阅读说明：本技术 一种自胡麻科植物根部萃取或分离得到的分离物或纯化物及其制备方法和用途 (A separated or purified product extracted or separated from Pedaliaceae plant root, and its preparation method and application ) 是由 叶秋月 陈拯裕 谢思嘉 廖伯杰 于 2019-03-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种自胡麻科植物根部萃取或分离得到的分离物或纯化物及其制备方法和用途。本发明是通过萃取步骤与分离步骤取得含有Chlorosesamone的D2分离物,该Chlorosesamone的结构如式I所示。接着,可再经过纯化步骤取得Chlorosesamone。于本发明所记载的实验以胡麻科胡麻属的芝麻根为例,自其根部所萃取出含有D2分离物或chlorosesamone的纯化物可用于乳癌、肝癌、血癌与肺癌的抗癌治疗。<Image he="547" wi="700" file="DDA0002012634500000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention discloses a separated substance or a purified substance extracted or separated from the root of a plant in the family of Juglandaceae, a preparation method and application thereof. The invention obtains a D2 isolate containing Chlorosesamone through an extraction step and a separation step, wherein the structure of the Chlorosesamone is shown in a formula I. Subsequently, Chlorosesamone can be obtained through a purification step. In the experiments described herein, using the root of sesame of the genus Sesamum of the family Pedaliaceae as an example, the purified product containing the D2 isolate or chlorosesamone extracted from the root thereof can be used for the treatment of breast cancer, liver cancer, leukemia and lung cancerAnd (3) treating cancer.)

一种自胡麻科植物根部萃取或分离得到的分离物或纯化物及 其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种自胡麻科植物根部萃取或分离得到的分离物或纯化物及其制备方法和用途。

背景技术

根据世界卫生组织所公布的2018世界卫生统计(World Health Statistics2018)显示，在2016年全球约有9百万人死于恶性肿瘤。全球卫生观察站(Global HealthObservatory,GHO)的报告指出，中国因恶性肿瘤死亡的人数为2,385,790人，占所有死亡人数的23％，居死因的第二名，且恶性肿瘤死亡人数超过全球的四分之一，这是一个相当高的比例。此外，由中国国家癌症中心发布的2018中国肿瘤的现状和趋势报告指出，2014年恶性肿瘤的前五名依次为：肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌和乳腺癌。肺癌、乳腺癌分别是中国男性与女性肿瘤发病的第一名。恶性肿瘤对于中国人民所造成的影响甚巨，因此，如何治疗癌症为目前最重要的课题之一。

目前临床治疗癌症的方式主要有免疫疗法、单株抗体疗法、标靶药物治疗、放射线疗法、手术切除与化学药物治疗，但由于癌症早期发现不易，当患者察觉不适时癌细胞已经扩散，因此手术切除适用性小。药物疗法也会影响正常细胞的生长，所产生的副作用包括呕吐、四肢无力、掉发、白血球下降及贫血等严重影响病患的生活质量以及心理状态，故其治疗效果差。

近几年的中草药研究显示许多天然食物具有抗癌效果，因此萃取中草药成分筛选具有抗癌潜力的成分也是癌症治疗的重要方向。

胡麻科胡麻属植物的种子含油率高且可食用，因此被大量种植，例如芝麻植物即为目前胡麻科植物中的代表之一。在传统中医记载芝麻种子有益气力、补肝肾、滋润五脏、明目等疗效，并且芝麻种子中的芝麻素已被揭示具有抑制人类肝癌细胞及人类乳癌细胞生长的用途，芝麻种子中的肉豆蔻酸也具有抑制癌细胞的抗癌性质。然而芝麻其他非食用部位却未有相关疗效的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种于胡麻科植物根部萃取出含Chlorosesamone的分离物或Chlorosesamone纯化物的方法及其组成的药物，于本实施例中，实验以胡麻科胡麻属的芝麻根为例，自其所萃取出含有D2或Chlorosesamone的萃取物或分离物可用于乳癌、肝癌、血癌与肺癌的抗癌治疗。

其中，本发明的自胡麻科植物根部取得含Chlorosesamone的分离物方法包括一萃取步骤与一分离步骤。萃取步骤是于室温下对胡麻科植物根部进行萃取取得一粗萃物。分离步骤是将该粗萃物中的乙酸乙酯层取出后，进行区分分离取得D1分离物及D2分离物，其中，D2分离物含Chlorosesamone，该Chlorosesamone的结构如式I所示：

藉由上述方法，即可取得含Chlorosesamone的D2分离物，藉此D2分离物即可有效抑制癌症细胞的生长。

进者，该萃取步骤是经由醇类或正己烷或乙酸乙酯或丙酮或有机溶媒或超临界萃取方式进行萃取，其中，胡麻科植物根部与有机溶媒以重量比1:2的比例于室温下萃取。进者，其中该分离步骤中的区分分离是进一步以Diaion HP20管柱进行，流动项依序为H2O/MeOH(重量比40/60)；100％MeOH；100％acetone；H2O/acetone(重量比30/70)。

又，本发明的自胡麻科植物根部取得Chlorosesamone的方法，包括一萃取步骤、一分离步骤与一纯化步骤。其中，所述的萃取步骤、分离步骤与前述内容相同，于此不另赘述。于完成前述二步骤后，接续纯化步骤，其是将D2分离物进行纯化作业，将D2分离物，是以使用Silica gel管柱(n-Hexane/Benzene)于室温环境下进行纯化。

及进一步利用正己烷/乙酸乙酯(1:1)溶剂的比例，于水浴锅60℃加热下进行再结晶后，即可获得Chlorosesamone。

进者，使该结晶后的Chlorosesamone以100％二甲基亚砜(DMSO)回溶，再置于摄氏负20度进行保存。

本发明还提供一种用于治疗癌症的药物，其包括自胡麻科植物根部所萃取的Chlorosesamone或其分离物。且，该药物可为粉末、锭剂、液状、药膏、饮品或喷剂。

于本实施例所提供的数据中，D2分离物在用于抑制乳癌细胞、肝癌细胞、血癌细胞与肺癌细胞的生长具有明显的功效。于实施例中，该D2分离物的50％抑制浓度为38.2-181.9μg/ml，并具有较佳的效果。在较佳实施例中，该萃取物作用时间为24小时。

附图说明

图1A显示Chlorosesamone经高效液相层析的层析图。其中横轴为时间，纵轴为侦测器的输出讯号值。

图1B显示芝麻根萃取物的D2分离物经高效液相层析的层析图。其中横轴为时间，纵轴为侦测器的输出讯号值。

图2A显示实施例一的芝麻根含有D2分离物的萃取物抑制乳癌细胞株生长的实验结果。

图2B显示实施例一的芝麻根含有D2分离物的萃取物抑制肝癌细胞株生长的实验结果。

图2C显示实施例一的芝麻根含有D2分离物的萃取物抑制血癌细胞株生长的实验结果。

图2D显示实施例一的芝麻根含有D2分离物的萃取物抑制肺癌细胞株生长的实验结果。

图3A显示实施例一的芝麻根含有Chlorosesamone的萃取物抑制4T1老鼠乳癌细胞株生长的实验结果。

图3B显示实施例一的芝麻根含有Chlorosesamone的萃取物抑制HepG2人类肝癌细胞株生长的实验结果。

图4为本实施例取得含Chlorosesamone的分离物方法的步骤示意图。

图5为本实施例取得Chlorosesamone的方法的步骤示意图。

具体实施方式

本实施例是以胡麻科内的芝麻植物的根部为说明使用。其将根部经洗净后，再进行萃取，其可为整株或是切片或是粉末状。请配合图4所示，步骤为一萃取步骤S1与一分离步骤S2。萃取步骤S1是于室温下对胡麻科植物根部进行萃取取得一粗萃物。分离步骤S2是将该粗萃物中的乙酸乙酯层取出后，进行区分分离取得D1分离物及D2分离物，其中，D2分离物含Chlorosesamone。经此步骤即可取得含Chlorosesamone的D2分离物，藉此D2分离物即可有效抑制癌症细胞的生长。

于室温下经由醇类或正己烷或乙酸乙酯或丙酮等有机溶媒或超临界萃取等萃取方式取得一粗萃物，其中，芝麻根部与有机溶媒以重量比1:2的比例萃取。再将乙酸乙酯层取出后，进一步使用Diaion HP20管柱(流动项依序为H2O/MeOH(重量比40/60)；100％MeOH；100％acetone；H2O/acetone(重量比30/70))进行区分分离，即可获得D1及D2分离物。

接着，请配合图5所示，本发明再提供一实施例，用以取得Chlorosesamone的方法，包括一萃取步骤S1、一分离步骤S2与一纯化步骤S3。其中，所述的萃取步骤S1、分离步骤S2不再赘述。于完成前述二步骤后，接续纯化步骤S3，纯化步骤S3将D2分离物以使用Silicagel(n-Hexane/Benzene)进行分离后，及利用正己烷/乙酸乙酯(1:1)溶剂的比例，于水浴锅60℃加热下进行再结晶后，即可获得Chlorosesamone(经NMR分析确认为Chlorosesamone)，该Chlorosesamone的结构如式I所示：

Chlorosesamone纯化物以及D2分离物Chlorosesamone经高效液相层析的层析，结果如图1A、1B所示。再者，所述的Chlorosesamone纯化步骤亦可使用如HPLC等相关分析仪器，或其他gel(例如：C18；Sephadex LH20)或以silica gel改变移动相(有机溶剂的改变)等或制备型TLC亦可完成分离作业)。

又，含D2分离物或Chlorosesamone的液体经浓缩干燥或再结晶后以100％DMSO回溶，再于摄氏负20度进行保存。

进者，可将D2分离物或Chlorosesamone与其他成份组合成粉末、锭剂、液状、药膏、饮品或喷剂，或是与其他成份组成混合物药物，供患者进行食用或是注射、涂抹或是吸食。另外，所述的胡麻科植物，包括胡麻属的白芝麻、芝麻、胡麻、乌麻、黑芝麻，或是茶菱属所包括的植物。

以下以实验进一步说明本发明用于乳癌、肝癌、血癌与肺癌的抗癌治疗实施例。

实施例一:

本实施例是以MDA-MB-231人类乳癌细胞株与4T1老鼠乳癌细胞株、Huh-7及HepG2人类肝癌细胞株与BNL-1-MEA老鼠肝癌细胞株、HL60人类血癌细胞株与WEHI-3老鼠血癌细胞株和A549人类肺癌细胞株与LLC1老鼠肺癌细胞株来进行实验，于96孔盘中进行细胞培养。试验方法是将细胞以0、25、50、100、200、400μg/mL的D2分离物处理24小时后，进行细胞存活率分析(MTT assay)。细胞存活率分析是将细胞使用一倍PBS进行清洗后，加入0.5mg/mL MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)于37℃下作用1-2小时，移除MTT并使用一倍PBS进行清洗后，加入DMSO(dimethyl sulfoxide)溶解细胞，侦测OD 570nm吸光值(OD:optical density)，并以培养液作为控制组，相对于培养液的百分比为细胞存活率。

图2A显示实施例一的MDA-MB-231人类乳癌细胞株与4T1老鼠乳癌细胞株的实验结果。横轴为D2分离物浓度，纵轴为存活细胞百分比，两条曲线分别为MDA-MB-231人类乳癌细胞株与4T1老鼠乳癌细胞株，由结果可知，相较于D2分离物浓度为零的组别，处理D2分离物能明显抑制乳癌细胞的生长，且抑制能力与D2分离物浓度剂量成正比，其50％抑制4T1老鼠乳癌细胞株与MDA-MB-231人类乳癌细胞株浓度分别为38.2μg/ml与181.9μg/ml，显现D2分离物有极佳的抑癌效果。

图2B显示实施例一的Huh-7人类肝癌细胞株及HepG2人类肝癌细胞株与BNL-1-MEA老鼠肝癌细胞株的实验结果。横轴为D2分离物浓度，纵轴为存活细胞百分比，三条曲线分别为Huh-7人类肝癌细胞株及HepG2人类肝癌细胞株与BNL-1-MEA老鼠肝癌细胞株，由结果可知，相较于D2分离物浓度为零的组别，处理D2分离物能明显抑制肝癌细胞的生长，且抑制能力与D2分离物浓度剂量成正比，其50％抑制Huh-7人类肝癌细胞株及HepG2人类肝癌细胞株与BNL-1-MEA老鼠肝癌细胞株浓度分别为120.1μg/ml、48.6μg/ml与106.9μg/ml，显现D2分离物有极佳的抑癌效果。

图2C显示实施例一的HL60人类血癌细胞株与WEHI-3老鼠血癌细胞株的实验结果。横轴为D2分离物浓度，纵轴为存活细胞百分比，两条曲线分别为HL60人类血癌细胞株与WEHI-3老鼠血癌细胞株，由结果可知，相较于D2分离物浓度为零的组别，处理D2分离物能明显抑制血癌细胞的生长，且抑制能力与D2分离物浓度剂量成正比，其50％抑制HL60人类血癌细胞株与WEHI-3老鼠血癌细胞株浓度分别为65.7μg/ml与66.4μg/ml，显现D2分离物有极佳的抑癌效果。

图2D显示实施例一的A549人类肺癌细胞株与LLC1老鼠肺癌细胞株的实验结果。横轴为D2分离物浓度，纵轴为存活细胞百分比，两条曲线分别为A549人类肺癌细胞株与LLC1老鼠肺癌细胞株，由结果可知，相较于D2分离物浓度为零的组别，处理D2分离物能明显抑制肺癌细胞的生长，且抑制能力与D2分离物浓度剂量成正比，其50％抑制A549人类肺癌细胞株与LLC1老鼠肺癌细胞株浓度分别为124.5μg/ml与46.2μg/ml，显现D2分离物有极佳的抑癌效果。

由上述实施例一的结果可知，处理D2分离物于24小时后可明显抑制MDA-MB-231与4T1乳癌细胞株、Huh-7及HepG2与BNL-1-MEA肝癌细胞株、HL60与WEHI-3血癌细胞株和A549与LLC1肺癌细胞株的生长能力，其50％抑制浓度为38.2-181.9μg/ml，故可发展为抗癌药物。

图3A显示实施例一的4T1老鼠乳癌细胞株的实验结果。横轴为chlorosesamone浓度，纵轴为存活细胞百分比，由结果可知，相较于chlorosesamone浓度为零的组别，处理Chlorosesamone能明显抑制细胞的生长，且抑制能力与Chlorosesamone浓度剂量成正比，其50％抑制4T1老鼠乳癌细胞株为1.3μg/ml，显现Chlorosesamone有极佳的抑癌效果。

图3B显示实施例一的HepG2人类肝癌细胞株的实验结果。横轴为Chlorosesamone浓度，纵轴为存活细胞百分比，由结果可知，相较于chlorosesamone浓度为零的组别，处理Chlorosesamone能明显抑制细胞的生长，且抑制能力与Chlorosesamone浓度剂量成正比，其50％抑制HepG2人类肝癌细胞株为0.8μg/ml，显现Chlorosesamone有极佳的抑癌效果。

由上述实施例一的结果可知，Chlorosesamone纯化物能明显抑制4T1老鼠乳癌细胞株及HepG2人类肝癌细胞株的生长能力，其50％抑制浓度为0.8-1.3μg/ml，再者，所述的Chlorosesamone应为D2分离物的主要活性成分。