基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针及其制备方法与应用 (Purine matrix-based zinc ion detection fluorescent probe and preparation method and application thereof ) 是由 戴玄吏 方燕飞 那晶晶 谢英梅 王仲阳 董慧莹 于 2021-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针该荧光探针其结构式如下式Ⅰ所示。本发明还公开了基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针的制备方法：以嘌呤衍生物和色酮-3-甲醛为荧光基团,水合肼为连接基团。本发明还公开了基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针在检测溶液中锌离子的应用。所制备的荧光探针对溶液中Zn～(2+)表现出高灵敏度和高选择性,本发明的探针还可以以固体状态检测锌离子；该荧光探针制备方法步骤简单,原料易得,所得产品为固体粉末,易于存储,具有广阔的应用前景。(The invention discloses a purine matrix-based zinc ion detection fluorescent probe, which has a structural formula shown as the following formula I. The invention also discloses a preparation method of the purine matrix-based zinc ion detection fluorescent probe, which comprises the following steps: purine derivatives and chromone-3-formaldehyde are used as fluorescent groups, and hydrazine hydrate is used as a connecting group. The invention also discloses application of the purine matrix-based zinc ion detection fluorescent probe in detection of zinc ions in a solution. Prepared fluorescent probe is directed to Zn in solution 2+ The probe shows high sensitivity and high selectivity, and can detect zinc ions in a solid state; the preparation method of the fluorescent probe is simple in steps, raw materials are easy to obtain, and the obtained product is solid powder, is easy to store and has a wide application prospect.)
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
锌离子(Zn2+)具有良好的配位作用，是人体内第二丰富的过渡金属离子，广泛分布于人体细胞核体液中。Zn2+在神经生物学领域非常受关注，其在生物体系中的酶促反应、DNA合成等生命过程起到了重要作用。不过，过量的Zn2+会引起癫痫、帕金森病、缺血性中风与婴幼儿腹泻等神经系统疾病。因此，对游离锌离子的选择性识别和有效检测，对于化学、生物学、临床医学和农学等领域的相关研究具有重要的意义。
目前常用的锌离子检测方法包括原子吸收光谱法(AAS)，原子发射光谱法(AES)，电感耦合等离子体质量探针和电化学方法等，但是这些测试方法价格昂贵，样品预处理比较复杂，测量时间相对较长以及需要专业的操作人员。然而，荧光探针具有设计简单、易于操作、高灵敏度等诸多优点而广泛应用。至今为止，已有许多有锌离子荧光探针的报道，但是设计与制备高选择性、高灵敏度的荧光探针仍然是环境与生命科学研究热点。
发明内容
本发明的目的之一在于克服现有技术中存在的缺陷，提供了一种基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针，该荧光探针化合物对锌离子具有专一性识别，响应时间短，灵敏度高等优点。
为了实现上述技术效果，本发明的技术方案为：一种基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针，其结构式如下式I所示：
本发明的目的之二在于提供基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
S1、4,6-二氯-5-氨基嘧啶和1-萘胺通过取代反应得到式II中间体；
S2：式II中间体和1-萘甲酸为原料，于有机溶剂中进行反应，得到式III中间体；
S3：将式III中间体溶于有机溶剂中与水合肼反应，得到式IV中间体；
S4：将式IV中间体和色酮-3-甲醛通过缩合反应得到基于嘌呤母体的荧光探针I即为基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针；
其反应路线如下所示：
其中，所述S1为：4,6-二氯-5-氨基嘧啶、1-萘胺加入到有机溶剂甲醇中，待溶解后加入浓盐酸，回流搅拌，待反应完全后，减压蒸馏除去有机溶剂，用NaOH溶解，然后用乙酸乙酯进行萃取，减压蒸馏除去乙酸乙酯，最后用甲醇与水重结晶，烘干后得到式II中间体。
其中，所述S2为：式II中间体、1-萘甲酸、多聚磷酸、十二烷基三甲基氯化铵分别溶于三氯氧磷中，进行回流搅拌，待反应完全后，将反应液冷却至室温后，减压蒸馏除去有机溶剂，在冰水浴条件下，向反应体系中加入冰水混合物，通过柱层析方法，使用MeOH/DCM(v/v, 1/250)纯化洗脱，烘干后得到式III中间体。
其中，所述S3为：式III中间体溶于乙醇中，待固体全部溶解后，加入水合肼，进行加热搅拌，待反应完全后，将反应物冷却至室温，抽滤，用有机溶剂洗固体，烘干得到IV式中间体。
其中，所述S4为：式IV中间体和色酮-3-甲醛溶解于有机溶剂乙醇中，将混合物料回流搅拌，待反应完全后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物进行重结晶纯化，烘干后得到荧光探针I。
作为优选，本发明的荧光探针的合成路线如下图所示：
其中，式II中间体为6-氯-N4-（萘-1-基）嘧啶-4,5-二胺，式III中间体为6-氯-9-（萘-1-基）-8-（萘环-1-基）-9H-嘌呤，式IV中间体为6-肼基-9-（萘-1-基）-8-（萘环-1-基）-9H-嘌呤，式I化合物（E）-3-（（2-（8,9-二（萘-1-基）-9H-嘌呤-6-基）腙）甲基）-4H-铬-4-酮为本发明所述检测锌离子荧光探针化合物。
进一步地，所述制备过程包括：
S1、制备式II中间体
将4,6-二氯-5-氨基嘧啶和1-萘胺分别加入到有机溶剂甲醇中，待溶解后加入浓盐酸，在65 ℃下回流搅拌，待反应完全后，减压蒸馏除去有机溶剂，用1MNaOH溶解，然后用乙酸乙酯进行萃取，减压蒸馏除去乙酸乙酯，用甲醇与水重结晶，得到式II中间体。
S2、制备式Ⅲ中间体
将所述式II中间体、1-萘甲酸、多聚磷酸、十二烷基三甲基氯化铵溶于三氯氧磷中，在80 ℃下回流搅拌，待反应完全后将反应液冷却至室温后，减压蒸馏除去有机溶剂，在0～5 ℃冰水浴下向反应体系中加入冰水混合物，MeOH/DCM (v/v，1/250)洗脱，减压蒸馏除去溶剂后得到III中间体。
S3、制备IV式中间体
将所述式III中间体溶于乙醇后，加入水合肼，在50 ℃加热搅拌，待反应完全后，将反应物冷却至室温，抽滤，用有机溶剂洗固体3次，得到式IV中间体。
S4、制备基于嘌呤母体的锌离子探针化合物I
将式IV中间体和色酮-3-甲醛溶解于有机溶剂乙醇中，在N2保护下，将反应体系于80 ℃下回流搅拌，反应完全后，将反应物料冷却至室温，减压除去溶剂，将粗产物通过重结晶进行纯化，得到荧光探针化合物I。
本发明的目的之三在于提供基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针在检测溶液中锌离子的应用。
本发明的优点和有益效果在于：
本发明以嘌呤环和色酮-3-甲醛为荧光基团，水合肼为连接基团，制备了一种基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针，该制备方法原料易得，方法简单，所得产品为固体粉末，易于存储，稳定性好；
选用嘌呤类衍生物为刚性平面结构，具有生物毒性低，氮原子与金属结合能力强等优点；
该荧光探针对锌离子具有专一性识别，响应时间短，灵敏度高，对溶液中Zn2+表现出高灵敏度和高选择性，本发明的探针还可以以固体状态检测锌离子，具有很好便携性和稳定性。
附图说明
图1为实施例1中制得的锌离子荧光探针在DMSO-H2O (v/v = 9 : 1)溶液中对锌离子（Zn2+）的紫外吸收光谱图；
图2为实施例1中制得的锌离子荧光探针在DMSO-H2O (v/v = 9 : 1)溶液中对不同的金属离子选择性荧光光谱图；
图3为实施例1中制得的荧光探针在DMSO-H2O (v/v = 9 : 1)溶液中对不同浓度锌离子（Zn2+）的荧光光谱响应图；
图4为实施例1中制得的荧光探针在DMSO-H2O (v/v = 9 : 1)溶液中对不同离子选择干扰性检测的荧光响应图；
图5为实施例1中制得的荧光探针在DMSO-H2O (v/v = 9 : 1)与锌离子（Zn2+）络合比的Job-plot曲线；
图6为实施例1中制得的荧光探针制备的探针试纸与不同浓度的锌离子；
图7为实施例1中制得的荧光探针检测锌离子时的响应时间图；
图8为实施例1中制得的荧光探针的质谱MS谱图；
图9为实施例1中制得的荧光探针的核磁共振1H-NMR谱图；
图10为实施例1中制得的荧光探针的核磁共振13C-NMR谱图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实验所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所选用的以下所有试剂皆为市售分析纯或化学纯。
其中，实施例中各种属离子溶液是由纯度为99%以上的氯化盐化学试剂如无水氯化锌、无水氯化铁等加去离子水配置而成的。
实施例1
基于嘌呤母体的锌离子荧光探针化合物，采用如下方法制备而成：
S1、制备式II中间体（6-氯-N4-（萘-1-基）嘧啶-4,5-二胺）
在100 mL圆底烧瓶中，加入4,6-二氯-5-氨基嘧啶（5.00 g，30 mmol）和1-萘胺（8.58 g，60 mmol）并溶于50 mL甲醇，然后加入5 mL 12 mol/L HCl。将混合物在65 ℃下回流搅拌5天。待反应液冷却，减压蒸馏除去有机溶剂。然后将得到的全部粗产品溶于50 mL的1M NaOH水溶液中，并将混合物用乙酸乙酯萃取3次，减压蒸馏除去乙酸乙酯。有机相用1.2M HCl洗涤，然后用饱和食盐水除水，干燥，得到粗产物。粗产物用CH3OH/H2O（v/v，1∶5）重结晶，烘干后得到式Ⅱ中间体，为浅紫色固体粉末（5.75 g，收率71％）。
所得式Ⅱ中间体的结构式为：
S2、制备式Ⅲ中间体（6-氯-9-（萘-1-基）-8-（萘环-1-基）-9H-嘌呤）
将式Ⅱ中间体（1.00 g，3.70 mmol），1-萘甲酸（3.18 g，18.50 mmol）和DTAC（0.10g，10％mmol）溶解在25 mL POCl3中，待上述固体物质溶解后加入多聚磷酸（5.00 g，14.80mmol）。将反应混合物在80 ℃下回流搅拌72小时。反应完成后，将反应液冷却至室温后，减压蒸馏除去有机溶剂，得到褐色油状物。在冰水浴条件下，向反应体系中加入100 mL冰水混合物，搅拌后析出大量固体，抽滤，得到粗产物，通过硅胶柱色谱法纯化，使用CH3OH/CH2Cl2（v/v，1/250）洗脱，减压蒸馏除去溶剂后，烘干得到式Ⅲ中间体，为浅黄色固体（0.56 g，收率42％）。
所得式Ⅲ中间体的结构式为：
S3、制备式IV中间体(6-肼基-9-（萘-1-基）-8-（萘环-1-基）-9H-嘌呤)
将式Ⅲ中间体（0.32 g，0.80 mmol）溶解在20 mL乙醇中，然后加入水合肼（0.25g，4 mmol）。将混合物在50 ℃下加热搅拌3小时。反应完成后，将混合物冷却至室温，会有固体析出，抽滤，固体并用冰甲醇冲洗三遍，烘干后得到浅黄色粉末（0.23 g，收率70％）。
所得式IV中间体的结构式为：
S4、制备基于嘌呤母体的锌离子荧光探针化合物
将式IV中间体（56 mg，0.14 mmol）和色酮-3-甲醛（37 mg, 0.21 mmol）溶解在2mL乙醇中，在N2保护下，然后将该混合物80 ℃回流搅拌2小时。点板（TLC）跟踪反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂。将粗产物通过二氯甲烷-甲醇重结晶纯化，加入少量的甲醇溶解粗产物后，加入适量的二氯甲烷至浑浊，放置冰箱里冷藏待晶体析出即可，抽滤，干燥后得到探针基于嘌呤母体的锌离子荧光探针化合物I，为淡黄色粉末（54.7mg，70％）。
所得到的荧光探针化合物结构式为：
荧光探针化合物的质谱MS谱图见图8；
基于嘌呤母体的锌离子荧光探针化合物的核磁共振1H-NMR谱图：1H NMR (400MHz, DMSO-d 6) δ 12.19 (s, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 8.35 (s, 2H), 8.15(dd, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H), 7.98 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.93 – 7.82 (m, 3H),7.74 – 7.65 (m, 2H), 7.58 – 7.47 (m, 6H), 7.41 (dd, J = 4.7, 1.7 Hz, 2H),7.32 (dd, J = 8.3, 7.2 Hz, 1H) ，见图9。
基于嘌呤母体的锌离子荧光探针化合物的核磁共振13C-NMR谱图：13C NMR (101MHz, DMSO-d 6) δ 175.44, 156.23, 154.15, 153.32, 150.88, 134.98, 134.00,133.39, 131.84, 131.50, 130.61, 130.26, 130.10, 129.34, 128.67 (d, J = 6.6Hz), 127.87 (d, J = 12.1 Hz), 127.43, 127.22 (d, J = 12.6 Hz), 126.86, 126.36(d, J = 14.7 Hz), 125.74 (d, J = 12.2 Hz), 125.01, 123.85, 122.91, 119.54,119.16, 118.79，见图10。
锌离子荧光探针的性能测试
1、锌离子荧光探针在DMSO-H2O (v/v = 9 : 1)溶液中对锌离子（Zn2+）的紫外吸收
将实施例1制得的锌离子检测荧光探针用DMSO制成1 mM的探针储备液，各金属离子用去离子水配置成3 mM的金属离子储备液，向3 mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v = 9 : 1)中加入30 μL的探针储备液和50 μL的金属离子储备液并用荧光光谱仪和紫外分光光度计进行检测，测试得知荧光探针的最大激发波长为368 nm，最大发射波长为509 nm，具体测试结果如下：
取两个比色皿，分别加入3 mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v = 9 : 1)中和30 μL的探针储备液，向其中一个比色皿加入50 μL的锌离子储备液，另外一个比色皿不加锌离子储备液，进行紫外光谱测试。实验结果为，荧光探针化合物本身在波长λ = 336 nm处较强的紫外吸收，当往溶液中加入锌离子后，紫外吸收峰渐渐的降低，除此之外，荧光探针在波长368nm处几乎没有紫外吸收，当往溶液中增加锌离子浓度后，紫外吸收峰渐渐的加强。结果表明探针对Zn2+具有很高的灵敏度，见图1。
2、锌离子荧光探针对锌离子的选择性识别
向3 mL的空白溶液DMSO-H2O (v/v = 9 ：1)中加入30 μL的探针储备液和50 μL的各种金属离子储备液，结果表明加入锌离子时导致探针溶液的荧光颜色在从无色变为亮黄色，荧光光谱在509 nm处荧光强度发生了明显的增强，而加入其他金属离子时，荧光无明显变化，即本发明的荧光探针对锌离子有很好的选择性，见图2。
3、锌离子浓度对锌离子荧光探针荧光强度的影响
向3 mL的空白溶液DMSO-H2O (v/v = 9 ：1)中加入30 μL的探针储备液和0～50 μL（0、1、2、3……40、45、50μL）的锌离子溶液（3 mM的锌离子储备液），该荧光探针在溶液中无色，但随着锌离子浓度的增加，在509 nm 处荧光也在不断的增强，说明荧光强度随着锌离子浓度的增加而增加，见图3。
4、共存离子对锌离子荧光探针的干扰
向3 mL的空白溶液DMSO-H2O (v/v = 9 ：1)中加入30 μL的探针储备液和50 μL的其他任意一种金属离子（Co2+, Ni2+, Al3+, Cr3+, Mn2+, Mg2+, Pb2+, K+, Ca2+, Cs2+, Na+,Ag+, Cd2+, Pd2+,Fe3+和Cu2+）储备液，最后向空白液加入50 μL的Zn2+储备液，测试其荧光强度。结果表明，Pb2+, Fe3+和Cu2+对锌离子荧光探针具有一定的淬灭作用，其它金属离子的存在对本发明锌离子荧光探针化合物识别锌离子无明显干扰，见图4。
5、锌离子与荧光探针物质的量比对荧光强度的影响
通过Job's plot方法研究了探针与Zn2+的结合率，向3 mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v = 9 ：1)中加入一定体积探针储备液和Zn2+储备液（3 mM），使得锌离子检测荧光探针和锌离子的浓度总和为50 μM，通过改变二者的浓度比（锌离子检测荧光探针和锌离子物质的量比依次为1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1）得到509 nm处的荧光强度与该浓度下锌离子荧光探针化合自身荧光强度的差值，与离子占总浓度的比例作图。当锌离子所占比例为0.5时纵坐标达到最高值，可以确定该荧光探针化合物与锌离子之间主要以1∶1形式结合形成稳定的络合物，见图5。
6、探针试纸对不同浓度锌离子的检测
将滤纸浸入含有荧光探针储备溶液中，浸泡半小时，然后将测试条取出在空气中干燥，得到干燥的含有探针的试纸条。将试验条分别浸泡在0 mM、0.05 mM、0.1mM、0.5 mM、1mM锌离子浓度溶液中，浸泡几分钟后，晾干，在365 nm紫外灯下观察到快速变色的条带，说明本发明的探针可以以固体状态检测锌离子，见图6。
7、荧光探针检测锌离子的响应时间
向3 mL的空白缓冲液DMSO-H2O(v/v = 9 ：1)中加入30 μL的探针储备液和50 μL的Zn2+储备液，探针的荧光强度迅速增强到最高，并且在5分钟左右达到最高值且探针的荧光强度逐渐见底趋于稳定，这说明探针对于Zn2+检测足够稳定，并且速度快，见图7。
与CN112321588A中公开的基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针相比，本发明的锌离子检测荧光探针具有以下有益之处：
1、结构式和物质性质方面：CN112321588A的锌离子荧光探针分子结构中含有噻吩环，本案荧光探针结构是相对位置为萘环，本案荧光探针性质相对稳定；
2、如图7所示， CN112321588A的锌离子荧光探针在10分钟时荧光强度达到最高，随着时间的延长，荧光强度呈一定程度的下降趋势；而本发明探针的荧光强度在5分钟左右达到最高，并且随着时间的延长，荧光强度趋于稳定。上述结果表明本发明荧光探针检测锌离子的响应时间更短，检测结果更稳定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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