttggcgacgg tgtaacggat tgcttggaaa atctgaacac 360
tgctgcaa 368
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<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列
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ggcatttagc aaatcatact aaggcccatg ccagaaaaaa ttcatatata tgtgatatct 60
gtaataaagt ttttgatcaa aaatggtatt taaaatgcca tatgaggaca catactgcag 120
aaaaatctta taaatgtgat atttgtaata aactatattc tcgaaaagat agtttaaaaa 180
ctcataaaaa gatacatatt ggagaaaaga catttaaatg tgatgtctgt ggtaaaggat 240
tttatcaagc acaacaatta agaggccacg tgagaacaca tactggagaa aaaccgtatc 300
aatgtgaaat ctgtggtaga ttatttaatc aaacatcaaa tttaagaaac cacagaatta 360
cacatactgg aataaagtcg tattcatgtg acatctgtaa taaagtgtat tctcgaccag 420
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccgaagacca gaagaagatt atgtgagcaa gagtgcaaga aattgtaatg ctttcccaga 60
aagtattagc actaataatc atcttgatat atgtaagttc gttgctttag aaccaatagt 120
atgctgtccg gcgatgacta atgaaccgtt tatagaaaaa ccagaaagta ataatgaaaa 180
ttcaatatcc gccgataaaa aatgtcatga ttatttcaaa ttaaagcaca aaattcaaag 240
tgaggtgcca tttgagtctc agttacctcc gttgccagtt gtgggtggca taccggctaa 300
cataaaacag tttccacata tggcgctgat aggctatggt gacaccacag cagatggaga 360
ggattggaga tgcggaggtt cgctgataag cgaaagatgg atattatctg cagcgcactg 420
tcaacagagt tctgggaatc tggtggctcg ttgggttcgc ctcggagttt cggatagagt 480
cg 482
<210> 12
<211> 436
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cagttcttgt tgaattagat ggcgatgtta atgggcaaaa attctctgtc agtggagagg 60
gtgaaggtga tgcaacatac ggaaaactta cccttaattt tatttgcact actgggaagc 120
tacctgttcc atggccaaca cttgtcacta ctttctctta tggtgttcaa tgcttctcaa 180
gatacccaga tcatatgaaa cagcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg 240
tacaggaaag aactatattt tacaaagatg acgggaacta caagacacgt gctgaagtca 300
agtttgaagg tgataccctt gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgat tttaaagaag 360
atggaaacat tcttggacac aaaatggaat acaactataa ctcacataat gtatacatca 420
tgggagacaa accaaa 436
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<212> DNA
<213> 人工序列
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taatacgact cactataggg actgccatgc acattcagc 39
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<213> 人工序列
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taatacgact cactataggg ttaaacgagt cgtagtgtct t 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
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taatacgact cactataggg cccatttgtc tcaactcag 39
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
taatacgact cactataggg ttccaggtgt atccttgtc 39
<210> 17
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
actgccatgc acattcagcc ggcaactggt gcaacatact cggacccggc tggaaggtca 60
aaacttggag acgttgtaac ggtttgctgg gaaaatctga acagtgctgc aaatgataac 120
attttttagt gtttattttt ttcgtatact tataactctg tatgtttata tacctacata 180
tttgatacca gtgcatacga tatgttgtaa gacactacga ctcgtttaa 229
<210> 18
<211> 373
<212> DNA
<213> 人工序列
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cccatttgtc tcaactcaga tccatattta acaccaataa aacagatagt tactggttgg 60
ggaagaattt caacggctgg accacttagt gataatttgt taaaagtgga tttggatatt 120
tttccggtga atcggtgtaa tgaaagttat ttttcatata ataatcaaaa attacggttt 180
ggcatactac ccgacagcat gatatgtgcg ggttcgtttg atggtgaaag agacggttgt 240
tcggtacgaa ctatgaaagt tggtgattca ggaggtccac ttcaattaga acatgtcaac 300
tacgggggca tgtatacaca atacgggatt acatcttttg ggaaattttg tgctgacaag 360
gatacacctg gaa 373
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
taatacgact cactataggg cccaacaatc cgttacacc 39
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
taatacgact cactataggg ccgataatgg ctaatggac 39
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taatacgact cactataggg ttgtaaagcg aaggtggtt 39
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<213> 人工序列
<400> 23
atgaatcgca acttgtctat gtttcttttg gtcgccgcgt tggttttgct ggttgcaacc 60
acaatgatcg atgctgagtg ccgctggctg gactgccacg cacattcagc tggcgactgg 120
tgcaacatac ttggacccgg ttggaggatc aaatcttggc gtcggtgtaa cggattgttg 180
gg 182
<210> 24
<211> 446
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ccgataatgg ctaatggacc gttaattgca gaaaataata aagacaattt aataactgtc 60
gataaaaaat gtaatgaata tttcaaatta gcgaatagaa ttcaatctaa aactatatcg 120
agtattcagt ctgctgatga tggtccgtat tcagctgtgg gtggtacacc agctaacata 180
aagcagtttc cacacatggc actaatagga tttggtgaaa acacagaaga tagtgaggat 240
tggagatgtg ggggctcgct gatcagcgaa aggtggatat tgacggcagc gcactgtcaa 300
caaacgaatt cagggagtat ggctcgttgg gctcgcctcg gagttacaga cagagtcatt 360
aataaagaca gtatagttca gccaaaagac tatcgaataa tgcatcatga aatacatcct 420
gattacaaac caccttcgct ttacaa 446