一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建与生产方法
阅读说明：本技术 一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建与生产方法 (Method for constructing and producing bs-5-YHEDA peptide vector capable of reducing iron and removing free radicals for treating Alzheimer's disease ) 是由 邹珍友 于 2020-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开的属于临床化学药剂合成技术领域,具体为一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建与生产方法,一种5’端为Ecor I限制性内切酶序列和3’端为Hind III限制性内切酶序列的含bs-5-YHEDA基因的DNA；该种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建与生产方法,通过缩合法开发制备了一种可跨越血脑屏障的bs-5-YHEDA肽,可进入AD脑组织降铁除自由基,将bs-5-YHEDA翻译成对应的DNA序列构建了人工基因,重组到分泌表达型载体pIN III ompA3,转化到大肠杆菌表达菌产bs-5-YHEDA肽,并借助载体表达的ompA导肽分泌到菌体外周,用盐析沉淀,透析和HPLC提纯,合成足够长度的多肽,节约生产成本,可实现量产,用于临床。(The invention discloses a method for constructing and producing a bs-5-YHEDA peptide vector capable of producing ferrum-reducing free radicals for treating Alzheimer disease, belonging to the technical field of synthesis of clinical chemical agents, in particular to a DNA containing a bs-5-YHEDA gene, wherein the 5 'end of the DNA is an Ecor I restriction endonuclease sequence and the 3' end of the DNA is a Hind III restriction endonuclease sequence; the bs-5-YHEDA peptide carrier capable of producing the iron-reducing free radical for treating the Alzheimer disease is constructed and produced by developing and preparing the bs-5-YHEDA peptide capable of crossing a blood brain barrier through a condensation method, entering AD brain tissues for reducing iron and removing free radicals, translating the bs-5-YHEDA into a corresponding DNA sequence to construct an artificial gene, recombining the artificial gene to a secretion expression carrier pIN III ompA3, transforming the artificial gene to escherichia coli expression bacteria to produce the bs-5-YHEDA peptide, secreting the cell periphery by virtue of ompA peptide expressed by the carrier, precipitating by salting out, dialyzing and purifying by HPLC, synthesizing a polypeptide with sufficient length, saving the production cost, realizing mass production and being used for clinic.)
技术领域
本发明涉及临床化学药剂合成技术领域，具体为一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建与生产方法。
背景技术
老年痴呆症又称为阿尔茨海默病，是老年人中常见的一种神经退行性疾病，临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明，发病时给病人和其家庭带来极大困扰。
对于老年痴呆症目前尚无有效疗法，研究发现随着年龄增长，脑内铁会逐渐积累含量变高，铁可催生自由基损害脑组织，是诱发AD的重要原因。
目前，在肽树脂上重复进行“Fmoc去保护——氨基酸缩合”反应方法，按照设计好氨基酸序列，从零开始，将第一个氨基酸连到树脂上，然后按顺序一个一个把后续的氨基酸缩合到已有的序列上去，每加一个氨基酸，进行一次缩合反应，直到所有的序列都缩合到前面已有的肽序列，就完成蛋白质的合成，合成了的可溶性的可跨越血脑屏障进入脑内螯合铁的多肽bs-5-YHEDA，以证明它可在脑内储铁，降自由基，保护脑组织神经元。
但是，这种制备方法周期长，成本高，可合成的序列短，一般少于100个氨基酸长度，难以满足需求，可合成序列短，无法获得需要长度和分子量的氨基酸，必然导致病人难以支付昂贵的药费，在用于临床过程中难以实现量产，无法为产业化打下基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建与生产方法，以解决上述背景技术中提出的现有的制备方法周期长，成本高，可合成的序列短，一般少于100个氨基酸长度，难以满足需求，可合成序列短，无法获得需要长度和分子量的氨基酸，必然导致病人难以支付昂贵的药费，在用于临床过程中难以实现量产，无法为产业化打下基础的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建，一种5’端为Ecor I限制性内切酶序列和3’端为Hind III限制性内切酶序列的含bs-5-YHEDA基因的DNA，经限制性内切酶Ecor I和Hind III酶切后，***到经限制性内切酶Ecor I和HindIII酶切的pIN III ompA3载体的多克隆片段切口之间，和pIN III ompA3载体的编码导肽的ompA DNA之后，形成pIN III ompA3-bs-5-YHEDA载体；
将pIN III ompA3-bs-5-YHEDA载体转化到JM101感受态大肠杆菌，在诱导表达后，pIN III ompA3载体中的启动子可启动bs-5-YHEDA基因转录翻译，ompA DNA转录翻译成的导肽可将bs-5-YHEDA分泌到菌体外周质，导肽被自动切除。
一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建的生产方法，该种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建的生产方法包括以下步骤：
S1：bs-5-HAYED人工基因构建：根据基因密码，编码bs-5-YHEDA肽的DNA序列为:5’-cat gcc tac cag gat cat gcc tac cag gat cat gcc tac cag gat cat gcc taccag gat cat gcc tac cag gat cag tca gac atc gtc gca caa tcc tcc taa-3’；
分别在两端加上EcoR I限制性酶识别序列“G^AA TTC”，和HIND III限制性酶识别序列“A^AG CTT”便于剪接***，3'末端加上终止密码子taa；
S2：分泌表达型载体pIN III ompA3-bs-5-YHEDA构建：委托公司合成以上DNA序列，用EcoR I和Hind III限制性内切酶将bs-5-HAYED人工基因切下来，提取存储在DH5α大肠杆菌中的分泌型表达载体pIN III ompA3质粒，用上述限制性内切酶将pIN III ompA3质粒的多克隆位点切开，并将切下的bs-5-HAYED人工基因用T4 DNA连接酶连到pIN IIIompA3切口内，最后成为pIN III ompA3-bs-5-YHEDA载体；
S3：转化与阳性菌落筛选：用CaCl2法制备JM101感受态细胞，将pIN III ompA3-bs-5-YHEDA载体质粒转化入JM101感受态细胞后，涂布到加有氨苄青霉素培养基的平皿，筛选AmpR的白色菌落，并用PCR和电泳鉴定；
S4：挑菌落扩增和诱导表达：挑单菌落，置10毫升中试管37℃摇床培养12小时后，将菌液移到250毫升三角瓶37℃振摇培养过夜，加入终浓度为0.01mM的IPTG，23℃震荡培养诱导表达4～6小时；
S5：细菌膜周质蛋白提取：离心收集菌体，重悬浮于含10mM pH7.5 Tris的20％蔗糖溶液中，0℃放置5分钟，再加入0.5M PH8.0的EDTA，0℃静置10分钟，离心去上清，沉淀经蒸馏水洗涤后，悬浮在1M PH7.6的Tris溶液中，0℃下放置30分钟，离心取上清加入1/10体积的100％三氯醋酸，0℃静置15分钟，离心弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤两次，冷冻干燥备用，该沉淀含有可溶性大肠杆菌细胞周质蛋白；
S6：HPLC提纯，MASS-测序鉴定收集的bs-5-YHEDA峰：用25％饱和度硫酸铵盐析除杂蛋白沉淀，将盐析后的蛋白液透析后经Lysine Sepharose亲和层析，将各峰收集上HPLCMono Q I阴高子交換柱，在pH8.5下进行梯度洗脱，除少量杂蛋白外，收集各峰用抗bs-5-HAYED抗体鉴别阳性反应的组分，并用质谱和蛋白测序仪鉴定。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建与生产方法，通过缩合法开发制备了一种可跨越血脑屏障的bs-5-YHEDA肽，可进入AD脑组织降铁除自由基，将bs-5-YHEDA翻译成对应的DNA序列构建了人工基因，重组到分泌表达型载体pIN III ompA3，转化到大肠杆菌表达菌产bs-5-YHEDA肽，并借助载体表达的ompA导肽分泌到菌体外周，用盐析沉淀，透析和HPLC提纯，合成足够长度的多肽，节约生产成本，可实现量产，用于临床，并为产业化打下基础。
附图说明
图1为本发明bs-5-YHEDA基因结构图示意图；
图2为本发明分泌表达型载体pIN III ompA3-bs-5-YHEDA构建示意图；
图3为本发明酶连鉴定示意图；
图4为本发明JM101提取质粒酶切鉴定示意图；
图5为本发明PCR扩增bs-5-YHEDA基因结果示意图；
图6为本发明质粒bs-5-YHEDA基因PCR测序结果示意图；
图7为本发明HPLC提纯示意图；
图8为本发明Western Blot鉴定HPLC提纯的周质蛋白中表达的bs-5-YHEDA示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建，一种5’端为Ecor I限制性内切酶序列和3’端为HindIII限制性内切酶序列的含bs-5-YHEDA基因的DNA，经限制性内切酶Ecor I和Hind III酶切后，***到经限制性内切酶Ecor I和Hind III酶切的pIN III ompA3载体的多克隆片段切口之间，和pIN III ompA3载体的编码导肽的ompA DNA之后，形成pIN III ompA3-bs-5-YHEDA载体；
将pIN III ompA3-bs-5-YHEDA载体转化到JM101感受态大肠杆菌，在诱导表达后，pIN III ompA3载体中的启动子可启动bs-5-YHEDA基因转录翻译，ompA DNA转录翻译成的导肽可将bs-5-YHEDA分泌到菌体外周质，导肽被自动切除。
一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建的生产方法，该种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建的生产方法包括以下步骤：
S1：bs-5-HAYED人工基因构建：根据基因密码，编码bs-5-YHEDA肽的DNA序列为:5’-cat gcc tac cag gat cat gcc tac cag gat cat gcc tac cag gat cat gcc taccag gat cat gcc tac cag gat cag tca gac atc gtc gca caa tcc tcc taa-3’；
分别在两端加上EcoR I限制性酶识别序列“G^AA TTC”，和HIND III限制性酶识别序列“A^AG CTT”便于剪接***，3'末端加上终止密码子taa；
S2：分泌表达型载体pIN III ompA3-bs-5-YHEDA构建：委托公司合成以上DNA序列，用EcoR I和Hind III限制性内切酶将bs-5-HAYED人工基因切下来，提取存储在DH5α大肠杆菌中的分泌型表达载体pIN III ompA3质粒，用上述限制性内切酶将pIN III ompA3质粒的多克隆位点切开，并将切下的bs-5-HAYED人工基因用T4 DNA连接酶连到pIN IIIompA3切口内，最后成为pIN III ompA3-bs-5-YHEDA载体；
S3：转化与阳性菌落筛选：用CaCl2法制备JM101感受态细胞，将pIN IIIompA3-bs-5-YHEDA载体质粒转化入JM101感受态细胞后，涂布到加有氨苄青霉素培养基的平皿，筛选AmpR的白色菌落，并用PCR和电泳鉴定；
S4：挑菌落扩增和诱导表达：挑单菌落，置10毫升中试管37℃摇床培养12小时后，将菌液移到250毫升三角瓶37℃振摇培养过夜，加入终浓度为0.01mM的IPTG，23℃震荡培养诱导表达4～6小时；
S5：细菌膜周质蛋白提取：离心收集菌体，重悬浮于含10mM pH7.5 Tris的20％蔗糖溶液中，0℃放置5分钟，再加入0.5M PH8.0的EDTA，0℃静置10分钟，离心去上清，沉淀经蒸馏水洗涤后，悬浮在1M PH7.6的Tris溶液中，0℃下放置30分钟，离心取上清加入1/10体积的100％三氯醋酸，0℃静置15分钟，离心弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤两次，冷冻干燥备用，该沉淀含有可溶性大肠杆菌细胞周质蛋白；
S6：HPLC提纯，MASS-测序鉴定收集的bs-5-YHEDA峰：用25％饱和度硫酸铵盐析除杂蛋白沉淀，将盐析后的蛋白液透析后经Lysine Sepharose亲和层析，将各峰收集上HPLCMono Q I阴高子交換柱，在pH8.5下进行梯度洗脱，除少量杂蛋白外，收集各峰用抗bs-5-HAYED抗体鉴别阳性反应的组分，并用质谱和蛋白测序仪鉴定。
实施例1
一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建的生产方法，该种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建的生产方法包括以下步骤：
S1：bs-5-HAYED人工基因构建：根据基因密码，编码bs-5-YHEDA肽的DNA序列为:5’-cat gcc tac cag gat cat gcc tac cag gat cat gcc tac cag gat cat gcc taccag gat cat gcc tac cag gat cag tca gac atc gtc gca caa tcc tcc taa-3’；
分别在两端加上EcoR I限制性酶识别序列“G^AA TTC”，和HIND III限制性酶识别序列“A^AG CTT”便于剪接***，3'末端加上终止密码子taa；
S2：分泌表达型载体pIN III ompA3-bs-5-YHEDA构建：委托公司合成以上DNA序列，用EcoR I和Hind III限制性内切酶将bs-5-HAYED人工基因切下来，提取存储在DH5α大肠杆菌中的分泌型表达载体pIN III ompA3质粒，用上述限制性内切酶将pIN III ompA3质粒的多克隆位点切开，并将切下的bs-5-HAYED人工基因用T4 DNA连接酶连到pIN IIIompA3切口内，最后成为pIN III ompA3-bs-5-YHEDA载体；
S3：转化与阳性菌落筛选：用CaCl2法制备JM101感受态细胞，将pIN III ompA3-bs-5-YHEDA载体质粒转化入JM101感受态细胞后，涂布到加有氨苄青霉素培养基的平皿，筛选AmpR的白色菌落，并用PCR和电泳鉴定；
S4：挑菌落扩增和诱导表达：挑单菌落，置10毫升中试管37℃摇床培养12小时后，将菌液移到250毫升三角瓶37℃振摇培养过夜，加入终浓度为0.01mM的IPTG，23℃震荡培养诱导表达6小时；
S5：细菌膜周质蛋白提取：离心收集菌体，重悬浮于含10mM pH7.5 Tris的20％蔗糖溶液中，0℃放置5分钟，再加入0.5M PH8.0的EDTA，0℃静置10分钟，离心去上清，沉淀经蒸馏水洗涤后，悬浮在1M PH7.6的Tris溶液中，0℃下放置30分钟，离心取上清加入1/10体积的100％三氯醋酸，0℃静置15分钟，离心弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤两次，冷冻干燥备用，该沉淀含有可溶性大肠杆菌细胞周质蛋白；
S6：HPLC提纯，MASS-测序鉴定收集的bs-5-YHEDA峰：用25％饱和度硫酸铵盐析除杂蛋白沉淀，将盐析后的蛋白液透析后经Lysine Sepharose亲和层析，将各峰收集上HPLCMono Q I阴高子交換柱，在pH8.5下进行梯度洗脱，除少量杂蛋白外，收集各峰用抗bs-5-HAYED抗体鉴别阳性反应的组分，并用质谱和蛋白测序仪鉴定。
实施例2
一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建的生产方法，该种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建的生产方法包括以下步骤：
S1：bs-5-HAYED人工基因构建：根据基因密码，编码bs-5-YHEDA肽的DNA序列为:5’-cat gcc tac cag gat cat gcc tac cag gat cat gcc tac cag gat cat gcc taccag gat cat gcc tac cag gat cag tca gac atc gtc gca caa tcc tcc taa-3’；
分别在两端加上EcoR I限制性酶识别序列“G^AA TTC”，和HIND III限制性酶识别序列“A^AG CTT”便于剪接***，3'末端加上终止密码子taa；
S2：分泌表达型载体pIN III ompA3-bs-5-YHEDA构建：委托公司合成以上DNA序列，用EcoR I和Hind III限制性内切酶将bs-5-HAYED人工基因切下来，提取存储在DH5α大肠杆菌中的分泌型表达载体pIN III ompA3质粒，用上述限制性内切酶将pIN III ompA3质粒的多克隆位点切开，并将切下的bs-5-HAYED人工基因用T4 DNA连接酶连到pIN IIIompA3切口内，最后成为pIN III ompA3-bs-5-YHEDA载体；
其中，质粒pIN III ompA3酶切步骤：
限制性内切酶反应在灭菌的0.5ml离心管中进行；
pIN III ompA3质粒0.2-1μg；
10×酶切buffer2.0μl；
EcoR I，Hind III限制性内切酶1-2U(单位)；
加ddH2O至20μl；
限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，37℃水浴消化3小时；
酶连反应：
pIN III ompA3载体DNA，6μl；
5-HAYED-基因DNA，6μl；
10×连接缓冲液，1μl；
T4 DNA连接酶，0.1μl；
ddH2O，3μl；
先在冰上静置10分钟，再37℃孵育12小时，然后65℃灭活15分钟，完成人工基因构建；
连接成功与否的鉴定需取2μl酶连产物，加在含2μl EB的琼脂糖凝胶空孔内，在110V，电泳，若有比空质粒载体大的条带存在，则连接成功；
S3：转化与阳性菌落筛选：用CaCl2法制备JM101感受态细胞，将pIN IIIompA3-bs-5-YHEDA载体质粒转化入JM101感受态细胞后，涂布到加有氨苄青霉素培养基的平皿，筛选AmpR的白色菌落，并用PCR和电泳鉴定，其中，PCR步骤为：在93℃预变性5min；93℃为40s→58℃为30s→72℃为60s，循环35次；72℃保温7min；结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存；
S4：挑菌落扩增和诱导表达：挑单菌落，置10毫升中试管37℃摇床培养12小时后，将菌液移到250毫升三角瓶37℃振摇培养过夜，加入终浓度为0.01mM的IPTG，23℃震荡培养诱导表达6小时；
S5：细菌膜周质蛋白提取：离心收集菌体，重悬浮于含10mM pH7.5 Tris的20％蔗糖溶液中，0℃放置5分钟，再加入0.5M PH8.0的EDTA，0℃静置10分钟，离心去上清，沉淀经蒸馏水洗涤后，悬浮在1M PH7.6的Tris溶液中，0℃下放置30分钟，离心取上清加入1/10体积的100％三氯醋酸，0℃静置15分钟，离心弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤两次，冷冻干燥备用，该沉淀含有可溶性大肠杆菌细胞周质蛋白；
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备方式为：
从于37℃培养20小时的新鲜平板中挑取一个JM101单菌落，直径3mm转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中，于37℃剧烈振摇培养约3小时，为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞/ml，可每隔30分钟测量OD600值来监测培养物的生长情况；
在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃；
于4℃，离心10分钟，以回收细胞；
倒出培养液，将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽；
以10ml用冰预冷的0.1mol/L Cacl 2重悬每份沉淀，放置于冰浴上；
于4℃，离心10分钟以回收细胞；
倒出培养液，将管倒置1分钟以使最后残留的这量培养液流尽；
每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl 2重悬每份细胞沉淀；
分装成200ul，贮存于-70℃、4℃备用；
接着，将重组质粒转化大肠杆菌：
用贮存于-70℃、4℃或新鲜的JM101感受态细胞悬液中各取200ul转移到无菌的微量离心管中，每管加pIN III ompA3-bs-5-YHEDA质粒DNA(体积<10ul，DNA<50ng)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟；
将管放到预加温到42℃的循环水浴中，恰恰放置90秒，不要摇动试管；
快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2分钟；
每管加800ul SOC培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，如果要求更高的转化效率，在复苏期中，应温和地摇动细胞；
将适当体积，每个90mm平板可达200ul已转化的感受态细胞转移到20mMMgSO4和氨苄青霉素的SOB琼脂培养基上，用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平板表面；
将平板置于室温直至液体被吸收；
倒置平皿，于37℃培养，16小时后可出现菌落；
S6：HPLC提纯，MASS-测序鉴定收集的bs-5-YHEDA峰：用25％饱和度硫酸铵盐析除杂蛋白沉淀，将盐析后的蛋白液透析后经Lysine Sepharose亲和层析，将各峰收集上HPLCMono Q I阴高子交換柱，在pH8.5下进行梯度洗脱，除少量杂蛋白外，收集各峰用抗bs-5-HAYED抗体鉴别阳性反应的组分，并用质谱和蛋白测序仪鉴定。
综合以上所述，该种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建与生产方法，通过缩合法开发制备了一种可跨越血脑屏障的bs-5-YHEDA肽，可进入AD脑组织降铁除自由基，将bs-5-YHEDA翻译成对应的DNA序列构建了人工基因，重组到分泌表达型载体pIN III ompA3，转化到大肠杆菌表达菌产bs-5-YHEDA肽，并借助载体表达的ompA导肽分泌到菌体外周，用盐析沉淀，透析和HPLC提纯，合成足够长度的多肽，节约生产成本，可实现量产，用于临床，并为产业化打下基础。
虽然在上文中已经参考实施例对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施例中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
序列表
<110> 桂林医学院
<120> 一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建与生产方法
<130> 2020.06.30
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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