米碎花中抗prrsv病毒成分的制备与应用
阅读说明：本技术 米碎花中抗prrsv病毒成分的制备与应用 (Preparation and application of anti-PRRSV virus component in crushed rice flowers ) 是由 徐明行 韦珊珊 姚丽媛 杜逸琼 秦绪兵 林婷婷 于 2020-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明设计医药技术领域,提供了一种米碎花的抗病毒应用,特别涉及米碎花中抗PRRSV成分的制备与应用。本发明该米碎花(学名：Eurya chinensis R.Br.)中提取分离的化合物Betulinic acid、α-amyrin、taxifolin、hydroxytyrosol,体外抗病毒实验首次发现具有抗PRRSV活性,为制备治疗猪蓝耳病毒提供了新的安全植物和天然化合物,为制备抗猪蓝耳病毒的药物或药物组合物提供有力的技术支持。米碎花具有良好的抗病毒活性,并且其具有抗病毒活性成分。鉴于其药食同源,又有很高的市场经济价值。(The invention relates to the technical field of medicines, provides an antiviral application of ground rice flower, and particularly relates to preparation and application of an anti-PRRSV component in ground rice flower. In vitro antiviral experiments show that the compounds Betulinic acid, alpha-amyrin, taxifolin and hydroxyytosol extracted and separated from the crushed rice flowers (the scientific name: Eurya chinensis R.Br.) have the PRRSV resistant activity for the first time, provide new safe plants and natural compounds for preparing and treating porcine reproductive and respiratory syndrome viruses and provide powerful technical support for preparing and treating the porcine reproductive and respiratory syndrome resistant medicines or pharmaceutical compositions. The crushed rice flower has good antiviral activity, and it has an antiviral active ingredient. Due to homology of medicine and food, the compound has high market economic value.)
技术领域
本发明涉及一种米碎花的抗病毒应用，特别涉及米碎花中抗PRRSV病毒成分的制备与应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)，是一种以感染猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，各种年龄猪(特别是仔猪)呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。猪蓝耳病传播速度快，尤其在技术进步和经济发达国家，由于猪群密集、流动频繁，更易引起流行。在一个严重流行期过后，此病常为地方流行性,长期危害养猪生产，给养猪业造成巨大的经济损失。该病1987年在美国首次报道，之后在德国、荷兰、加拿大等国相继出现报道，随后迅速蔓延至亚洲及其它地区，给全球养猪业带来了巨大的损失。PRRS主要由猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)所引起。PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV具有较高的感染性，用10个或更少的病毒粒子，通过鼻腔和肌肉途径都能使猪感染，感染后的猪从唾液、尿、精液和乳汁中排毒，病毒通过直接或间接方式感染易感猪群。PRRSV可以在小于30m距离的猪群间直接传播。猪场之间的传播方式是以感染猪或者带病毒的精液为主要传播方式。由于该病的巨大危害性，所以国际兽疫局(OIE)将该病列为B类传染病，我国将该病列为二类传染病。国内外学者在研究PRRSV防控方面做了大量的工作，在疫苗预防和西药防治方面取得一定的进展。目前市面上的PRRSV疫苗主要有灭活苗和弱毒苗，但是灭活疫苗的保护效果并不理想，弱毒苗存在散毒的危险，并且在免疫的过程中可能会出现毒力返强的状况。国内常见报道，因接种PRRSV疫苗发生母猪流产，产死胎的事件。因此，研究和开发天然、绿色的药物促进PRRSV疫苗作用或替代PRRSV疫苗地位，达到促进畜禽免疫功能和健康状况、提高动物抵抗蓝耳病毒感染成为动物传染病研究领域的热点课题之一。
米碎花(学名：Eurya chinensis R.Br.)，山茶科灌木，根及全株可入药。米碎花在广东地区(尤为东莞)常被用作茶饮品，广东人爱饮茶，除了喝绿茶等常规茶外，民间喝草本茶的习惯由来已久，米碎花茶也作为其中一种。此外，据古典籍《全国中草药汇编》、《中华本草》记载：“米碎花性味归经：甘、淡，微涩，凉。功能主治：清热解毒，除湿敛疮。用于预防流行性感冒；外用治烧烫伤，脓泡疮。蛇虫咬伤；外伤出血。”米碎花也被用在中药复方中，用来治疗偏头痛，带状疱疹，肺炎球菌，尿道炎，口腔溃疡等疾病。因此，我们推测米碎花具有良好的抗病毒活性，并且其具有抗病毒活性成分。鉴于其药食同源，又有很高的市场经济价值。
发明内容
本发明的目的是提供米碎花抗抗PRRSV成分的提取分离与鉴定及其应用。
本发明的米碎花抗PRRSV成分的提取分离与鉴定是通过以下的技术方案得以实现的：
取米碎花叶晒干粉碎，经95％酒精浸提，重复操作三次，浓缩得浸膏，用纯水混悬，经乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯部浸膏。
乙酸乙酯部位经工业大孔树脂D-101脱色素，先用30％乙醇洗脱至流出液为无色，再用90％乙醇洗脱至流出液无色，收集该部位流出液并减压浓缩，后硅胶柱层析，得9个组分Er.1-Er.9。
Er.1经硅胶柱(正己烷、乙酸乙酯体系梯度洗脱)层析，得到Er.1-1、Er.1-2、Er.1-3。Er.1-1经HPLC(35％乙腈/水)层析得化合物Betulinic acid。
Er.1-2经HPLC(35％乙腈/水)层析得化合物α-amyrin。
Er.3经反向硅胶柱(80％甲醇/水)层析，硅胶柱(氯仿:甲醇体系＝25:1)层析，流动相为，得到化合物Hydroxytyrosol。
Er.7经反向硅胶柱(30％-100％甲醇/水)层析，得到Er.7-1、Er.7-2、Er.7-3。Er.7-3经HPLC(32％乙腈/水)层析，得化合物taxifolin。
所述三个化合物的结构式分别为：
本发明的米碎花中提取分离鉴定的具有抗病毒活性的四个化合物在抗PRRSV中的应用。相对于现有技术，本发明米碎花中抗PRRSV病毒成分的制备与应用，具有显著的优势：
本发明首次发现米碎花或其提取物可以用作天然的抗PRRSV中药，因为其含有抗病毒活性成分，其中Betulinic acid在米碎花粗提物中含量高，达到2％，为米碎花中的主要成分。中药在防控病毒病方面具有独特的优越性。中药抗病毒不仅能直接在阻止病毒的吸附、穿入、复制等方面起到抗病毒作用，还能调节机体的免疫功能，参与机体的免疫反应，起到免疫监视和抗病毒作用，有望成为新型的防治猪蓝耳病的药物，在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。
本发明所发现的抗PRRSV化合物Betulinic acid、α-amyrin、taxifolin、hydroxytyrosol从米碎花植物中可以通过提取分离得到，提取工艺简单，较快获得有效成分。
本发明所发现的抗PRRSV化合物Betulinic acid、α-amyrin、taxifolin、hydroxytyrosol合成工艺简单，价格低廉，原料易得，有利于工业化，具有较广泛的应用前景。
由以上技术方案可知，本发明利用实验方法证明了，米碎花具有能够显著抑制PRRSV感染和复制的化合物，具有显著的抗PRRSV病毒作用，有望成为新型的防治猪蓝耳病的药物，在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1为Betulinic acid的结构式；
图2为Betulinic acid的1H-NMR的图；
图3为Betulinic acid的1C-NMR的图；
图4为α-amyrin的结构式；
图5为α-amyrin的1H-NMR的图；
图6为α-amyrin的1C-NMR的图；
图7为taxifolin的结构式；
图8为taxifolin的1H-NMR的图；
图9为taxifolin的1C-NMR的图；
图10为hydroxytyrosol的结构式；
图11为hydroxytyrosol的1H-NMR的图；
图12为hydroxytyrosol的1C-NMR的图；
具体实施方式
以下结合较佳的实施例，对依据本发明提出的米碎花中抗PRRSV成分的提取分离与鉴定作详细介绍。
实施例1四种化合物的分离制备和结构特征
米碎花叶23Kg晒干粉碎，经95％工业酒精浸提，重复操作三次，第一次浸泡96h，第二次和第三次浸泡72h，大型旋转蒸发仪真空减压浓缩三次浸出液并合并浓缩物，得到初提物。将初提物用纯水混和，充分搅拌使其混悬，加入相同体积的乙酸乙酯，用力搅拌，于5000mL分液漏斗分层，静置三十分钟后按分层顺序依次收集分层部位，减压浓缩乙酸乙酯部并用乙酸乙酯重复萃取水部三次。合并乙酸乙酯部浓缩产物并称重，得到乙酸乙酯部1.7Kg。
乙酸乙酯部位经工业大孔树脂D-101脱色素，先用30％乙醇洗脱至流出液为无色，再用90％乙醇洗脱至流出液无色，收集该部位流出液并减压浓缩，得到1.7Kg浓缩物。用80-100目硅胶对乙酸乙酯部90％乙醇洗脱部柱层析，正己烷:乙酸乙酯(v:v 100:1-1:100)梯度洗脱，最后甲醇冲柱，薄层检查合并馏分得到9个组分，分别为Er.1(32.5g)、Er.2(61.3g)、Er.3(56.8g)、Er.4(85.4g)、Er.5(74.1g)、Er.6(141.2g)、Er.7(64.2g)、Er.8(92.1g)、Er.9(1092g)。
Er.1经硅胶(200-300目)柱层析，流动相为正己烷：乙酸乙酯体系(100:1到1:1)，薄层检测，得到Er.1-1、Er.1-2、Er.1-3。Er.1-1经HPLC层析得化合物Betulinic acid，流动相为30％乙腈/水。化合物Betulinic acid无紫外，薄层显色呈蓝色。Er.1-2经HPLC层析得化合物α-amyrin，流动相为35％乙腈/水体系。
Er.3经反向硅胶柱层析，流动相为甲醇：水体系(80％甲醇)，硅胶(200-300目)柱层析，流动相为氯仿：甲醇体系(v/v＝25:1)，得到化合物Hydroxytyrosol。
Er.7经反向硅胶柱层析，流动相为甲醇：水体系(v/v＝30％-100％)，薄层检测，得到Er.7-1、Er.7-2、Er.7-3、Er.7-4。Er.7-3经HPLC层析，流动相为32％乙腈/水，得化合物taxifolin。
Betulinic acid，白色固体。1H NMR(CD3COCD3,500MHz)δH:3.12(1H,dd,J＝11.5,5.0Hz,H-3),0.97(3H,s),0.75(3H,s),0.95(3H,s),0.85(3H,s),1.00(3H,s),4.70(1H,d,J＝2.1Hz,H-29b),4.58(1H,dd,J＝2.3,1.4Hz,H-29a),1.68(3H,s,H-30)；13C-NMR(CD3COCD3,126MHz)δC:40.1(C-1),28.2(C-2),79.8(C-3),40.2(C-4),57.0(C-5),16.9(C-6),35.8(C-7),42.1(C-8),52.2(C-9),38.3(C-10),22.2(C-11),27.0(C-12),39.8(C-13),43.7(C-14),31.0(C-15),33.5(C-16),50.6(C-19),152.2(C-20),31.9(C-21),38.3(C-22),28.8(C-23),16.8(C-24),16.3(C-25),19.6(C-26),15.2(C-27),110.2(C-29),19.7(C-30).
α-amyrin，白色固体。采用核磁共振分析，其数据如下：1H NMR(CD3OD，500MHz)δH:0.91(3H,s),0.99(3H,s),1.03(3H,d,J＝6.5Hz),1.04(3H,s),1.06(3H,d,J＝6.5Hz),1.25(3H,s),1.27(3H,s),2.66(1H,d,J＝11.2Hz,18-H),3.48(1H,m,3-H),5.51(1H,brs,12-H)；13C-NMR(CD3OD,126MHz)δC:181.1(C-28),139.7(C-13),126.9(C-12),79.7(C-3),56.8(C-5),54.4(C-18),48.2(C-17,9),43.3(C-14),40.8(C-1),40.4(C-8),40.4(C-4),40.0(C-19),39.8(C-10),38.1(C-20),38.1(C-22),34.3(C-7),31.8(C-28),29.2(C-23),28.8(C-2),27.9(C-15),25.3(C-16),24.4(C-11),24.1(C-27),21.6(C-30),19.5(C-6),17.8(C-29),17.7(C-26),16.4(C-25),16.1(C-24)。中文名为α-香树素。
Taxifolin，白色晶体。采用核磁共振分析，其数据如下：1H NMR(CD3COCD3,500MHz)δH:5.02(d,2-H),4.61(d,3-H),5.94(d,6-H),5.98(d,8-H),7.06(d,2'-H),6.86(d,5'-H),6.91(dd,6'-H),11.71(s,5-OH)；13C NMR(CD3COCD3,126MHz)δC:198.2(C-4),167.9(C-7),165.1(C-5),164.2(C-8a),146.6(C-4'),145.8(C-3'),129.8(C-2'),120.8(C-6'),115.9(C-2'),115.8(C-5'),101.5(C-4a),97.1(C-6),96.0(C-8),84.5(C-2),73.2(C-3).中文名为花旗松素。
Hydroxytyrosol，无色油状。采用核磁共振分析，其数据如下：1H NMR(CD3OD,500MHz)δH:6.67(H-5,d,J＝8.0),6.65(H-2,d,J＝1.9),6.51(H-6,dd,J＝8.0,J＝1.9),2.65(H-2',t,J＝7.2),2.65(H-1',t,J＝7.2)；13C-NMR(CD3OD,126MHz)δC:146.1(C-3),144.6(C-4),131.8(C-1),121.2(C-6),117.1(C-2),116.3(C-5),64.6(C-2'),39.7(C-1')。中文名为苯乙醇。
试验例：米碎花中提取的化合物α-amyrin、taxifolin、hydroxytyrosol的体外抗PRRSV活性
实验材料：Marc-145细胞株由华南农业大学惠赠。PRRSV由华南农业大学惠赠，在Marc-145细胞上传代2次，按Reed-Muench法测得TCID50为10-1mL，本试验用浓度为100TCID50
新生小牛血清购自Gibco公司，56℃水浴将小牛血清灭活30分钟，分装，置于-20℃环境下保存备用。青链霉素液将青霉素和链霉素各自用三蒸水溶解，配成青链霉素各含1万单位的溶液，用0.22μm的微孔滤膜过滤杀菌，并分装于小瓶内，置于-20℃环境下保存备用。
培养液DMEM产自Gibco公司，参照配制方法，用三蒸水溶解后过滤除菌，分装，置于4℃环境下保存备用，用前需加入血清及双抗。
磷酸盐缓冲液(PBS)购自上海信裕生物科技有限公司
实验方法：
采取常规方式将长成单层的Marc-145细胞消化传代，将细胞数目调到1×106～1×107个/mL后，加入96孔培养板内，100μL/孔，放入37℃,5％CO2培养箱内恒温培育，等细胞长成单层后，依次加入稀释度为1×10-1～1×10-11的病毒液，100μL/孔，每个稀释KLJHGFDSAs'd'f'g'h'j'k'l
算得出病毒的TCID50为10-3，使用前稀释至10～100 TCID50。备用。
在安全浓度的范围内，分别将3种化合物用细胞维持液依次倍比稀释8个浓度梯度，然后加入长成单层的Marc-145细胞培养板内，4μL/孔，每个稀释度设2个平行，在37℃培养箱内作用72h后，弃去药液，每孔加入100 TCID50的病毒稀释液100μL，分别设1组细胞对照和病毒对照，放入37℃,5％CO2培养箱内恒温培育，每天观察细胞病变情况，当病毒对照组的病变达到70％～80％，则用MTT法测A570值，根据公式得到抑制率，用Excel拟合曲线，计算得IC50的值。(抑制率＝[(给药-本底)/(对照-本底)]×100％)
四个化合物抗PRRSV活性测定
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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