阅读说明：本技术 Nkg2d daric受体 (NKG2D DARIC receptor ) 是由 梁炜亨 乔丹·贾儒尔 于 2018-12-14 设计创作，主要内容包括：本公开提供了用于靶向NKG2D配体的过继性T细胞疗法的经过改进的组合物,所述过继性T细胞疗法用于治疗、预防癌症、传染病、自身免疫性疾病、炎性疾病和免疫缺陷或与其相关的病状或改善其至少一种症状。(The present disclosure provides improved compositions for adoptive T cell therapy targeting NKG2D ligands for treating, preventing, or ameliorating at least one symptom of cancer, infectious disease, autoimmune disease, inflammatory disease, and immunodeficiency or conditions associated therewith.)

NKG2D DARIC受体

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年9月13日提交的美国临时申请第62/730,926号和于2017年12月14日提交的62/598,902的权益，所述美国临时申请中的每一个都以全文引用的方式并入本文中。

关于序列表的声明

与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且在此通过引用并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称为BLBD_091_02WO_ST25.txt。所述文本文件为50KB，于2018年12月13日创建并且在提交本说明书的同时通过EFS-Web以电子方式提交。

技术领域

本公开涉及经过改进的过继性细胞疗法。更具体地说，本公开涉及经过改进的化学调节的信号传导分子、细胞以及使用其的方法，所述方法用于调节在过继性免疫疗法期间的细胞信号起始和下游应答的空间和时间控制。

背景技术

全球受癌症困扰的人数在1975年到2000年间翻了一番。癌症是全球发病率和死亡率的第二大原因，其中在2012年，新发病例约为1410万，癌症相关死亡人数达820万。最常见的癌症是乳腺癌、肺癌和支气管癌、***癌、结肠癌和直肠癌、膀胱癌、皮肤黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、甲状腺癌、肾癌和肾盂癌、子宫内膜癌、白血病和胰腺癌。预计未来二十年内新发癌症病例的数量将上升到2200万。

过继性细胞疗法正在成为一种用于递送复杂的生物信号以治疗癌症的强大范例。与小分子和生物药物组合物相比，过继性细胞疗法由于其极大数量的感觉和应答程序以及日益明确的遗传控制机制而具有执行独特治疗任务的潜力。为了实现这种治疗价值，细胞需要装有用于感测和整合与局部生理环境相关的化学和/或生物学信息的机器。

发明内容

本公开总体上部分地涉及NKG2D DARIC组合物、多核苷酸、多肽及其制备和使用方法。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种非天然细胞，其包括：第一多核苷酸，所述第一多核苷酸对第一多肽进行编码，所述第一多肽包括：FK506结合蛋白(FKBP)多聚化结构域多肽或其变体；第一跨膜结构域；一个或多个细胞内信号传导结构域；以及第二多核苷酸，所述第二多核苷酸对第二多肽进行编码，所述第二多肽包括：NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；FKBP-雷帕霉素结合(FRB)多聚化结构域多肽或其变体；以及第二跨膜结构域和任选地共刺激结构域；其中桥接因子促进在非天然细胞表面上形成多肽复合物，其中所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域缔合并且被安置在所述多聚化结构域之间。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种非天然细胞，其包括：第一多核苷酸，所述第一多核苷酸对第一多肽进行编码，所述第一多肽包括：FRB多聚化结构域多肽或其变体；第一跨膜结构域；一个或多个细胞内信号传导结构域；以及第二多核苷酸，所述第二多核苷酸对第二多肽进行编码，所述第二多肽包括：NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；FKBP多聚化结构域多肽或其变体；以及第二跨膜结构域和任选地共刺激结构域；其中桥接因子促进在非天然细胞表面上形成多肽复合物，其中所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域缔合并且被安置在所述多聚化结构域之间。

在特定实施例中，所述FKBP多聚化结构域是FKBP12。

在另外的实施例中，所述FRB多肽是FRB T2098L。

在另外的实施例中，所述桥接因子选自由以下组成的组：AP21967、西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)、诺氟莫司(novolimus)、吡美莫司(pimecrolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、他克莫司(tacrolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)、乌米莫司(umirolimus)和佐他莫司(zotarolimus)。

在特定实施例中，所述第一多肽包括CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域。

在特定实施例中，所述第一多肽包括CD8α跨膜结构域。

在某些实施例中，所述一个或多个细胞内信号传导结构域从选自由以下组成的组的共刺激分子中分离：Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、半胱天冬酶募集结构域家族成员11(CARD11)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD94、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DNAX-活化蛋白10(DAP10)、用于活化T细胞家族成员1的接头(LAT)、含SH2结构域的76kD白细胞蛋白(SLP76)、T细胞受体相关的跨膜衔接子1(TRAT1)、TNFR2、TNF受体超家族成员14(TNFRS14)、TNF受体超家族成员18(TNFRS18)、TNF受体超家族成员25(TNFRS25)和T细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)。

在特定实施例中，所述第一多肽包括CD137共刺激结构域。

在特定实施例中，所述一个或多个细胞内信号传导结构域是从由以下组成的组中分离的初级信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

在特定实施例中，所述第一多肽包括CD3ζ初级信号传导结构域。

在优选实施例中，所述第一多肽包括CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。

在特定实施例中，所述第二跨膜结构域选自由以下组成的组：CD4跨膜结构域、CD8α跨膜结构域、CD278跨膜结构域和无羊膜蛋白(AMN)跨膜结构域。

在特定实施例中，所述第二多肽包括CD4跨膜结构域。

在某些实施例中，所述第二多肽的所述共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、半胱天冬酶募集结构域家族成员11(CARD11)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD94、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DNAX-活化蛋白10(DAP10)、用于活化T细胞家族成员1的接头(LAT)、含SH2结构域的76kD白细胞蛋白(SLP76)、T细胞受体相关的跨膜衔接子1(TRAT1)、TNFR2、TNFRS14、TNFRS18、TNFRS25和T细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)。

在一些实施例中，所述第二多肽的所述共刺激结构域是从OX40或TNFR2中分离的共刺激结构域。

在特定实施例中，所述非天然细胞进一步包括对工程化抗原受体进行编码的多核苷酸。

在某些实施例中，所述工程化抗原受体选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或zetakine。

在某些实施例中，所述工程化抗原受体是结合选自由以下组成的组的抗原的CAR：B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD79A、CD79B、EGFR和EGFRvIII。

在特定实施例中，所述非天然细胞进一步包括第三多核苷酸，所述第三多核苷酸对第三多肽进行编码，所述第三多肽包括抗体或其抗原结合片段、多聚化结构域、跨膜结构域以及任选地共刺激结构域，其中所述共刺激结构域与所述第二多肽的所述共刺激结构域(如果存在的话)相同或不同。

在某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段结合选自由以下组成的组的抗原：B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD79A、CD79B、EGFR和EGFRvIII。

在特定实施例中，所述第三多肽包括FKBP多聚化结构域。

在特定实施例中，所述第三多肽包括FKBP12多聚化结构域。

在某些实施例中，所述第三多肽包括CD4跨膜结构域。

在某些实施例中，所述第三多肽的所述共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、半胱天冬酶募集结构域家族成员11(CARD11)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD94、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DNAX-活化蛋白10(DAP10)、用于活化T细胞家族成员1的接头(LAT)、含SH2结构域的76kD白细胞蛋白(SLP76)、T细胞受体相关的跨膜衔接子1(TRAT1)、TNFR2、TNFRS14、TNFRS18、TNFRS25和T细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种非天然细胞，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FK506结合蛋白(FKBP)多聚化结构域多肽或其变体；CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；和/或CD3ζ初级信号传导结构域；以及第二多肽，所述第二多肽包括：NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；FKBP-雷帕霉素结合(FRB)多聚化结构域多肽或其变体；以及CD4跨膜结构域、CD8α跨膜结构域、CD278跨膜结构域或无羊膜蛋白(AMN)跨膜结构域；其中桥接因子促进在非天然细胞表面上形成多肽复合物，其中所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域缔合并且被安置在所述多聚化结构域之间。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种非天然细胞，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FRB多聚化结构域多肽或其变体；CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；和/或CD3ζ初级信号传导结构域；以及第二多肽，所述第二多肽包括：NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；FKBP多聚化结构域多肽或其变体；以及CD4跨膜结构域、CD8α跨膜结构域、CD178跨膜结构域或无羊膜蛋白(AMN)跨膜结构域；其中桥接因子促进在非天然细胞表面上形成多肽复合物，其中所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域缔合并且被安置在所述多聚化结构域之间。

在特定实施例中，所述细胞是造血细胞。

在一些实施例中，所述细胞是T细胞。

在某些实施例中，所述细胞是CD3+、CD4+和/或CD8+细胞。

在特定实施例中，所述细胞是免疫效应细胞。

在另外的实施例中，所述细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或辅助T细胞。

在某些实施例中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。

在另外的实施例中，所述细胞的来源是外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤。

在特定实施例中，所述FKBP多聚化结构域是FKBP12。

在一些实施例中，所述FRB多肽是FRB T2098L。

在特定实施例中，所述桥接因子选自由以下组成的组：AP21967、西罗莫司、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。

在某些实施例中，所述第一多肽包括CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；以及CD3ζ初级信号传导结构域。

在另外的实施例中，所述第二多肽包括CD4跨膜结构域。

在特定实施例中，所述第二多肽包括共刺激结构域。

在某些实施例中，所述第二多肽的所述共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、半胱天冬酶募集结构域家族成员11(CARD11)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD94、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DNAX-活化蛋白10(DAP10)、用于活化T细胞家族成员1的接头(LAT)、含SH2结构域的76kD白细胞蛋白(SLP76)、T细胞受体相关的跨膜衔接子1(TRAT1)、TNFR2、TNFRS14、TNFRS18、TNFRS25和T细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)。

在一些实施例中，所述第二多肽的所述共刺激结构域是从OX40或TNFR2中分离的共刺激结构域。

在特定实施例中，所述第一多肽包括SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。

在特定实施例中，所述第二多肽包括SEQ ID NO:10中所示的NGK2D配体结合结构域多肽序列。

在特定实施例中，所述第二多肽包括SEQ ID NO:11中所示的NGK2D配体结合结构域多肽序列。

在特定实施例中，所述第二多肽包括SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。

在特定实施例中，所述非天然细胞进一步包括对工程化抗原受体进行编码的多核苷酸。

在某些实施例中，所述工程化抗原受体选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或zetakine。

在某些实施例中，所述工程化抗原受体是结合选自由以下组成的组的抗原的CAR：B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD79A、CD79B、EGFR和EGFRvIII。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种非天然细胞，其包括多肽复合物，所述多肽复合物包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FKBP多聚化结构域多肽或其变体；CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；和/或CD3ζ初级信号传导结构域；以及第二多肽，所述第二多肽包括：信号肽、NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；以及FRB多聚化结构域多肽或其变体；其中桥接因子促进在非天然细胞表面上形成多肽复合物，其中所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域缔合并且被安置在所述多聚化结构域之间。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种非天然细胞，其包括多肽复合物，所述多肽复合物包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FRB多聚化结构域多肽或其变体；CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；和/或CD3ζ初级信号传导结构域；以及第二多肽，所述第二多肽包括：信号肽、NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；以及FKBP多聚化结构域多肽或其变体；其中桥接因子促进在非天然细胞表面上形成多肽复合物，其中所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域缔合并且被安置在所述多聚化结构域之间。

在某些实施例中，所述细胞是造血细胞。

在一些实施例中，所述细胞是T细胞。

在特定实施例中，所述细胞是CD3+、CD4+和/或CD8+细胞。

在某些实施例中，所述细胞是免疫效应细胞。

在特定实施例中，所述细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或辅助T细胞。

在一些实施例中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。

在另外的实施例中，所述细胞的来源为外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤。

在特定实施例中，所述FKBP多聚化结构域是FKBP12。

在另外的实施例中，所述FRB多肽是FRB T2098L。

在另外的实施例中，所述桥接因子选自由以下组成的组：AP21967、西罗莫司、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。

在一些实施例中，所述第一多肽包括CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；以及CD3ζ初级信号传导结构域。

在某些实施例中，所述NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段包括SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列。

在另外的实施例中，当所述第一多肽和所述第二多肽被表达时，所述多聚化结构域在细胞外定位。

在特定实施例中，所述非天然细胞进一步包括对工程化抗原受体进行编码的多核苷酸。

在某些实施例中，所述工程化抗原受体选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或zetakine。

在某些实施例中，所述工程化抗原受体是结合选自由以下组成的组的抗原的CAR：B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD79A、CD79B、EGFR和EGFRvIII。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种融合多肽，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FK506结合蛋白(FKBP)多聚化结构域多肽或其变体；第一跨膜结构域；一个或多个细胞内信号传导结构域；多肽裂解信号；以及第二多肽，所述第二多肽包括：NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；FKBP-雷帕霉素结合(FRB)多聚化结构域多肽或其变体；以及第二跨膜结构域；其中桥接因子促进在非天然细胞表面上形成多肽复合物，其中所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域缔合并且被安置在所述多聚化结构域之间。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种融合多肽，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FRB多聚化结构域多肽或其变体；第一跨膜结构域；一个或多个细胞内信号传导结构域；多肽裂解信号；以及第二多肽，所述第二多肽包括：NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；FKBP多聚化结构域多肽或其变体；以及第二跨膜结构域；其中桥接因子促进在非天然细胞表面上形成多肽复合物，其中所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域缔合并且被安置在所述多聚化结构域之间。

在特定实施例中，所述FKBP多聚化结构域是FKBP12。

在另外的实施例中，所述FRB多肽是FRB T2098L。

在特定实施例中，所述第一多肽包括CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域。

在特定实施例中，所述第一多肽包括CD8α跨膜结构域。

在某些实施例中，所述一个或多个细胞内信号传导结构域从选自由以下组成的组的共刺激分子中分离：Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、半胱天冬酶募集结构域家族成员11(CARD11)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD94、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DNAX-活化蛋白10(DAP10)、用于活化T细胞家族成员1的接头(LAT)、含SH2结构域的76kD白细胞蛋白(SLP76)、T细胞受体相关的跨膜衔接子1(TRAT1)、TNFR2、TNF受体超家族成员14(TNFRS14)、TNF受体超家族成员18(TNFRS18)、TNF受体超家族成员25(TNFRS25)和T细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)。

在特定实施例中，所述第一多肽包括CD137共刺激结构域。

在特定实施例中，所述一个或多个细胞内信号传导结构域是从由以下组成的组中分离的初级信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

在特定实施例中，所述第一多肽包括CD3ζ初级信号传导结构域。

在优选实施例中，所述第一多肽包括CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。

在特定实施例中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解多肽。

在某些实施例中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解2A多肽。

在某些实施例中，所述多肽裂解信号是选自由以下组成的组的病毒自裂解多肽：***病毒(FMDV)(F2A)肽、马A型鼻炎病毒(ERAV)(E2A)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thoseaasigna virus)(TaV)(T2A)肽、猪捷申病毒-1(PTV-1)(P2A)肽、泰勒病毒2A肽以及脑心肌炎病毒2A肽。

在特定实施例中，所述第二跨膜结构域选自由以下组成的组：CD4跨膜结构域、CD8α跨膜结构域、CD278跨膜结构域和无羊膜蛋白(AMN)跨膜结构域。

在特定实施例中，所述第二多肽包括CD4跨膜结构域。

在特定实施例中，所述第二多肽包括共刺激结构域。

在某些实施例中，所述第二多肽的所述共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、半胱天冬酶募集结构域家族成员11(CARD11)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD94、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DNAX-活化蛋白10(DAP10)、用于活化T细胞家族成员1的接头(LAT)、含SH2结构域的76kD白细胞蛋白(SLP76)、T细胞受体相关的跨膜衔接子1(TRAT1)、TNFR2、TNFRS14、TNFRS18、TNFRS25和T细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)。

在一些实施例中，所述第二多肽的所述共刺激结构域是从OX40或TNFR2中分离的共刺激结构域。

在另外的实施例中，所述桥接因子选自由以下组成的组：AP21967、西罗莫司、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种融合多肽，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FK506结合蛋白(FKBP)多聚化结构域多肽或其变体；CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；和/或CD3ζ初级信号传导结构域；多肽裂解信号；以及第二多肽，所述第二多肽包括：NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；FKBP-雷帕霉素结合(FRB)多聚化结构域多肽或其变体；以及CD4跨膜结构域、CD8α跨膜结构域、CD278跨膜结构域或无羊膜蛋白(AMN)跨膜结构域。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种融合多肽，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FRB多聚化结构域多肽或其变体；CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；和/或CD3ζ初级信号传导结构域；多肽裂解信号；以及第二多肽，所述第二多肽包括：NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；FKBP多聚化结构域多肽或其变体；以及CD4跨膜结构域、CD8α跨膜结构域、CD278跨膜结构域或无羊膜蛋白(AMN)跨膜结构域。

在特定实施例中，所述FKBP多聚化结构域是FKBP12。

在另外的实施例中，所述FRB多肽是FRB T2098L。

在一些实施例中，所述第一多肽包括CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；以及CD3ζ初级信号传导结构域。

在另外的实施例中，所述第二多肽包括CD4跨膜结构域。

在特定实施例中，所述第二多肽包括共刺激结构域。

在某些实施例中，所述第二多肽的所述共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、半胱天冬酶募集结构域家族成员11(CARD11)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD94、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DNAX-活化蛋白10(DAP10)、用于活化T细胞家族成员1的接头(LAT)、含SH2结构域的76kD白细胞蛋白(SLP76)、T细胞受体相关的跨膜衔接子1(TRAT1)、TNFR2、TNFRS14、TNFRS18、TNFRS25和T细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)。

在一些实施例中，所述第二多肽的所述共刺激结构域是从OX40或TNFR2中分离的共刺激结构域。

在特定实施例中，所述第一多肽包括SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。

在特定实施例中，所述第二多肽包括SEQ ID NO:10中所示的NGK2D配体结合结构域多肽序列。

在特定实施例中，所述第二多肽包括SEQ ID NO:11中所示的NGK2D配体结合结构域多肽序列。

在特定实施例中，所述第二多肽包括SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。

在某些实施例中，所述融合多肽包括SEQ ID NO:5、8和10中的任一个所示的序列。

在特定实施例中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解多肽。

在某些实施例中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解2A多肽。

在某些实施例中，所述多肽裂解信号是选自由以下组成的组的病毒自裂解多肽：***病毒(FMDV)(F2A)肽、马A型鼻炎病毒(ERAV)(E2A)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(TaV)(T2A)肽、猪捷申病毒-1(PTV-1)(P2A)肽、泰勒病毒2A肽以及脑心肌炎病毒2A肽。

在某些实施例中，当所述第一多肽和所述第二多肽被表达时，所述多聚化结构域在细胞外定位。

在另外的实施例中，所述桥接因子选自由以下组成的组：AP21967、西罗莫司、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种融合多肽，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FKBP多聚化结构域多肽或其变体；CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；和/或CD3ζ初级信号传导结构域；多肽裂解信号；以及第二多肽，所述第二多肽包括：信号肽、NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；以及FRB多聚化结构域多肽或其变体。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种融合多肽，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FRB多聚化结构域多肽或其变体；CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；和/或CD3ζ初级信号传导结构域；多肽裂解信号；以及第二多肽，所述第二多肽包括：信号肽、NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；以及FKBP多聚化结构域多肽或其变体。

在另外的实施例中，所述FKBP多聚化结构域是FKBP12。

在一些实施例中，所述FRB多肽是FRB T2098L。

在特定实施例中，所述第一多肽包括CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；以及CD3ζ初级信号传导结构域。

在另外的实施例中，所述NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段包括SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列。

在某些实施例中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解多肽。

在特定实施例中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解2A多肽。

在另外的实施例中，所述多肽裂解信号是选自由以下组成的组的病毒自裂解多肽：***病毒(FMDV)(F2A)肽、马A型鼻炎病毒(ERAV)(E2A)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(TaV)(T2A)肽、猪捷申病毒-1(PTV-1)(P2A)肽、泰勒病毒2A肽以及脑心肌炎病毒2A肽。

在一些实施例中，当所述第一多肽和所述第二多肽被表达时，所述多聚化结构域在细胞外定位。

在另外的实施例中，所述桥接因子选自由以下组成的组：AP21967、西罗莫司、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种多肽复合物，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FK506结合蛋白(FKBP)多聚化结构域多肽或其变体；第一跨膜结构域；以及一个或多个细胞内信号传导结构域；以及第二多肽，所述第二多肽包括：NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；FKBP-雷帕霉素结合(FRB)多聚化结构域多肽或其变体；以及第二跨膜结构域；以及桥接因子，所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域缔合并且被安置在所述多聚化结构域之间。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种多肽复合物，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FRB多聚化结构域多肽或其变体；第一跨膜结构域；以及一个或多个细胞内信号传导结构域；第二多肽，所述第二多肽包括：NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；FKBP多聚化结构域多肽或其变体；以及第二跨膜；以及桥接因子，所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域缔合并且被安置在所述多聚化结构域之间。

在特定实施例中，所述FKBP多聚化结构域是FKBP12。

在另外的实施例中，所述FRB多肽是FRB T2098L。

在特定实施例中，所述第一多肽包括CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域。

在特定实施例中，所述第一多肽包括CD8α跨膜结构域。

在某些实施例中，所述一个或多个细胞内信号传导结构域从选自由以下组成的组的共刺激分子中分离：Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、半胱天冬酶募集结构域家族成员11(CARD11)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD94、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DNAX-活化蛋白10(DAP10)、用于活化T细胞家族成员1的接头(LAT)、含SH2结构域的76kD白细胞蛋白(SLP76)、T细胞受体相关的跨膜衔接子1(TRAT1)、TNFR2、TNF受体超家族成员14(TNFRS14)、TNF受体超家族成员18(TNFRS18)、TNF受体超家族成员25(TNFRS25)和T细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)。

在特定实施例中，所述第一多肽包括CD137共刺激结构域。

在特定实施例中，所述一个或多个细胞内信号传导结构域是从由以下组成的组中分离的初级信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

在特定实施例中，所述第一多肽包括CD3ζ初级信号传导结构域。

在优选实施例中，所述第一多肽包括CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。

在特定实施例中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解多肽。

在某些实施例中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解2A多肽。

在某些实施例中，所述多肽裂解信号是选自由以下组成的组的病毒自裂解多肽：***病毒(FMDV)(F2A)肽、马A型鼻炎病毒(ERAV)(E2A)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(TaV)(T2A)肽、猪捷申病毒-1(PTV-1)(P2A)肽、泰勒病毒2A肽以及脑心肌炎病毒2A肽。

在特定实施例中，所述第二跨膜结构域选自由以下组成的组：CD4跨膜结构域、CD8α跨膜结构域、CD278跨膜结构域和无羊膜蛋白(AMN)跨膜结构域。

在特定实施例中，所述第二多肽包括CD4跨膜结构域。

在特定实施例中，所述第二多肽包括共刺激结构域。

在某些实施例中，所述第二多肽的所述共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、半胱天冬酶募集结构域家族成员11(CARD11)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD94、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DNAX-活化蛋白10(DAP10)、用于活化T细胞家族成员1的接头(LAT)、含SH2结构域的76kD白细胞蛋白(SLP76)、T细胞受体相关的跨膜衔接子1(TRAT1)、TNFR2、TNFRS14、TNFRS18、TNFRS25和T细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)。

在一些实施例中，所述第二多肽的所述共刺激结构域是从OX40或TNFR2中分离的共刺激结构域。

在另外的实施例中，所述桥接因子选自由以下组成的组：AP21967、西罗莫司、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种多肽复合物，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FK506结合蛋白(FKBP)多聚化结构域多肽或其变体；CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；和/或CD3ζ初级信号传导结构域；第二多肽，所述第二多肽包括：NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；FKBP-雷帕霉素结合(FRB)多聚化结构域多肽或其变体；以及CD4跨膜结构域、CD8α跨膜结构域、CD278跨膜结构域或无羊膜蛋白(AMN)跨膜结构域；以及桥接因子，所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域缔合并且被安置在所述多聚化结构域之间。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种多肽复合物，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FRB多聚化结构域多肽或其变体；CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；和/或CD3ζ初级信号传导结构域；第二多肽，所述第二多肽包括：NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；FKBP多聚化结构域多肽或其变体；以及CD4跨膜结构域、CD8α跨膜结构域、CD278跨膜结构域或无羊膜蛋白(AMN)跨膜结构域；以及桥接因子，所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域缔合并且被安置在所述多聚化结构域之间。

在另外的实施例中，所述FKBP多聚化结构域是FKBP12。

在特定实施例中，所述FRB多肽是FRB T2098L。

在特定实施例中，所述第一多肽包括CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；以及CD3ζ初级信号传导结构域。

在某些实施例中，所述第二多肽包括CD4跨膜结构域。

在特定实施例中，所述第二多肽包括共刺激结构域。

在某些实施例中，所述第二多肽的所述共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、半胱天冬酶募集结构域家族成员11(CARD11)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD94、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DNAX-活化蛋白10(DAP10)、用于活化T细胞家族成员1的接头(LAT)、含SH2结构域的76kD白细胞蛋白(SLP76)、T细胞受体相关的跨膜衔接子1(TRAT1)、TNFR2、TNFRS14、TNFRS18、TNFRS25和T细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)。

在一些实施例中，所述第二多肽的所述共刺激结构域是从OX40或TNFR2中分离的共刺激结构域。

在特定实施例中，所述第一多肽包括SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。

在特定实施例中，所述第二多肽包括SEQ ID NO:10中所示的NGK2D配体结合结构域多肽序列。

在特定实施例中，所述第二多肽包括SEQ ID NO:11中所示的NGK2D配体结合结构域多肽序列。

在特定实施例中，所述第二多肽包括SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。

在另外的实施例中，所述桥接因子选自由以下组成的组：AP21967、西罗莫司、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。

在某些实施例中，当所述第一多肽和所述第二多肽被表达时，所述多聚化结构域在细胞外定位。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种多肽复合物，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FKBP多聚化结构域多肽或其变体；CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；和/或CD3ζ初级信号传导结构域；第二多肽，所述第二多肽包括：信号肽、NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；以及FRB多聚化结构域多肽或其变体；以及桥接因子，所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域缔合并且被安置在所述多聚化结构域之间。

在各个实施例中，本公开部分地设想一种多肽复合物，其包括：第一多肽，所述第一多肽包括：FRB多聚化结构域多肽或其变体；CD4跨膜结构域或CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；和/或CD3ζ初级信号传导结构域；第二多肽，所述第二多肽包括：信号肽、NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段；以及FKBP多聚化结构域多肽或其变体；以及桥接因子，所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域缔合并且被安置在所述多聚化结构域之间。

在特定实施例中，所述FKBP多聚化结构域是FKBP12。

在另外的实施例中，所述FRB多肽是FRB T2098L。

在一些实施例中，所述第一多肽包括CD8α跨膜结构域；CD137共刺激结构域；以及CD3ζ初级信号传导结构域。

在特定实施例中，所述桥接因子选自由以下组成的组：AP21967、西罗莫司、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。

在某些实施例中，当所述第一多肽和所述第二多肽被表达时，所述多聚化结构域在细胞外定位。

在某些实施例中，提供了一种对本文所设想的第一多肽或第二多肽或融合多肽进行编码的多核苷酸。

在特定实施例中，提供了一种对本文所设想的第一多肽或第二多肽或融合多肽进行编码的cDNA。

在特定实施例中，提供了一种对本文所设想的第一多肽或第二多肽或融合多肽进行编码的RNA。

在特定实施例中，提供了一种包括本文所设想的多核苷酸的载体。

在一些实施例中，提供了一种包括本文所设想的非天然细胞、融合多肽、多核苷酸或载体的组合物。

在另外的实施例中，提供了一种包括本文所设想的药学上可接受的载剂和非天然细胞、融合多肽、多核苷酸或载体的药物组合物。

在特定实施例中，提供了一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所设想的组合物。

在另外的实施例中，提供了一种治疗、预防癌症、传染病、自身免疫性疾病、炎性疾病和免疫缺陷或与其相关的病状或改善其至少一种症状的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所设想的组合物。

在某些实施例中，提供了一种治疗实体癌的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所设想的组合物。

在一些实施例中，所述实体癌包括肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、睾丸癌、膀胱癌、脑癌、肉瘤、头颈癌、骨癌、甲状腺癌、肾癌或皮肤癌。

在特定实施例中，所述实体癌是胰腺癌、肺癌或乳腺癌。

在某些实施例中，提供了一种治疗血液恶性肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所设想的组合物。

在特定实施例中，所述血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。

附图说明

图1示出了代表性NKG2D DARIC的草图。

图2示出了各种NKG2D配体在被工程化以表达BCMA和GFP的K562细胞(K562-BCMA-GFP细胞)上的表达。

图3示出了来自细胞毒性测定的结果。用对NKG2D DARIC或抗BCMA CAR进行编码的LVV转导供体PBMC细胞，并在存在/不存在1nM雷帕霉素的情况下以5:1的效应子:靶标(E:T)比率将所述供体PBMC细胞与K562-BCMA-GFP细胞一起培养。

图4示出了在存在或不存在雷帕霉素的情况下来自以1:1的E:T比率与NKG2DDARIC、NKG2D CAR或抗BCMA CAR一起培养24小时的K562-BCMA-GFP细胞的IFNγ、TNFα、IL-17α、GM-CSF、IL-4和IL-2表达。

图5示出了各种NKG2D配体和EFGR在HCT116细胞上的表达。

图6示出了在存在或不存在雷帕霉素或NKG2D阻断抗体的情况下来自以1:1的E:T比率与NKG2D DARIC或抗EGFR CAR一起培养24小时的HCT116细胞的IFNγ、TNFα、IL-17α和GM-CSF表达。

图7示出了各种NKG2D配体在Nalm-6细胞、RPMI-8226细胞和A549细胞上的表达。

图8示出了来自细胞毒性测定的结果。用对NKG2D DARIC或抗EGFR CAR进行编码的LVV转导供体PBMC，并在存在/不存在1nM雷帕霉素的情况下以10:1的效应子:靶标(E:T)比率将所述供体PBMC与A549细胞一起培养。

图9示出了在存在或不存在雷帕霉素的情况下来自以1:1的E:T比率用NKG2DDARIC或抗CD19 CAR(Nalm-6细胞)、抗BCMA CAR(RPMI-8226细胞)或抗EGFR CAR(A549细胞)培养24小时的Nalm-6细胞、RPMI-8226细胞和A549细胞的IFNγ表达。

图10A示出了chNKG2D CAR的草图。

图10B示出了NKG2D DARIC T细胞与未经转导的对照T细胞(UTD)保持相同的CD4:CD8比率。

图11A示出了来自细胞毒性测定的结果。用对NKG2D DARIC、抗EGFR CAR或chNKG2DCAR进行编码的LVV转导供体PBMC，并在存在或不存在雷帕霉素的情况下将所述供体PBMC与EGFR⁺NKG2DL⁺A549细胞一起培养。

图11B示出了在存在或不存在AP21967的情况下由以1:1的E:T比率与未经转导的对照T细胞、抗EGFR CAR T细胞、chNKG2D CAR T细胞或NKG2D DARIC T细胞共培养24小时的EGFR⁺NKG2DL⁺A549细胞的培养上清液产生的IFNγ。

图12A示出了与用LVV转导的T细胞相比，未经转导的T细胞的生长动力学，所述LVV对具有包括CD4跨膜结构域的结合组分的NKG2D DARIC或具有包括AMN跨膜结构域的结合组分的NKG2D DARIC进行编码。

图12B示出了未经转导的T细胞和用LVV转导的T细胞的CD4⁺门中的NKG2D结合结构域表达，所述LVV对具有包括CD4跨膜结构域的结合组分的NKG2D DARIC或具有包括AMN跨膜结构域的结合组分的NKG2D DARIC进行编码。

图12C示出了在存在或不存在1nM雷帕霉素的情况下由以1:1的E:T比率与未经转导的对照T细胞和用LVV转导的T细胞共培养24小时的EGFR⁺NKG2DL⁺A549细胞的培养上清液产生的IFNγ、TNFα、GM-CSF和IL-17A，所述LVV对具有包括CD4跨膜结构域的结合组分的NKG2D DARIC或具有包括AMN跨膜结构域的结合组分的NKG2D DARIC进行编码。

图13A示出了NKG2D DARIC构建体、构建体BW2763以及构建体BW2764的草图；所述构建体BW2763含有包括NKG2D跨膜结构域的DARIC信号传导组分；所述构建体BW2764含有具有替代架构的DARIC信号传导和结合组分。

图13B示出了未经转导的T细胞和用对NKG2D DARIC、BW2763或BW2764进行编码的LVV转导的T细胞的CD4⁺门中的NKG2D结合结构域表达。

图13C示出了由以1:1的E:T比率与未经转导的对照T细胞和用对NKG2D DARIC、BW2763或BW2764进行编码的LVV转导的T细胞在媒剂或雷帕霉素中共培养24小时的EGFR⁺NKG2DL⁺A549细胞的培养上清液产生的IFNγ。

图14A示出了包括具有共刺激结构域的DARIC结合组分的NKG2D DARIC架构的草图。

图14B示出了未经转导的T细胞、NKG2D DARIC T细胞、NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞、NKG2D.OX40 DARIC T细胞、NKG2D.CD27 DARIC T细胞、NKG2D.HVEM DARIC T细胞、NKG2D.DR3 DARIC T细胞和NKG2D.GITR DARIC T细胞的CD4⁺门中的NKG2D结合结构域表达。

图14C示出了未经转导的T细胞、NKG2D DARIC T细胞、NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞、NKG2D.OX40 DARIC T细胞、NKG2D.CD27 DARIC T细胞、NKG2D.HVEM DARIC T细胞、NKG2D.DR3 DARIC T细胞和NKG2D.GITR DARIC T细胞的生长动力学。

图14D示出了由以1:1的E:T比率与未经转导的对照T细胞、NKG2D DARIC T细胞、NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞、NKG2D.OX40 DARIC T细胞、NKG2D.CD27 DARIC T细胞、NKG2D.HVEM DARIC T细胞、NKG2D.DR3 DARIC T细胞或NKG2D.GITR DARIC T细胞在雷帕霉素中共培养24小时的EGFR⁺NKG2DL⁺HCT116细胞的培养上清液产生的IFNγ、TNFα和GM-CSF。

图15A示出了由以1:1的E:T比率与NKG2D DARIC T细胞、NKG2D.OX40 DARIC T细胞或NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞在媒剂、雷帕霉素或AP21967中共培养24小时的EGFR⁺NKG2DL⁺A549细胞的培养上清液产生的IFNγ、TNFα和GM-CSF。

图15B示出了由以1:1的E:T比率与NKG2D DARIC T细胞、NKG2D.OX40 DARIC T细胞或NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞在媒剂、雷帕霉素或AP21967中共培养24小时的EGFR⁺NKG2DL⁺A549细胞的培养上清液产生的IFNγ、TNFα和GM-CSF。

图15C示出了当用AP2167对雷帕霉素处理T细胞共培养物时产生的细胞因子的比率。抗EGFR CAR T细胞、NKG2D DARIC T细胞、NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞和NKG2D.OX40DARIC T细胞以1:1的E:T比率在雷帕霉素或AP21967中与A549或HCT116靶细胞共培养。示出了由经AP2167培养的产生的细胞因子除以由雷帕霉素培养物产生的细胞因子的比率。箭头示出雷帕霉素介导的免疫抑制(>1)或雷帕霉素介导的免疫增强(<1)。

图16A示出了包括具有两个共刺激结构域的DARIC结合组分的NKG2D DARIC架构的草图。

图16B示出了由以1:1的E:T比率与未经转导的对照T细胞、NKG2D DARIC T细胞、NKG2D.DAP10 DARIC T细胞、NKG2D.CD28 DARIC T细胞或NKG2D.CD28.DAP10DARIC T细胞在媒剂或雷帕霉素中共培养24小时的EGFR⁺NKG2DL⁺A549细胞的培养上清液产生的IFNγ和GM-CSF。

图16C示出了由以1:1的E:T比率与未经转导的对照T细胞、NKG2D DARIC T细胞、NKG2D.DAP10 DARIC T细胞、NKG2D.DAP10.OX40 DARIC T细胞或NKG2D.OX40.DAP10 DARICT细胞在媒剂或雷帕霉素中共培养24小时的EGFR⁺NKG2DL⁺A549细胞的培养上清液产生的IFNγ和GM-CSF。

图17A示出了包括具有基于ICOS的跨膜结构域和共刺激结构域的DARIC结合组分的NKG2D DARIC架构的草图。

图17B示出了由以1:1的E:T比率与抗EGFR CAR T细胞、NKG2D DARIC T细胞或含有源自ICOS和DAP10的单或双共刺激结构域和跨膜结构域的NKG2D DARIC T细胞在AP21967中共培养24小时的EGFR⁺NKG2DL⁺A549细胞的培养上清液产生的IFNγ。

图17C示出了由以1:1的E:T比率与抗EGFR CAR T细胞、NKG2D DARIC T细胞或含有源自ICOS和DAP10的单或双共刺激结构域和跨膜结构域的NKG2D DARIC T细胞在AP21967中共培养24小时的EGFR⁺NKG2DL⁺A549细胞的培养上清液产生的GM-CSF。

图18A示出了双靶向DARIC策略的草图：NKG2D DARIC包括具有共刺激结构域的DARIC结合组分以及抗CD19 DARIC结合组分。

图18B示出了未经转导的T细胞、NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞和NKG2D.TNFR2DARIC:CD19 DARIC T细胞的CD4⁺门中的NKG2D结合结构域表达。

图18C示出了未经转导的T细胞、CD19 DARIC T细胞和NKG2D.TNFR2 DARIC:CD19DARIC T细胞的CD19-Fc结合效率。

图18D示出了由细胞(A20)、细胞(A20-hCD19)和细胞(A549)的培养上清液产生的GM-CSF。以1:1的E:T比率将靶细胞与未经转导的对照T细胞、CD19 DARIC T细胞、NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞或NKG2D.TNFR2 DARIC:CD19 DARIC T细胞在AP21967中共培养24小时。

序列标识符简要说明

SEQ ID NO:1示出了FRB T2098L-CD8aTM-CD137-CD3z NKG2D DARIC信号传导组分的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2示出了FRB T2098L-CD8aTM-CD137-CD3z NKG2D DARIC信号传导组分的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3示出了NKG2D-FKBP12-CD4TM NKG2D DARIC结合组分的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4示出了NKG2D-FKBP12-CD4TM NKG2D DARIC结合组分的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5示出了包括被病毒P2A结构域分开的NKG2D DARIC结合组分和NKG2DDARIC信号传导组分的NKG2D DARIC多蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6示出了NKG2D-FKBP12-CD4TM-OX40 NKG2D DARIC结合组分的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7示出了NKG2D-FKBP12-CD4TM-TNFR2 NKG2D DARIC结合组分的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8示出了包括被分开的NKG2D DARIC信号传导组分、病毒P2A结构域和NKG2D DARIC.OX40结合组分的NKG2D DARIC多蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9示出了包括NKG2D DARIC信号传导组分、病毒P2A结构域和NKG2DDARIC.TNFR2结合组分的NKG2D DARIC多蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10示出了NKG2D多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11示出了NKG2D配体结合结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12-22示出了各种接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:23-47示出了蛋白酶裂解位点和自裂解多肽裂解位点的氨基酸序列。

具体实施方式

A.概述

癌症是世界范围内死亡的主要原因之一。最近，肿瘤学家介绍了遗传方法作为增强免疫识别和消除癌细胞的潜在手段。一种有前途的策略是用被基因工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞进行过继性细胞免疫疗法，所述CAR将这些CAR T细胞的细胞毒性重新定向到癌细胞。CAR T细胞疗法的显著限制是缺乏对CAR T细胞活性的空间和时间的控制。缺乏对CAR T细胞活性的控制可能触发一系列副作用，其中许多副作用开始时是细微的，但会迅速恶化。特别严重的并发症是细胞因子释放综合征(CRS)或“细胞因子风暴”，其中CAR T细胞诱导大量且可能致命的细胞因子释放。CRS可能产生危险的高烧、极度疲劳、呼吸困难和血压急剧下降。CRS还可能产生涉及神经系统的第二波副作用，包含神经毒性、震颤、头痛、混乱、失去平衡、说话困难、癫痫和幻觉。本文设想的组合物和方法为困扰过继性细胞疗法的这些和其它问题提供了解决方案。

本公开总体上涉及用于用二聚剂调节的免疫受体复合物(DARIC)来调节过继性细胞疗法的空间和时间控制的改进的组合物和方法。DARIC包括一种或多种DARIC结合组分和/或一种或多种DARIC信号传导组分。不希望受到任何特定理论的束缚，本文设想的DARIC组合物和方法提供了优于本领域中现有的CAR T细胞疗法的许多优点，包含但不限于对免疫效应细胞信号转导结合和信号传导活性的空间和时间两者的控制。DARIC时间控制通过桥接因子介导的DARIC结合组分与DARIC信号传导组分之间的缔合来引发信号传导的DARIC机制。DARIC空间控制通过DARIC结合组分上的结合结构域通过靶标抗原识别来参与信号传导机制。以此方式，当靶标抗原和桥接因子两者存在时，DARIC免疫效应细胞被活化。

自然杀伤组2D(NKG2D)受体在免疫细胞上表达，并在宿主抵抗传染病和癌症的过程中发挥作用。NKG2D配体(NKG2DL)配体未在健康的成人组织上广泛表达，但在各种癌细胞上混杂地表达。

在各个实施例中，本公开设想靶向表达NKG2D配体的细胞的DARIC。不希望受到任何特定理论的束缚，本发明的发明人意外地发现，NKG2D受体的配体结合结构域可以被重新格式化为DARIC架构，以为NKG2D DARIC T细胞介导的针对NKG2D配体表达性靶细胞的细胞毒性提供改进的空间和时间的控制。

在特定实施例中，NKG2D DARIC包含：多肽(DARIC信号传导组分)，所述多肽包括多聚化结构域多肽或其变体、跨膜结构域、共刺激结构域；和/或初级信号传导结构域；以及多肽(DARIC结合组分)，所述多肽包括NKG2D受体的NKG2D配体结合结构域或其NKG2D配体结合片段、多聚化结构域多肽或其变体，以及任选地跨膜结构域和/或共刺激结构域。在存在桥接因子的情况下，DARIC结合和信号传导组分通过桥接因子相互缔合，以形成具有功能活性的NKG2D DARIC。

在优选实施例中，DARIC结合组分和DARIC信号传导组分的多聚化结构域在细胞外定位。相比于细胞内定位，多聚化结构域的细胞外定位提供许多优点，包含但不限于结合结构域的更有效定位、对桥接因子调节的更高时间敏感性以及由于使用非免疫抑制剂量的特定桥接因子的能力而毒性较小。

本文设想了对DARIC、DARIC结合组分和DARIC信号传导组分进行编码的多核苷酸；DARIC结合组分、DARIC信号传导组分、DARIC蛋白复合物、DARIC融合蛋白；包括对DARIC、DARIC结合组分和DARIC信号传导组分进行编码和/或表达其的多核苷酸的细胞；以及使用其治疗免疫病症的方法。

重组(即，工程化)DNA、肽和寡核苷酸合成、免疫测定、组织培养、转化(例如，电穿孔、脂质转染)、酶促反应、纯化及相关技术和程序的技术通常可以如在本说明书全文中引用和讨论的如在微生物学、分子生物学、生物化学、分子遗传学、细胞生物学、病毒学和免疫学中的各种一般性和更具体参考文献中所描述的那样进行。参见例如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第3版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(约翰·威利父子出版公司(Wiley and Sons),2008年7月更新)；《精编分子生物学实验指南：当代分子生物学实验指南的方法概要(Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology)》,格林出版协会和威利跨学科出版社(Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience)；Glover,《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》,第I卷和第II卷(IRL出版社(IRL Press),美国牛津大学出版社(Oxford Univ.Press USA),1985)；《当前免疫学方案(Current Protocolsin Immunology)》(由纽约州纽约市约翰·威立父子公司的John E.Coligan、AdaM.Kruisbeek、David H.Margulies、Ethan M.Shevach、Warren Strober 2001编辑)；《实时PCR：当前技术和应用(Real-Time PCR:Current Technology and Applications)》,由Julie Logan、Kirstin Edwards和Nick Saunders编辑,2009,英国诺福克凯斯特学术出版社(Caister Academic Press,Norfolk,UK)；Anand,《复杂基因组分析技术(Techniquesfor the Analysis of Complex Genomes)》,(学术出版社公司(Academic Press),纽约,1992)；Guthrie和Fink,《酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology)》,(学术出版社公司,纽约,1991)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(N.Gait编辑,1984)；《核酸杂交(Nucleic Acid The Hybridization)》(B.Hames和S.Higgins编辑,1985)；《转录和转译(Transcription and Translation)》(B.Hames和S.Higgins编辑,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.Freshney编辑,1986)；Perbal,《分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》(1984)；《下一代基因组测序(Next-Generation Genome Sequencing)》(Janitz,2008Wiley-VCH)；《PCR方案(分子生物学方法)(PCR Protocols(Methods in MolecularBiology))》(Park编辑,第3版,2010,胡马纳出版社(Humana Press))；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells And Enzymes)》(IRL出版社,1986)；论文《酶学方法(Methods InEnzymology)》(学术出版社公司,纽约)；《哺乳动物细胞基因转移载体(Gene TransferVectors For Mammalian Cells)》(J.H.Miller和M.P.Calos编辑,1987,冷泉港实验室出版社)；Harlow和Lane,《抗体(Antibodies)》,(冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1998)；《细胞和分子生物学中的免疫化学方法(Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology)》(Mayer和Walker编辑,学术出版社公司,伦敦,1987)；《实验免疫学手册(Handbook Of Experimental Immunology)》,第I卷到第IV卷(D.M.Weir和CC Blackwell编辑,1986)；Roitt,《基础免疫学(Essential Immunology)》,第6版,(布莱克韦尔科学出版社(Blackwell Scientific Publications,),牛津,1988)；《当代免疫学方案》(Q.E.Coligan、A.M.Kruisbeek、D.H.Margulies、E.M.Shevach和W.Strober编辑,1991)；《免疫学年度评论(Annual Review of Immunology)》；以及《免疫学进展(Advances in Immunology)》等期刊上的专著。

B.定义

在更详细地阐述本公开之前，对本发明的理解可能有助于提供本文所使用的某些术语的定义。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管类似于或等效于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料可以用于实践或测试特定实施例，但本文描述了组合物、方法和材料的优选实施例。出于本公开的目的，以下术语定义如下。

本文中使用冠词“一个/种(a/an)”和“所述(the)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种或一个/种或多个/种)所述冠词的语法宾语。举例来说，“要素”意指一个要素或者一个或多个要素。

替代方案(例如，“或”)的使用应该理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。

术语“和/或”应该理解为意指替代方案中的一种或两种。

如本文所使用的，术语“约(about或approximately)”是指与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比，变化幅度高达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“约”是指参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。

贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为暗示包含所陈述的步骤或要素或步骤或要素组，但不排除任何其它步骤或要素或步骤或要素组。“由……组成”意指包含并且限于，无论在短语“由……组成”之后是什么。因此，短语“由……组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的，并且可以不存在其它要素。“基本上由……组成”意指包含在所述短语之后所列出的任何要素，并且限于不干扰或促进本公开中针对所列元素指定的活动或行为的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”指示所列要素是必需的或强制性的，但不存在实质上影响所列要素的活动或动作的其它要素。

贯穿本说明书中对“一个实施例”、“实施例”、“特定实施例”、“相关实施例”、“某个实施例”、“另外的实施例”或“进一步的实施例”或其组合的引用意味着结合所述实施例所描述的特定特征、结构或特性包含在至少一个实施例中。因此，上述短语在贯穿本说明书的各个地方的出现不一定全部是指同一个实施例。此外，在一个或多个实施例中，可以以任何适合的方式组合特定特征、结构或特性。还应理解的是，在一个实施例中对特征的肯定叙述充当在特定实施例中排除所述特征的基础。

“抗原(Ag)”是指可以在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包含注射或吸收到动物内的组合物(如包含癌症特异性蛋白的组合物)。示例性抗原包含但不限于脂质、碳水化合物、多糖、糖蛋白、肽或核酸。抗原与具有特定体液或细胞免疫的产物反应，包含由如公开的抗原等异源抗原诱导的产物。

“靶抗原”或“所关注的靶抗原”是本文所设想的结合结构域被设计成与其结合的抗原。在特定实施例中，靶抗原选自由以下组成的组：α叶酸受体(FRα)、α_vβ₆整联蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3(CD276)、B7-H6、碳酸酐酶IX(CAIX)、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD133、CD138、CD171、癌胚抗原(CEA)、C型凝集素样分子1(CLL-1)、CD2子集1(CS-1)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、皮肤T细胞淋巴瘤相关抗原1(CTAGE1)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、上皮糖蛋白2(EGP2)、上皮糖蛋白40(EGP40)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、A型肝配蛋白受体2(EPHA2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fc受体样5(FCRL5)、胎儿乙酰胆碱酯酶受体(AchR)、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、包含ErbB2(HER2)的EGFR家族、IL-11Rα、IL-13Rα2、κ、癌/睾丸抗原2(LAGE-1A)、λ、Lewis-Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤抗原基因(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGEA10、被T细胞1识别的黑色素瘤抗原(MelanA或MART1)、间皮素(MSLN)、MUC1、MUC16、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)、聚唾液酸、胎盘特异性1(PLAC1)、黑色素瘤中优选表达的抗原(PRAME)、***干细胞抗原(PSCA)、***特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、滑膜肉瘤、X断点2(SSX2)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)、滋养层糖蛋白(TPBG)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)以及威尔姆斯肿瘤1(WT-1)。在一个实施例中，抗原是MHC-肽复合物，如I类MHC-肽复合物或II类MHC-肽复合物。

“NKG2D配体”是指被自然杀伤组2成员D(NKG2D)受体识别和/或结合的多肽。在人中已鉴定出两个NKG2D配体家族：MHC I类链相关蛋白A(MICA)和B(MICB)以及HCMV UL16结合蛋白(ULBP)、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6。MICA和MICB各自具有α1、α2、α3和跨膜结构域；ULBP1、ULBP2、ULBP3和ULBP6各自具有α1和α2结构域，并且是与细胞膜连接的糖基磷脂酰肌醇(GPI)；并且ULBP4和ULBP5各自具有α1和α2结构域以及跨膜结构域。NKG2D配体在许多人类癌细胞和免疫抑制细胞(肿瘤微环境内的T-reg和髓源性抑制细胞(MDSC))上以各种组合形式表达。表达一种或多种NKG2D配体的癌症包含但不限于癌(卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、肾癌、***癌、黑色素瘤、尤文氏肉瘤、胶质瘤和神经母细胞瘤)、白血病(AML、CML、CLL)、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。NKG2D配体也可以在慢性炎症的部位处被诱导，在一些感染后、局部照射后以及在用特定药物(例如，HDAC抑制剂和硼替佐米(bortezomib))处理后被瞬时诱导。

如本文所使用的，术语“结合结构域”、“细胞外结构域”、“抗原结合结构域”、“细胞外结合结构域”、“细胞外抗原结合结构域”、“抗原特异性结合结构域”和“细胞外抗原特异性结合结构域”可互换使用并且为多肽提供与所关注的靶抗原特异性地结合的能力。结合结构域可以源自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。

“NKG2D受体结合结构域或其NKG2D配体结合部分”是指必需或足以结合一种或多种NKG2D配体的NKG2D受体或其部分。自然杀伤组2成员D(NKG2D)(也被称为Klrk1)是一种C型凝集素样受体，其在自然杀伤(NK)细胞中被首次鉴定为活化的免疫受体。在人中，NKG2D作为共刺激受体在NK细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞的子集和γδT细胞的子集上表达。NKG2D受体结合结构域或其NKG2D配体结合部分结合一种或多种NKG2D配体，包含但不限于MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6。NKG2D的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:10中示出。

“抗体”是指属于包括至少轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽的结合剂，所述轻链或重链免疫球蛋白可变区特异性地识别并结合靶标的表位，如脂质、碳水化合物、多糖、糖蛋白、肽或含有抗原决定簇的核酸，如通过免疫细胞识别的那些。

“表位”或“抗原决定簇”是指结合剂结合的抗原的区。

抗体包含其抗原结合片段，如骆驼Ig、美洲驼Ig、羊驼Ig、Ig NAR、Fab'片段、F(ab')₂片段、双特异性Fab二聚体(Fab2)、三特异性Fab三聚体(Fab3)、Fv、单链Fv蛋白(“scFv”)、双-scFv、(scFv)₂、迷你抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定化Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb、骆驼科动物VHH、纳米抗体)以及全长抗体的负责抗原结合的部分。所述术语还包含基因工程化形式，如嵌合抗体(例如，人源化鼠类抗体)、异源缀合抗体(如双特异性抗体)及其抗原结合片段。还参见《皮尔斯目录和手册(Pierce Catalogand Handbook)》,1994-1995(伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯化学公司(Pierce ChemicalCo.,Rockford,IL))；Kuby,《免疫学期刊(J.,Immunology)》,第3版,W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.),纽约,1997。

“接头”是指为了分子的适当间隔和构象而添加的各个多肽结构域之间的多个氨基酸残基。在特定实施例中，接头是可变区连接序列。“可变区连接序列”是氨基酸序列，所述氨基酸序列连接VH结构域和VL结构域并且提供与两个子结合结构域的相互作用兼容的间隔子功能，使得所得多肽对与包括相同轻链可变区和重链可变区的抗体相同的靶分子保留特异性结合亲和力。在特定实施例中，接头将一个或多个重链可变结构域或轻链可变结构域、铰链结构域、多聚化结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或初级信号传导结构域分开。

适于在本文所设想的特定实施例中使用的接头的说明性实例包含但不限于以下氨基酸序列：GGG；DGGGS(SEQ ID NO:12)、TGEKP(SEQ ID NO:13)(参见例如Liu等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》5525-5530(1997))；GGRR(SEQ ID NO:14)(Pomerantz等人,1995,同上)；(GGGGS)_n，其中n＝1、2、3、4或5(SEQ ID NO:15)(Kim等人,《美国国家科学院院刊》93,1156-1160(1996))；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO:16)(Chaudhary等人,1990,《美国国家科学院院刊》87:1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:17)(Bird等人,1988,《科学(Science)》242:423-426)；GGRRGGGS(SEQ ID NO:18)；LRQRDGERP(SEQ ID NO:19)；LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO:20)；LRQKD(GGGS)₂ERP(SEQ ID NO:21)。可替代地，可以使用能够对DNA结合位点和肽本身两者进行建模的计算机程序(Desjarlais和Berg,《美国国家科学院院刊》90:2256-2260(1993),《美国国家科学院院刊》91:11099-11103(1994))或通过噬菌体展示方法合理地设计柔性接头。在一个实施例中，接头包括以下氨基酸序列：GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:22)(Cooper等人,《血液(Blood)》,101(4):1637-1644(2003))。

“间隔子结构域”是指将两个结构域分开的多肽。在一个实施例中，间隔子结构域使抗原结合结构域移动远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化(Patel等人,《基因疗法(Gene Therapy)》,1999,6,412-419)。在特定实施例中，间隔子结构域将一个或多个重链可变结构域或轻链可变结构域、多聚化结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或初级信号传导结构域分开。间隔子结构域可以源自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。在某些实施例中，间隔子结构域是免疫球蛋白的一部分，包含但不限于一个或多个重链恒定区，例如CH2和CH3。间隔子结构域可以包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或更改的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。

“铰链结构域”是指在将抗原结合结构域定位成远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化中起作用的多肽。在特定实施例中，多肽可以包括在结合结构域与多聚化结构域之间、在结合结构域与跨膜结构域(TM)之间或在多聚化结构域与跨膜结构域之间的一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以源自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。铰链结构域可以包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或更改的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。

如本文所使用的，“多聚化结构域”是指直接或经由桥连分子优先与另一个不同的多肽相互作用或缔合的多肽，例如，化学可诱导的二聚体，其中不同多聚化结构域的相互作用基本上有助于或高效地促进了多聚化(即，二聚体、三聚体或多分复合物的形成，所述二聚体、所述三聚体或所述多分复合物可以是同源二聚体、异源二聚体、同源三聚体、异源三聚体、同源多聚体、异多聚体)。多聚化结构域可以源自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。

适于在本文所设想的特定实施例中使用的多聚化结构域的说明性实例包含FK506结合蛋白(FKBP)多肽或其变体、FKBP-雷帕霉素结合(FRB)多肽或其变体、钙调神经磷酸酶多肽或其变体、亲环蛋白多肽或其变体、细菌二氢叶酸还原酶(DHFR)多肽或其变体、PYR1样1(PYL1)多肽或其变体、脱落酸不敏感1(ABI1)多肽或其变体、GIB1多肽或其变体或GAI多肽或其变体。

如本文所使用的，术语“FKBP-雷帕霉素结合多肽”是指FRB多肽。在特定实施例中，FRB多肽是FKBP12-雷帕霉素结合多肽。适于在本文所设想的特定实施例中使用的FRB多肽通常含有至少约85个到约100个氨基酸残基。在某些实施例中，参考GenBank登录号L34075.1，FRB多肽包括93个氨基酸序列Ile-2021至Lys-2113以及T2098L的突变。本文所设想的FRB多肽通过桥接因子与FKBP多肽结合，由此形成三元复合物。

如本文所使用的，术语“FK506结合蛋白”是指FKBP多肽。在特定实施例中，FKBP多肽是FKBP12多肽或包括F36V突变的FKBP12多肽。在某些实施例中，FKBP结构域也可以被称为“雷帕霉素结合结构域”。关于各种FKBP物种的核苷酸序列、克隆和其它方面的信息在本领域中是已知的(参见例如Staendart等人,《自然(Nature)》346:671,1990(人FKBP12)；Kay,《生物化学期刊(Biochem.J.)》314:361,1996)。本文所设想的FKBP多肽通过桥接因子与FRB多肽结合，由此形成三元复合物。

“桥接因子”是指与两个或更多个多聚化结构域缔合并且被安置在两个或更多个多聚化结构域之间的分子。在特定实施例中，多聚化结构域仅在桥接因子存在的情况下基本上有助于或高效地促进多肽复合物的形成。在特定实施例中，多聚化结构域在不存在桥接因子的情况下不会有助于或不会高效地促进多肽复合物的形成。适于在本文所设想的特定实施例中使用的桥接因子的说明性实例包含但不限于AP21967、雷帕霉素(西罗莫司)或其雷帕霉素类似物、库马霉素或其衍生物、赤霉素或其衍生物、脱落酸(ABA)或其衍生物、甲氨蝶呤或其衍生物、环孢菌素A或其衍生物、FKCsA或其衍生物、甲氧苄啶(Tmp)-FKBP合成配体(SLF)或其衍生物、或其任何组合。

雷帕霉素类似物(rapamycin analog/rapalog)包含但不限于美国专利第6,649,595号中公开的那些，其中雷帕霉素类似物结构通过引用整体并入本文中。在某些实施例中，桥接因子是与雷帕霉素相比具有显著降低的免疫抑制作用的雷帕霉素类似物。在优选实施例中，雷帕霉素类似物是AP21967(也被称为C-16-(S)-7-甲基吲哚雷帕霉素，IC₅₀＝10nM，经过化学修饰的非免疫抑制雷帕霉素类似物)。适于在本文所设想的特定实施例中使用的其它说明性雷帕霉素类似物包含但不限于依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。

“显著降低的免疫抑制作用”是指是针对在临床上或在人类免疫抑制活性的适当的体外(例如，抑制T细胞增殖)或体内替代物中测量的同一剂量观察或预期的免疫抑制作用的至少小于0.1倍到0.005倍。

“跨膜结构域”或“TM结构域”是将多肽与细胞的质膜锚定的结构域。TM结构域可以源自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。

术语“效应子功能”或“效应细胞功能”是指免疫效应细胞的专门功能。效应子功能包含但不限于活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒活性，包含细胞毒性因子的释放，或通过与免疫效应细胞上表达的受体进行抗原结合引发的其它细胞应答。

“细胞内信号传导结构域”或“胞内域”是指蛋白质的一部分，所述部分转导效应子功能信号并引导细胞执行专门功能。虽然通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个结构域。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度上，可以使用这种截短部分代替整个结构域，只要其转导效应子功能信号即可。术语细胞内信号传导结构域意指包含细胞内信号传导结构域的必需或足以转导效应子功能信号的任何截短部分。

已知的是，单独通过TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要次级信号或共刺激信号。因此，可以说T细胞活化由两种不同类别的细胞内信号传导结构域介导：初级信号传导结构域，其通过TCR(例如，TCR/CD3复合物)启动抗原依赖性初级活化；以及共刺激信号传导结构域，其是以抗原非依赖性方式起作用以提供次级信号或共刺激信号。

“初级信号传导结构域”是指以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化的细胞内信号传导结构域。以刺激方式起作用的初级信号传导结构域可以含有信号传导基序，所述信号传导基序被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。适于在特定实施例中使用的含ITAM初级信号传导结构域的说明性实例包含但不限于源自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。

如本文所使用的，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体之外的细胞表面分子，所述细胞表面分子提供在与抗原结合后使T淋巴细胞有效活化和起作用所需的第二信号。可以从其中分离共刺激结构域的这种共刺激分子的说明性实例包含但不限于：Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、半胱天冬酶募集结构域家族成员11(CARD11)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD94、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DNAX-活化蛋白10(DAP10)、用于活化T细胞家族成员1的接头(LAT)、含SH2结构域的76kD白细胞蛋白(SLP76)、T细胞受体相关的跨膜衔接子1(TRAT1)、TNFR2、TNF受体超家族成员14(TNFRS14；HVEM)、TNF受体超家族成员18(TNFRS18；GITR)、TNF受体超家族成员25(TNFRS25；DR3)和T细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)。

“免疫病症”是指引起免疫系统应答的疾病。在特定实施例中，术语“免疫病症”是指癌症、自身免疫疾病或免疫缺陷。在一个实施例中，免疫失调涵盖传染病。

如本文所使用的，术语“癌症”通常涉及异常细胞在没有控制的情况下***并且可能侵入附近组织的一类疾病或病状。

如本文所使用的，术语“恶性”是指一组肿瘤细胞显示出不受控制的生长(即，超出正常限度的***)、侵入(即，侵入和破坏相邻组织)和转移(即，经由淋巴或血液扩散到体内的其它位置)中的一种或多种的癌症。如本文所使用的，术语“转移”是指癌症从身体的一个部位扩散到另一个部位。由已经扩散的细胞形成的肿瘤被称为“转移性肿瘤”或“转移”。转移性肿瘤含有与原始(原发性)肿瘤中的细胞相似的细胞。

如本文所使用的，术语“良性”或“非恶性”是指可以长得更大但不扩散到身体的其它部位的肿瘤。良性肿瘤是自限性的并且通常不会侵入或转移。

“癌细胞”是指癌性生长或组织的单个细胞。癌细胞包含实体癌和液体癌。“肿瘤”或“肿瘤细胞”通常是指由细胞的异常生长形成的肿胀或病变，所述肿胀或病变可以是良性的、恶化前的(pre-malignant)或恶性的。大多数癌症形成肿瘤，但液体癌例如白血病不一定形成肿瘤。对于形成肿瘤的那些癌症，术语癌症(细胞)和肿瘤(细胞)可互换使用。个体中肿瘤的量是可以测量为肿瘤的数目、体积或重量的“肿瘤负荷”。

术语“复发”是指经过一段时间的改进或缓解后诊断出癌症重现或重现体征和症状。

“缓解”也被称为“临床缓解”并且包含部分缓解和完全缓解两者。在部分缓解中，一些但并非所有癌症体征和症状已经消失。在完全缓解中，所有癌症体征和症状均已消失，尽管癌可能仍在体内。

“难治”是指癌症对用特定治疗剂进行的疗法具有抗性或无应答。癌症可以在治疗开始时是难治的(即，对初始暴露于治疗剂无应答)，或者由于在第一治疗期内或在随后的治疗期期间对治疗剂产生抗性而是难治的。

“抗原阴性”是指不表达抗原或表达可忽略量的不可检测的抗原的细胞。在一个实施例中，抗原阴性细胞不结合被引导到抗原的受体。在一个实施例中，抗原阴性细胞基本上不结合被引导到抗原的受体。

“自身免疫疾病”是指身体对其自身组织的某个成分产生免疫原性(即，免疫系统)应答的疾病。换言之，免疫系统失去其将身体内的某个组织或系统识别为“自身”的能力并且靶向并攻击所述组织或系统，好像所述组织或系统是外来的一样。自身免疫疾病可以分类为其中主要是一个器官受影响的疾病(例如，溶血性贫血和抗免疫性甲状腺炎)以及其中自身免疫疾病过程通过许多组织弥漫的疾病(例如，系统性红斑狼疮)。例如，多发性硬化被认为是由T细胞攻击包围脑和脊髓的神经纤维的鞘而引起的。这导致协调丧失、虚弱和视力模糊。自身免疫疾病在本领域中是已知的并且包含例如桥本氏甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、格雷夫氏病(Grave's disease)、狼疮、多发性硬化、风湿性关节炎、溶血性贫血、抗免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮、乳糜泻、克罗恩氏病(Crohn's disease)、结肠炎、糖尿病、硬皮病、牛皮癣等。

“免疫缺陷”意指其免疫系统已经被疾病或化学品施用损害的患者的状态。这一病状使系统缺乏防御外来物质所需的数目和类型的血细胞。免疫缺陷病状或疾病在本领域中是已知的并且包含例如AIDS(获得性免疫缺陷综合征)、SCID(严重联合免疫缺陷疾病)、选择性IgA缺乏症、常见变异型免疫缺陷、X连锁无丙种球蛋白血症、慢性肉芽肿病、高IgM综合征和糖尿病。

“传染病”是指可以从人到人或从生物体到生物体传播并且由微生物或病毒剂引起的疾病(例如，普通感冒)。传染病在本领域中是已知的并且包含例如肝炎、性传播疾病(例如，衣原体、淋病)、结核病、HIV/AIDS、白喉、B型肝炎、C型肝炎、霍乱和流感。

如本文所使用的，术语“个体”和“受试者”经常可互换使用并且是指展现出可以用本文中其它地方所设想的组合物和方法治疗的癌症或其它免疫病症的症状的任何动物。适合的受试者(例如，患者)包含实验用动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家养动物或宠物(如猫或狗)。包含非人灵长类和优选地人类患者。典型的受试者包含患有、已经被诊断为患有或有风险患有癌症或另一种免疫病状的人类患者。

如本文所使用的，术语“患者”是指已经被诊断为患有可以用本文中的其它地方所公开的组合物和方法治疗的癌症或另一种免疫病症的受试者。

如本文所使用的，“治疗(treatment或treating)”包含对疾病或病理状况的症状或病理的任何有益的或期望的效果并且甚至可以包含正在治疗的疾病或病症的一个或多个可测量标志物的最低限度的减少。任选地，治疗可以涉及疾病或病状减少或者疾病或病状的进展延迟，例如延迟肿瘤生长。“治疗”不一定指示完全根除或治愈疾病或病症或其相关症状。

如本文所使用的，“预防(prevent)”和如“预防(prevented/preventing)”等类似词语指示用于预防、抑制或减少疾病或病症发生或复发的可能性。预防还是指延迟疾病或病症的发作或复发或者延迟疾病或病症的症状的发生或复发。如本文所使用的，“预防(prevention)”和类似词语还包含在疾病或病症发作或复发之前减少疾病或病症的强度、效果、症状和/或负担。

如本文所使用的，短语“减轻……的至少一种症状”是指减少正在治疗的受试者的疾病或病症的一种或多种症状。在特定实施例中，被治疗的疾病或病状是癌症，其中所减轻的所述一种或多种症状包含但不限于虚弱、疲劳、呼吸短促、容易挫伤和出血、频繁感染、***肿大、腹部肿胀或疼痛(由于腹部器官肿大)、骨骼或关节疼痛、骨折、意外体重减轻、食欲不振、盗汗、持续性轻度发烧以及排尿减少(由于肾功能受损)。

“增强”或“促进”或者“增加”或“扩增”通常是指与由媒剂或对照分子/组合物引起的应答相比，本文所设想的组合物能够产生、引发或引起更大的生理应答(即，下游效应)。可测量的生理应答可以包含T细胞扩增、活化、持续、细胞因子分泌的增加和/或癌细胞杀伤能力的增加以及从本领域的理解和本文中的描述中显而易见的其它方面。“增加的”或“增强的”量通常是“统计上显著的”量并且可以包含是由媒剂或对照组合物产生的应答的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含其间且在1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。

“减小”或“减弱”或“变少”或“减少”或“减轻”通常是指与由媒剂或对照分子/组合物引起的应答相比，本文所设想的组合物能够产生、引发或引起更少的应答(即，生理应答)。“减小的”或“减少的”量通常是“统计上显著”的量并且可以包含是由媒剂、对照组合物或特定细胞谱系中的应答产生的应答(参考应答)的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含其间且在1以上的所有整数和小数点，如1.5、1.6、1.7、1.8等)的减小。

“维持(maintain或maintenance)”或“保持”或“无变化”或“无实质变化”或“无实质减小”通常是指与由媒剂、对照分子/组合物或特定细胞谱系中的应答引起的应答相比，本文所设想的组合物能够在细胞中产生、引发或引起基本上类似的或相当的生理应答(即，下游效应)。相当的应答是与参考应答没有显著差异或可测量的差异的应答。

贯穿本公开阐述了额外定义。

C.NKG2D DARIC受体

在特定实施例中，设想了将免疫效应细胞的细胞毒性朝表达至少一种或多种靶抗原的癌细胞重新定向的一种或多种NKG2D DARIC受体。如本文所使用的，术语“NKG2D DARIC受体”是指一种或多种非天然存在的多肽，所述多肽在暴露于多聚剂或桥接因子时在免疫效应细胞中转导免疫刺激信号，例如，刺激免疫效应细胞的活性和功能，从而增加促炎性细胞因子的产生和/或分泌。在优选实施例中，NKG2D DARIC受体是包括DARIC信号传导组分和一种或多种DARIC结合组分的多链受体。在优选实施例中，NKG2D DARIC受体是包括DARIC信号传导组分和DARIC结合组分的多链受体。

在一个实施例中，从同一细胞表达DARIC信号传导组分和DARIC结合组分。在一个实施例中，从不同细胞表达DARIC信号传导组分和DARIC结合组分。在特定实施例中，从细胞表达DARIC信号传导组分，并且外源供应DARIC结合组分作为多肽。在一个实施例中，将预先装载有桥接因子的DARIC结合组分外源供应给表达DARIC信号传导组分的细胞。

1.DARIC信号传导组分

“DARIC信号传导组分”或“DARIC信号传导多肽”是指包括一个或多个多聚化结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域的多肽。在特定实施例中，DARIC信号传导组分包括多聚化结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或初级信号传导结构域。

适于在本文所设想的特定NKG2D DARIC信号传导组分中使用的多聚化结构域的说明性实例包含但不限于FK506结合蛋白(FKBP)多肽或其变体、或FKBP-雷帕霉素结合(FRB)多肽或其变体。在特定的优选实施例中，NKG2D DARIC信号传导组分包括包含T2098L突变的FRB多肽或其变体。在某些优选实施例中，NKG2D DARIC信号传导组分包括FKBP12多肽或其变体。

适于在本文所设想的特定NKG2D DARIC信号传导组分中使用的跨膜结构域的说明性实例包含但不限于T细胞受体的α链、β链、γ链或δ链的一个或多个跨膜区、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD71、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、CD278、AMN、PD1、NKG2A、NKG2B、NKG2C和NKG2D。在特定的优选实施例中，NKG2D DARIC信号传导组分包括CD8α跨膜结构域。在某些优选实施例中，NKG2DDARIC信号传导组分包括CD4跨膜结构域。

在各个优选实施例中，优选地在长度在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸之间的短寡肽接头或多肽接头连接跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。基于甘氨酸-丝氨酸的接头提供了特别适合的接头。

本文所设想的NKG2D DARIC信号传导组分包括一个或多个细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，NKG2D DARIC信号传导组分包括一个或多个共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。

适于在本文所设想的特定NKG2D DARIC信号传导组分中使用的含ITAM初级信号传导结构域的说明性实例包含但不限于源自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在特定的优选实施例中，NKG2D DARIC信号传导组分包括CD3ζ初级信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域。初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以按任何顺序与跨膜结构域的羧基端串联连接。

适于在本文所设想的特定NKG2D DARIC信号传导组分中使用的这种共刺激分子的说明性实例包含但不限于TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、TNFR2、TNFRS14、TNFRS18、TNFRS25和ZAP70。在特定实施例中，NKG2D DARIC信号传导组分包括选自由CD28、CD137和CD134组成的组的一个或多个共刺激信号传导结构域。在特定实施例中，NKG2D DARIC信号传导组分包括选自由CD28、CD137和CD134组成的组的一个或多个共刺激信号传导结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。在特定的优选实施例中，NKG2D DARIC信号传导组分包括CD137共刺激结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。

在特定实施例中，本文所设想的NKG2D DARIC信号传导组分包括信号肽(例如，分泌信号肽)，并且不包括跨膜结构域。适于在特定NKG2D DARIC信号传导组分中使用的信号肽的说明性实例包含但不限于IgG1重链信号多肽、Igκ轻链信号多肽、CD8α信号多肽或人GM-CSF受体α信号多肽。在各个优选实施例中，NKG2D DARIC信号传导组分包括CD8α信号多肽。

在某些优选实施例中，NKG2D DARIC信号传导组分包括FRB T2098L多聚化结构域、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。

2.DARIC结合组分

“DARIC结合组分”或“DARIC结合多肽”是指包括NKG2D受体结合结构域或其NKG2D配体结合部分、一个或多个多聚化结构域和跨膜结构域的多肽。在特定实施例中，DARIC结合组分包括NKG2D受体结合结构域或其NKG2D配体结合部分、多聚化结构域和跨膜结构域。在特定实施例中，“DARIC结合组分”或“DARIC结合多肽”是指包括NKG2D受体结合结构域或其NKG2D配体结合部分、一个或多个多聚化结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的多肽。在特定实施例中，DARIC结合组分包括多聚化结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或初级信号传导结构域。

NKG2D受体或其NKG2D配体结合部分是必需或足以结合一种或多种NKG2D配体的NKG2D多肽，所述一种或多种NKG2D配体包含但不限于MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6。在特定的优选实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括必需或足以结合一种或多种NKG2D配体的NKG2D多肽的细胞外部分。在某些优选实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的NKG2D多肽。

适于在本文所设想的特定NKG2D DARIC结合组分中使用的多聚化结构域的说明性实例包含但不限于FK506结合蛋白(FKBP)多肽或其变体或FKBP-雷帕霉素结合(FRB)多肽或其变体。在特定的优选实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括FKBP12多肽或其变体。在某些优选实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括包含T2098L突变的FRB多肽或其变体。

适于在本文所设想的特定NKG2D DARIC结合组分中使用的跨膜结构域的说明性实例包含但不限于T细胞受体的α链、β链、γ链或δ链的一个或多个跨膜区、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD71、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、CD278、AMN、PD1、NKG2A、NKG2B、NKG2C和NKG2D。在特定的优选实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括CD4跨膜结构域。在某些优选实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括CD8α跨膜结构域。在一些优选实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括AMN跨膜结构域。

在各个优选实施例中，优选地在长度在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸之间的短寡肽接头或多肽接头连接跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。基于甘氨酸-丝氨酸的接头提供了特别适合的接头。

在特定实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括一个或多个细胞内信号传导结构域，例如，共刺激结构域。在特定实施例中，NKG2D DARIC包括包含第一共刺激结构域的NKG2DDARIC信号传导组分和包含一个或多个共刺激结构域的NKG2D DARIC结合组分。第一共刺激结构域和一个或多个共刺激结构域可以相同或不同。

在特定实施例中，NKG2D DARIC包括包含第一共刺激结构域的NKG2D DARIC信号传导组分和包含第二共刺激结构域的NKG2D DARIC结合组分。第一共刺激结构域和第二共刺激结构域可以相同或不同。在优选实施例中，第一共刺激结构域不同于第二共刺激结构域。

适于在NKG2D DARIC结合组分的特定实施例中使用的共刺激结构域的说明性实例从选自由以下组成的组的共刺激分子中分离：Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、半胱天冬酶募集结构域家族成员11(CARD11)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD94、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DNAX-活化蛋白10(DAP10)、用于活化T细胞家族成员1的接头(LAT)、含SH2结构域的76kD白细胞蛋白(SLP76)、T细胞受体相关的跨膜衔接子1(TRAT1)、TNFR2、TNF受体超家族成员14(TNFRS14)、TNF受体超家族成员18(TNFRS18)、TNF受体超家族成员25(TNFRS25)和T细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(ZAP70)。

在特定实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括选自由以下组成的组的共刺激分子的一个或多个共刺激结构域：DAP10、TNFR2、OX40、CD27、CD28、CD278、TNFRS14、TNFRS18和TNFRS25。

在特定实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括选自由以下组成的组的共刺激分子的共刺激结构域：TNFR2、OX40、CD27、CD28、CD278、TNFRS14、TNFRS18和TNFRS25。

在优选实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括TNFR2共刺激结构域。

在特定实施例中，本文所设想的NKG2D DARIC结合组分包括信号肽(例如，分泌信号肽)，并且不包括跨膜结构域。适于在特定NKG2D DARIC结合组分中使用的信号肽的说明性实例包含但不限于IgG1重链信号多肽、Igκ轻链信号多肽、CD8α信号多肽或人GM-CSF受体α信号多肽。在各个优选实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括CD8α信号多肽。

在特定的优选实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括NKG2D受体或其NKG2D配体结合部分、FKBP12多聚化结构域和CD4跨膜结构域。

在特定的优选实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括NKG2D受体或其NKG2D配体结合部分、FKBP12多聚化结构域、CD4跨膜结构域和TNFR2共刺激结构域。

在某些优选实施例中，NKG2D DARIC结合组分包括CD8α信号肽、NKG2D受体或其NKG2D配体结合部分和FKBP12多聚化结构域。

在特定实施例中，DARIC包括两个、三个、四个或更多个DARIC结合组分以实现多靶向策略。

在某些实施例中，DARIC包括包含NKG2D受体或其NKG2D配体结合部分、FKBP12多聚化结构域、跨膜结构域以及任选地一个或多个共刺激结构域的NKG2D DARIC结合组分；以及BCMA DARIC结合组分、CD19 DARIC结合组分、B7-H3 DARIC结合组分、CD19 DARIC结合组分、CD20 DARIC结合组分、CD22 DARIC结合组分、CD33 DARIC结合组分、CD79A DARIC结合组分、CD79B DARIC结合组分、EGFR DARIC结合组分和EGFRvIII DARIC结合组分。

在某些实施例中，DARIC包括包含NKG2D受体或其NKG2D配体结合部分、FKBP12多聚化结构域、CD4跨膜结构域以及任选地一个或多个共刺激结构域的NKG2D DARIC结合组分；以及BCMA DARIC结合组分、CD19 DARIC结合组分、B7-H3 DARIC结合组分、CD19 DARIC结合组分、CD20 DARIC结合组分、CD22 DARIC结合组分、CD33DARIC结合组分、CD79A DARIC结合组分、CD79B DARIC结合组分、EGFR DARIC结合组分和EGFRvIII DARIC结合组分。

在某些实施例中，DARIC包括包含NKG2D受体或其NKG2D配体结合部分、FKBP12多聚化结构域、CD4跨膜结构域以及任选地选自由以下组成的组的共刺激分子的一个或多个共刺激结构域的NKG2D DARIC结合组分：DAP10、TNFR2、OX40、CD27、CD28、CD278、TNFRS14、TNFRS18和TNFRS25；以及BCMA DARIC结合组分、CD19 DARIC结合组分、B7-H3 DARIC结合组分、CD19 DARIC结合组分、CD20 DARIC结合组分、CD22 DARIC结合组分、CD33 DARIC结合组分、CD79A DARIC结合组分、CD79B DARIC结合组分、EGFR DARIC结合组分和EGFRvIII DARIC结合组分。

在特定实施例中，DARIC包括包含NKG2D受体或其NKG2D配体结合部分、FKBP12多聚化结构域、CD4跨膜结构域以及任选地选自由以下组成的组的共刺激分子的共刺激结构域的NKG2D DARIC结合组分：TNFR2、OX40、CD27、CD28、TNFRS14、TNFRS18和TNFRS25；以及第二DARIC结合组分，其中第二结合组分是BCMA DARIC结合组分、CD19 DARIC结合组分、B7-H3DARIC结合组分、CD19 DARIC结合组分、CD20DARIC结合组分、CD22 DARIC结合组分、CD33DARIC结合组分、CD79A DARIC结合组分、CD79B DARIC结合组分、EGFR DARIC结合组分和EGFRvIII DARIC结合组分；并且其中第二结合组分包括CD4跨膜结构域以及任选地一个或多个共刺激结构域。

在特定实施例中，DARIC包括包含NKG2D受体或其NKG2D配体结合部分、FKBP12多聚化结构域、CD4跨膜结构域以及任选地选自由以下组成的组的共刺激分子的共刺激结构域的NKG2D DARIC结合组分：TNFR2、OX40、CD27、CD28、TNFRS14、TNFRS18和TNFRS25；以及第二DARIC结合组分，其中第二结合组分是BCMA DARIC结合组分、CD19 DARIC结合组分、B7-H3DARIC结合组分、CD19 DARIC结合组分、CD20DARIC结合组分、CD22 DARIC结合组分、CD33DARIC结合组分、CD79A DARIC结合组分、CD79B DARIC结合组分、EGFR DARIC结合组分和EGFRvIII DARIC结合组分；并且其中第二结合组分包括CD4跨膜结构域以及任选地选自由以下组成的组的共刺激分子的一个或多个共刺激结构域：DAP10、TNFR2、OX40、CD27、CD28、CD278、TNFRS14、TNFRS18和TNFRS25。

在特定实施例中，DARIC包括包含NKG2D受体或其NKG2D配体结合部分、FKBP12多聚化结构域、CD4跨膜结构域以及任选地选自由以下组成的组的共刺激分子的共刺激结构域的NKG2D DARIC结合组分：TNFR2、OX40、CD27、CD28、TNFRS14、TNFRS18和TNFRS25；以及第二DARIC结合组分，其中第二结合组分是BCMA DARIC结合组分、CD19 DARIC结合组分、B7-H3DARIC结合组分、CD19 DARIC结合组分、CD20DARIC结合组分、CD22 DARIC结合组分、CD33DARIC结合组分、CD79A DARIC结合组分、CD79B DARIC结合组分、EGFR DARIC结合组分和EGFRvIII DARIC结合组分；并且其中第二结合组分包括CD4跨膜结构域以及任选地选自由以下组成的组的共刺激分子的共刺激结构域：TNFR2、OX40、CD27、CD28、TNFRS14、TNFRS18和TNFRS25。

3.桥接因子

本文所设想的桥接因子通过组分多聚化结构域介导或促进NKG2D DARIC信号传导组分与NKG2D DARIC结合组分的缔合。桥接因子与多聚化结构域缔合并被安置于所述多聚化结构域之间，以促进NKG2D DARIC信号传导组分与NKG2D DARIC结合组分的缔合。在存在桥接因子的情况下，当DARIC结合多肽结合到靶细胞上的靶抗原时，DARIC结合组分与DARIC信号传导组分缔合并引发针对靶细胞的免疫效应细胞活性。在不存在桥接因子的情况下，DARIC结合组分不与DARIC信号传导组分缔合。

在特定实施例中，NKG2D DARIC信号传导组分和NKG2D DARIC结合组分包括一个或多个FRB和/或FKBP多聚化结构域或其变体。在某些实施例中，NKG2D DARIC信号传导组分包括FRB多聚化结构域或其变体，并且NKG2D DARIC结合组分包括FKBP多聚化结构域或其变体。在特定的优选实施例中，NKG2D DARIC信号传导组分包括FRB T2098L多聚化结构域或其变体，并且NKG2D DARIC结合组分包括FKBP12或FKBP12 F36V多聚化结构域或其变体。

适于在本文所设想的特定实施例中使用的桥接因子的说明性实例包含但不限于AP1903、AP20187、AP21967(也称为C-16-(S)-7-甲基吲哚雷帕霉素)、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。在特定的优选实施例中，桥接因子是AP21967。在某些优选实施例中，桥接因子是西罗莫司(雷帕霉素)。

D.工程化抗原受体

在特定实施例中，细胞被工程化或修饰以表达一种或多种NKG2D DARIC多肽和工程化抗原受体。在特定实施例中，对融合多肽进行编码的核酸或载体包括工程化受体和NKG2D结合组分和/或NKG2D信号传导组分以及一个或多个散布在受体与组分之间的多肽裂解信号。在其它特定实施例中，将对NKG2D DARIC受体进行编码的多核苷酸或载体引入到包括工程化抗原受体的免疫效应细胞中。在不希望受到任何特定理论束缚的情况下，在特定实施例中设想的是，本领域中已知的任何机制均可以用于在同一免疫效应细胞或细胞群中引入和共表达工程化抗原受体和NKG2D DARIC受体，从而增加免疫效应细胞应答的效率、效力和耐久性。

在特定实施例中，本文所设想的免疫效应细胞包括工程化抗原受体和NKG2DDARIC受体的一种或多种组分。在特定实施例中，工程化抗原受体是工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)或zetakine。

1.工程化TCR

在特定实施例中，本文所设想的免疫效应细胞包括工程化TCR和NKG2D DARIC受体的一种或多种组分。在一个实施例中，通过引入对通过一个或多个多肽裂解信号分开的工程化TCR和NKG2D DARIC受体的一种或多种组分进行编码的多核苷酸或载体来工程化T细胞。在一个实施例中，通过引入对工程化TCR进行编码的多核苷酸或载体和对NKG2D DARIC受体的一种或多种组分进行编码的多核苷酸或载体来工程化T细胞。在一个实施例中，通过引入对NKG2D DARIC受体的一种或多种组分进行编码的多核苷酸或载体来进一步工程化被工程化以表达工程化TCR的T细胞。

天然存在的T细胞受体包括两个亚单元，α链和β链亚单元(αβTCR)或γ链和δ链亚单元(γδTCR)，这两个亚单元中的每一个均为通过每个T细胞的基因组中的重组事件产生的独特蛋白。可以筛选TCR文库对特定靶抗原的选择性。以此方式，可以选择、克隆并且随后将对靶抗原有高亲合力和反应性的天然TCR引入到用于过继性免疫疗法的T细胞群中。在一个实施例中，TCR是αβTCR。在一个实施例中，TCR是γδTCR。

在一个实施例中，通过引入具有形成TCR的能力的TCR亚单元来修饰T细胞，所述TCR赋予T细胞对表达靶抗原的肿瘤细胞的特异性。在特定实施例中，与天然存在的亚单元相比，所述亚单元具有一个或多个氨基酸取代、缺失、***或修饰，只要所述亚单元保留形成TCR的能力并赋予转染的T细胞归巢到靶细胞的能力，并且参与免疫相关的细胞因子信号传导。优选地，工程化TCR还以高亲合力结合显示相关肿瘤相关肽的靶细胞，并且任选地介导在体内呈递相关肽的靶细胞的有效杀伤。

对工程化TCR进行编码的核酸优选地从其在T细胞的(天然存在的)染色体中的自然背景中分离，并且可以被并入如本文中其它地方所描述的适合的载体中。核酸和包括其的载体两者可以转移到细胞中，优选地，在特定实施例中，转移到T细胞中。然后，经过修饰的T细胞能够表达由一个或多个经过转导的核酸编码的TCR的一条或多条链。在优选实施例中，工程化TCR是外源TCR，因为其被引入到通常不表达特定TCR的T细胞中。工程化TCR的基本方面是其对主要组织相容性复合物(MHC)或类似免疫组分呈递的肿瘤抗原具有高亲合力。与工程化TCR相比，CAR被工程化以便以MHC非依赖性方式结合靶抗原。

TCR可以和与TCR的α链或β链或TCR的γ链或δ链的氨基端部分或羧基端部分连接的另外的多肽一起表达，只要连接的另外的多肽不干扰α链或β链形成功能性T细胞受体以及MHC依赖性抗原识别的能力即可。

通过特定实施例中设想的工程化TCR识别的抗原包含但不限于癌抗原，包含血液癌和实体瘤两者上的抗原。说明性抗原包含但不限于α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整联蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包含ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1，SSX、存活蛋白、TAG72、TEM、VEGFR2以及WT-1。

在优选实施例中，靶抗原和一种或多种NKG2D配体在癌症的一个或多个细胞上共表达。

2.嵌合抗原受体

在各个实施例中，免疫效应细胞表达将细胞毒性朝肿瘤细胞重新定向的嵌合抗原受体(CAR)。CAR是将针对靶抗原(例如，肿瘤抗原)的基于抗体的特异性与T细胞受体活化细胞内结构域组合以生成展现出特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。如本文所使用的，术语“嵌合”描述了由来自不同来源的不同蛋白质或DNA的各个部分构成。

在特定实施例中，本文所设想的免疫效应细胞包括CAR和一种或多种NKG2D DARIC受体组分。在一个实施例中，通过引入对通过一个或多个多肽裂解信号分开的CAR和一种或多种NKG2D DARIC受体组分进行编码的多核苷酸或载体来工程化T细胞。在一个实施例中，通过引入对CAR进行编码的多核苷酸或载体和对一种或多种NKG2D DARIC受体组分进行编码的多核苷酸或载体来工程化T细胞。在一个实施例中，通过引入对一种或多种NKG2DDARIC受体组分进行编码的多核苷酸或载体来进一步工程化被工程化以表达CAR的T细胞。

在各个实施例中，CAR包括与特异性靶抗原结合的细胞外结构域(也被称为结合结构域或抗原特异性结合结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。CAR的主要特性是其能够利用单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共同受体的细胞特异性靶向能力来重新定向免疫效应子细胞特异性，从而触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用或可以以主要组织相容性(MHC)非依赖方式介导靶抗原表达细胞的细胞死亡的分子的产生。

在特定实施例中，CAR包括与靶多肽特异性地结合的细胞外结合结构域。结合结构域包含所关注的生物分子的任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的结合配偶体。

在特定实施例中，细胞外结合结构域包括抗体或其抗原结合片段。

在一个优选实施例中，结合结构域是scFv。

在另一个优选实施例中，结合结构域是骆驼科动物抗体。

在特定实施例中，CAR包括结合选自由以下组成的组的抗原的细胞外结构域：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整联蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包含ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、存活蛋白、TAG72、TEM、VEGFR2以及WT-1。

在特定实施例中，CAR包括细胞外结合结构域，例如，抗体或结合抗原的其抗原结合片段，其中抗原是MHC-肽复合物，如I类MHC-肽复合物或II类MHC-肽复合物。

在优选实施例中，靶抗原和一种或多种NKG2D配体在癌症的一个或多个细胞上共表达。

在一个实施例中，间隔子结构域包括IgG1、IgG4或IgD的CH2和CH3。

适于在本文所描述的CAR中使用的说明性铰链结构域包含源自如CD8α和CD4等1型膜蛋白的细胞外区的铰链区，所述铰链区可以是来自这些分子的野生型铰链区或可以被更改。在另一个实施例中，铰链结构域包括CD8α铰链区。

在一个实施例中，铰链是PD-1铰链或CD152铰链。

CAR的“跨膜(TM)结构域”融合细胞外结合部分和细胞内信号传导结构域并且将CAR锚定到免疫效应细胞的质膜上。TM结构域可以源自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。

说明性TM结构域可以源自(即至少包括以下的一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α链、β链、γ链或δ链、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、CD278、AMN以及PD-1。

在一个实施例中，CAR包括源自CD8α的TM结构域。在另一个实施例中，本文所设想的CAR包括源自CD8α的TM结构域和优选地长度在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸之间的连接TM结构域和CAR的细胞内信号传导结构域的短寡肽接头或多肽接头。甘氨酸-丝氨酸接头提供了特别适合的接头。

在优选实施例中，CAR包括细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包括一个或多个“共刺激信号传导结构域”和“初级信号传导结构域”。

以刺激方式起作用的初级信号传导结构域可以含有信号传导基序，所述信号传导基序被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。

适于在特定实施例中设想的CAR中使用的含ITAM初级信号传导结构域的说明性实例包含源自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在特定的优选实施例中，CAR包括CD3ζ初级信号传导结构域以及一个或多个共刺激信号传导结构域。细胞内初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以按任何顺序与跨膜结构域的羧基末端串联连接。

在特定实施例中，CAR包括用于增强表达CAR受体的T细胞的疗效和扩增的一个或多个共刺激信号传导结构域。

适于在特定实施例中设想的CAR中使用的这种共刺激分子的说明性实例包含：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM以及ZAP70。在一个实施例中，CAR包括选自由CD28、CD137和CD134组成的组的一个或多个共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。

在各个实施例中，CAR包括：结合选自由以下组成的组的抗原的细胞外结构域：BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1和TAG72；从选自由以下组成的组的多肽中分离的跨膜结构域：CD4、CD8α、CD154和PD-1；从选自由以下组成的组的多肽中分离的一个或多个细胞内共刺激信号结构域：CD28、CD134和CD137；以及从选自由以下组成的组的多肽中分离的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

在各个实施例中，CAR包括：结合选自由以下组成的组的抗原的细胞外结构域：BCMA、B7-H3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD79A、CD79B、EGFR和EGFRvIII，从选自由以下组成的组的多肽中分离的跨膜结构域：CD4、CD8α、CD154和PD-1；从选自由以下组成的组的多肽中分离的一个或多个细胞内共刺激信号结构域：CD28、CD134和CD137；以及从选自由以下组成的组的多肽中分离的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

3.ZETAKINE

在各个实施例中，免疫效应细胞包括将细胞毒性重新定向到肿瘤细胞的嵌合细胞因子受体。zetakine是包括以下的嵌合跨膜免疫受体：细胞外结构域，其包括与能够将细胞外结构域栓系到细胞表面的支持区连接的可溶性受体配体；跨膜区；以及细胞内信号传导结构域。当在T淋巴细胞的表面上表达时，zetakine将T细胞活性引导到表达可溶性受体配体针对其具有特异性的受体的那些细胞。zetakine嵌合免疫受体对T细胞的抗原特异性进行重新定向，尤其是经由人类恶性肿瘤所利用的自分泌/旁分泌细胞因子系统应用于治疗各种癌症。

在特定实施例中，本文所设想的免疫效应细胞包括zetakine受体的一条或多条链和一种或多种NKG2D DARIC受体组分。在一个实施例中，通过引入对通过一个或多个多肽裂解信号分开的zetakine受体的一条或多条链和一种或多种NKG2D DARIC受体组分进行编码的多核苷酸或载体来工程化T细胞。在一个实施例中，通过引入对zetakine受体的一条或多条链进行编码的多核苷酸或载体和对一种或多种NKG2D DARIC受体组分进行编码的多核苷酸或载体来工程化T细胞。在一个实施例中，通过引入对一种或多种NKG2D DARIC受体组分进行编码的多核苷酸或载体来进一步工程化被工程化以表达zetakine受体的一条或多条链的T细胞。

在特定实施例中，zetakine包括免疫抑制细胞因子或其细胞因子受体结合变体、接头、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。

在特定实施例中，细胞因子或其细胞因子受体结合变体选自由以下组成的组：白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)和白细胞介素-13(IL-13)。

在某些实施例中，接头包括CH2CH3结构域、铰链结构域等。在一个实施例中，接头包括IgG1、IgG4或IgD的CH2结构域和CH3结构域。在一个实施例中，接头包括CD8α或CD4铰链结构域。

在特定实施例中，跨膜结构域选自由以下组成的组：T细胞受体的α链、β链、γ链或δ链、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、CD278、AMN和PD-1。

在特定实施例中，细胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：含ITAM初级信号传导结构域和/或共刺激结构域。

在特定实施例中，细胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

在特定实施例中，细胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM和ZAP70。

在一个实施例中，嵌合细胞因子受体包括选自由CD28、CD137和CD134组成的组的一个或多个共刺激信号传导结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。

E.多肽

本文中设想了各种多肽，包含但不限于NKG2D DARIC结合组分、NKG2D DARIC信号传导组分、工程化TCR、CAR、zetakine、包括前述多肽及其片段的融合蛋白。在优选实施例中，多肽包括SEQ ID NO:1-9中任一个所述的氨基酸序列。除非相反地规定，否则“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且根据常规含义即作为氨基酸序列使用。在一个实施例中，“多肽”包含融合多肽和其它变体。可以使用各种熟知的重组和/或合成技术中的任何技术来制备多肽。多肽不限于具体长度，例如，多肽可以包括全长蛋白序列、全长蛋白质的片段或融合蛋白，并且可以包含多肽的转译后修饰例如糖基化、乙酰化、磷酸化等以及本领域已知的天然存在的和非天然存在的其它修饰。在特定的优选实施例中，从一种或多种人多肽制备、获得或分离融合多肽、多肽、其片段和其它变体。

如本文所使用的，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从细胞环境中以及从与细胞的其它组分的缔合中体外分离和/或纯化的肽或多肽分子，即所述肽或多肽分子未与体内物质显著缔合。在特定实施例中，分离的多肽是合成多肽、半合成多肽或获自或源自重组来源的多肽。

多肽包含“多肽变体”。多肽变体与天然存在的多肽的不同之处可以在于一个或多个取代、缺失、添加和/或***。这种变体可以是天然存在的或可以通过合成生成，例如通过修饰上述多肽序列中的一个或多个。例如，在特定实施例中，可以期望通过将一个或多个取代、缺失、添加和/或***引入到多肽中来改进多肽的结合亲和力和/或其它生物性质。在特定实施例中，多肽包含与本文所设想的参考序列中的任何一个有至少约65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、86％、97％、98％或99％氨基酸一致性的多肽，通常其中变体维持参考序列的至少一种生物活性。在特定实施例中，生物活性是结合亲和力。在特定实施例中，生物活性是酶活性。

在某些实施例中，NKG2D DARIC受体包括多肽复合物，所述多肽复合物包括：(i)具有第一多聚化结构域的第一多肽，例如，第一融合多肽；以及(ii)具有第二多聚化结构域的第二多肽，例如，第一融合多肽。在特定实施例中，多聚化结构域是相同的；在某些实施例中，第一多聚化结构域不同于第二多聚化结构域。第一多聚化结构域和第二多聚化结构域在桥接因子存在的情况下基本上有助于或高效地促进多肽复合物的形成。在不存在第一多聚化结构域、第二多聚化结构域或桥接因子的情况下，如果第一融合多肽与第二融合多肽之间的缔合在统计上显著降低，则第一多聚化结构域与第二多聚化结构域之间的一种或多种相互作用基本上有助于或高效地促进第一融合多肽和第二融合多肽的多聚化。在某些实施例中，在存在桥接因子的情况下，当第一融合多肽和第二融合多肽共表达时，至少约60％，例如，至少约60％到约70％、至少约70％到约80％、至少约80％到约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％以及至少约90％到约92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的第一单链多肽和第二单链多肽彼此形成多聚体。

多肽变体包含生物活性“多肽片段”。生物活性多肽片段的说明性实例包含结合结构域、信号传导、NKG2D配体结合结构域等。如本文所使用的，术语“生物活性片段”或“最小生物活性片段”是指保留天然存在的多肽活性的至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％的多肽片段。在某些实施例中，多肽片段可以包括长度为至少5个到约1700个氨基酸的氨基酸链。应当理解的是，在某些实施例中，片段长度为至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个、1600个、1700个或更多个氨基酸。

在特定实施例中，本文所述的多肽可以包括表示为“X”的一个或多个氨基酸。“X”如果存在于氨基酸SEQ ID NO中则是指任何一个或多个氨基酸。在特定实施例中，表示融合蛋白的SEQ ID NO包括累积地代表任何氨基酸序列的连续X残基的序列。

如上文中指出的，可以以各种方式来改变多肽，包含氨基酸取代、缺失、截短和***。用于此类操纵的方法在本领域中是熟知的。例如，可以通过DNA的突变来制备参考多肽的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域中是熟知的。参见例如Kunkel(1985,《美国国家科学院院刊》82:488-492)；Kunkel等人,(1987,《酶学方法(Methods in Enzymol)》,154:367-382)；美国专利第4,873,192号；Watson,J.D.等人,(《基因的分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》,第四版,本杰明/卡明斯出版公司(Benjamin/Cummings),加利福尼亚州门洛帕克市,1987)以及其中引用的参考文献。关于不影响所关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人,(1978)《蛋白序列和结构图谱学(Atlas of Protein Sequence and Structure)》(美国国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.),华盛顿特区)的模型中找到。

在某些实施例中，多肽变体包括一个或多个保守取代。“保守取代”是其中氨基酸被具有类似性质的另一个氨基酸取代从而使得肽化学领域的技术人员预期多肽的二级结构和亲水性基本上未改变的取代。修饰可以针对特定实施例中设想的多核苷酸和多肽的结构进行并且仍然获得了对具有期望特性的变体或衍生多肽进行编码的功能分子。当期望更改多肽的氨基酸序列以产生等效的或甚至改进的变体多肽时，本领域技术人员例如可以例如根据表1改变编码DNA序列的密码子中的一个或多个。

表1—氨基酸密码子

可以使用本领域中公知的计算机程序如DNASTAR、DNA Strider、Geneious、MacVector或Vector NTI软件找到关于确定哪些氨基酸残基可以被取代、***或缺失而不消除生物活性的指南。优选地，本文所公开的蛋白质变体的氨基酸改变是保守氨基酸改变，即带类似电荷或不带电荷的氨基酸的取代。保守氨基酸改变涉及在侧链方面相关的氨基酸的家族中的一个氨基酸的取代。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和极性不带电氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。在肽或蛋白质中，适当的氨基酸保守取代对于本领域的技术人员来说是已知的，并且通常可以在不改变所得分子的生物活性的情况下进行。本领域技术人员认识到，一般而言，在多肽的非必要区中的单氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见例如Watson等人,《基因分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》,第4版,1987,本杰明/卡明斯出版公司,第224页)。

在一个实施例中，在期望表达两个或更多个多肽的情况下，如本文中其它地方所公开的，对所述两个或多个多肽进行编码的多核苷酸序列可以通过IRES序列分开。

特定实施例中设想的多肽包含融合多肽。在特定实施例中，提供了融合多肽和编码融合多肽的多核苷酸。融合多肽和融合蛋白是指具有至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多肽片段的多肽。在优选实施例中，融合多肽包括一种或多种NKG2DDARIC组分。在特定实施例中，融合多肽包括一种或多种NKG2D DARIC受体。

在特定实施例中，融合多肽包括NKG2D DARIC信号传导组分、NKG2D结合组分和针对另一靶抗原的另一DARIC结合组分。

融合多肽可以包括：一个或多个多肽结构域或片段，包含但不限于信号肽、细胞渗透性肽结构域(CPP)、DNA结合结构域、信号传导结构域等；表位标签(例如，麦芽糖结合蛋白(“MBP”)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、HIS6、MYC、FLAG、V5、VSV-G和HA)；多肽接头；以及多肽裂解信号。融合多肽通常是C末端连接到N末端，但其也可以是C末端连接到C末端、N末端连接到N末端或N末端连接到C末端。在特定实施例中，融合蛋白的多肽可以采取任何顺序。融合多肽或融合蛋白还可以包含保守修饰的变体、多态变体、等位基因、突变体、子序列和种间同系物，只要保持融合多肽的期望活性即可。融合多肽可以通过化学合成法或通过两个部分之间的化学连接产生或者通常可以使用其它标准技术制备。包括融合多肽的连接的DNA序列可操作地连接到如本文其它地方所公开的适合的转录或转译控制元素。

融合多肽可以任选地包括可以用于连接多肽内的一个或多个多肽或结构域的一个或多个接头。肽接头序列可以用于将任何两个或更多个多肽组分分开足够的距离，以确保每个多肽折叠成其适当的二级结构和三级结构，以便使多肽结构域发挥其期望功能。这种肽接头序列使用本领域中的标准技术并入到融合多肽中。适合的肽接头序列可以基于以下因素进行选择：(1)其能够采用灵活的扩展构象；(2)其不能采用可以与第一多肽和第二多肽上的功能性表位相互作用的次级结构；以及(3)缺乏可以与多肽功能性表位反应的疏水残基或带电残基。在特定实施例中，优选的肽接头序列含有Gly、Asn和Ser残基。还可以在接头序列中使用其它近中性氨基酸，如Thr和Ala。可以有效地用作接头的氨基酸序列包含以下文献中公开的那些：Maratea等人,《基因(Gene)》40:39-46,1985；Murphy等人,《美国国家科学院院刊》83:8258-8262,1986；美国专利第4,935,233号；以及美国专利第4,751,180号。当特定融合多肽片段包含可以用于将功能结构域分开并防止空间干扰的非必需N末端氨基酸区时，不需要接头序列。在特定实施例中，优选的接头通常是被合成为重组融合蛋白的一部分的柔性氨基酸子序列。接头多肽可以为长度在1个与200个氨基酸之间、长度在1个与100个氨基酸之间或者长度在1个与50个氨基酸之间，包含其间的所有整数值。

示例性多肽裂解信号包含多肽裂解识别位点，如蛋白酶裂解位点、核酸酶裂解位点(例如，稀有限制酶识别位点、自裂解核酶识别位点)和自裂解病毒寡肽(参见deFelipe和Ryan,2004.《转运(Traffic)》,5(8),616-26)。

在另一个实施例中，可以将两个或更多个多肽表达为包括如本文中其它地方所公开的一个或多个自裂解多肽序列的融合蛋白。

合适的蛋白酶裂解位点和自裂解肽对于本领域的技术人员来说是已知的(参见例如，Ryan等人,1997.《普通病毒学期刊(J.Gener.Virol.)》78,699-722；Scymczak等人,(2004)《自然生物科技(Nature Biotech.)》5,589-594)。示例性蛋白酶裂解位点包含但不限于以下的裂解位点：马铃薯Y病毒NIa蛋白酶(例如，烟草蚀斑病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯Y病毒P1(P35)蛋白酶、byo病毒NIa蛋白酶、byo病毒RNA-2编码蛋白酶、***病毒L蛋白酶、肠病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、小rna 3C蛋白酶、豇豆花叶病毒24K蛋白酶、线虫传多面体病毒24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球状病毒)3C样蛋白酶、PYVF(欧防风黄点病毒)3C样蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa和肠激酶。在一个实施例中，由于TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶裂解位点的裂解严格度高，所以优选TEV蛋白酶裂解位点，例如EXXYXQ(G/S)(SEQ ID NO:23)，例如ENLYFQG(SEQ ID NO:24)和ENLYFQS(SEQ ID NO:25)，其中X表示任何氨基酸(由TEV进行的裂解发生在Q与G或Q与S之间)。

在特定实施例中，多肽裂解信号是病毒自裂解肽或核糖体跳跃序列。

核糖体跳跃序列的说明性实例包含但不限于：2A或2A样位点、序列或结构域(Donnelly等人,2001.《普通病毒学期刊》82:1027-1041)。在特定实施例中，病毒2A肽是口疮病毒2A肽、马铃薯Y病毒2A肽或心脏病毒2A肽。

在一个实施例中，病毒2A肽选自由以下组成的组：***病毒(FMDV)(F2A)肽、马A型鼻炎病毒(ERAV)(E2A)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(TaV)(T2A)肽、猪捷申病毒-1(PTV-1)(P2A)肽、泰勒病毒2A肽以及脑心肌炎病毒2A肽。

表2中提供了2A位点的说明性实例。

表2：

在优选实施例中，多肽或融合多肽包括一种或多种NKG2D DARIC组分或NKG2DDARIC受体。

在特定实施例中，融合多肽包括NKG2D DARIC信号传导组分和NKG2D DARIC结合组分，所述NKG2D DARIC信号传导组分包括FRB T2098L多聚化结构域、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域和CD3ζ初级信号传导结构域；病毒自裂解2A多肽；所述NKG2D DARIC结合组分包括NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段、FKBP12多聚化结构域多肽和CD4跨膜结构域。

在特定实施例中，融合多肽包括NKG2D DARIC信号传导组分和NKG2D DARIC结合组分，所述NKG2D DARIC信号传导组分包括FRB T2098L多聚化结构域、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域和CD3ζ初级信号传导结构域；病毒自裂解2A多肽；所述NKG2D DARIC结合组分包括NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段、FKBP12多聚化结构域多肽、CD4跨膜结构域以及任选地CD27、CD28、TNFRS14、TNFRS18、TNFRS25、OX40或TNFR2共刺激结构域。

在特定实施例中，融合多肽包括NKG2D DARIC信号传导组分和NKG2D DARIC结合组分，所述NKG2D DARIC信号传导组分包括FRB T2098L多聚化结构域、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域和CD3ζ初级信号传导结构域；所述NKG2D DARIC结合组分包括NKG2D受体或其NKG2D配体结合片段、FKBP12多聚化结构域多肽、CD4跨膜结构域以及任选地CD27、CD28、TNFRS14、TNFRS18、TNFRS25、OX40或TNFR2共刺激结构域；所述DARIC结合组分包括结合B7-H3、BCMA、CD19、CD20、CD22、CD33、CD79A、CD79B、EGFR或EGFRvIII的结合结构域、CD4跨膜结构域以及任选的CD27、CD28、TNFRS14、TNFRS18、TNFRS25、OX40或TNFR2共刺激结构域；其中DARIC组分通过病毒自裂解2A多肽彼此分开。

F.多核苷酸

在特定实施中，提供了对一种或多种NKG2D DARIC组分进行编码的多核苷酸、工程化TCR、CAR、zetakine、包括上述多肽和其片段的融合蛋白。如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和DNA/RNA杂交体。多核苷酸可以是单链或双链以及重组、合成或分离的。多核苷酸包含但不限于：前信使RNA(前mRNA)、信使RNA(mRNA)、RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、tracrRNA、crRNA、单导RNA(sgRNA)、合成RNA、合成mRNA、基因组DNA(gDNA)、PCR扩增DNA、互补DNA(cDNA)、合成DNA或重组DNA。多核苷酸是指长度为至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少5000个、至少10000个或至少15000个或更多个核苷酸以及所有中间长度的核苷酸的聚合形式，或者是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者是任一类型核苷酸的修饰形式。容易理解的是，在此上下文中，“中间长度”意指所引用值之间的任何长度，如6、7、8、9等，101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。在特定实施例中，多核苷酸或变体与参考序列具有至少或约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

在特定实施例中，多核苷酸可以是密码子优化的。如本文所使用的，术语“密码子优化的”是指取代编码多肽的多核苷酸中的密码子以增加多肽的表达、稳定性和/或活性。影响密码子优化的因素包含但不限于以下中的一种或多种：(i)两个或更多个生物体或基因之间的密码子偏倚或者合成地构成的偏倚表格的变化；(ii)生物体、基因或基因组内的密码子偏倚度的变化；(iii)包含背景在内的密码子的系统变化；(iv)密码子根据其解码tRNA的变化；(v)密码子根据GC％在总体上或在三联体中的一个位置处的变化；(vi)与参考序列例如天然存在的序列的相似度的变化；(vii)密码子频率截止的变化；(viii)从DNA序列转录的mRNA的结构性质；(ix)关于设计密码子取代组所基于的DNA序列的功能的先验知识；(x)每个氨基酸的密码子组的系统变化；和/或(xi)假性转译起始位点的经过分离的移除。

如本文所使用的，术语“核苷酸”是指与磷酸化糖呈N-糖苷连接的杂环含氮碱基。核苷酸被理解成包含天然碱基和各种经过本领域认可的经过修饰的碱基。这种碱基通常位于核苷酸糖部分的1'位置处。核苷酸通常包括碱基、糖和磷酸基。在核糖核酸(RNA)中，糖为核糖，并且在脱氧核糖核酸(DNA)中，糖为脱氧核糖，即缺少存在于核糖中的羟基的糖。示例性天然含氮碱基包含嘌呤、腺苷(A)和胍(G)以及嘧啶、胞苷(C)和胸苷(T)(或在RNA的背景下，尿嘧啶(U))。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核苷酸通常是单磷酸、二磷酸或三磷酸。核苷酸可以是未经过修饰的或者在糖、磷酸和/或碱基部分进行修饰(也可互换地被称为核苷酸类似物、核苷酸衍生物、经过修饰的核苷酸、非天然核苷酸和非标准核苷酸；参见例如，WO 92/07065和WO 93/15187)。由Limbach等人(1994,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》22,2183-2196)总结了经过修饰的核酸碱基的实例。

核苷酸也可以被认为是核苷的磷酸酯，其中酯化发生在与糖的C-5附接的羟基上。如本文所使用的，术语“核苷”是指与糖呈N-糖苷连接的杂环含氮碱基。核苷在本领域中被认为包含天然碱基并且还包含公知的经过修饰的碱基。这种碱基通常位于核苷糖部分的1'位置处。核苷通常包括碱基和糖基。核苷可以是未经过修饰的或者在糖和/或碱基部分进行修饰(也可互换地被称为核苷类似物、核苷衍生物、经过修饰的核苷、非天然核苷或非标准核苷)。也如上文所述，由Limbach等人(1994,《核酸研究》22,2183-2196)总结了经过修饰的核酸碱基的实例。

多核苷酸的说明性实例包含但不限于SEQ ID NO:1-9中所示的对多肽进行编码的多核苷酸。

在各个说明性实施例中，本文所设想的多核苷酸包含但不限于对一种或多种NKG2D DARIC组分进行编码的多核苷酸、NKG2D DARIC受体、工程化抗原受体、融合多肽和表达载体、病毒载体以及包括本文所设想的多核苷酸的转移质粒。

如本文所使用的，术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指显示出与参考多核苷酸序列或在下文中定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸具有实质性序列同一性的多核苷酸。这些术语还涵盖通过添加、缺失、取代或修饰至少一个核苷酸而区别于参考多核苷酸的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包含其中已添加或缺失、或修饰或用不同核苷酸替换一个或多个核苷酸的多核苷酸。在此方面，本领域中充分理解的是，可以对参考多核苷酸作出包括突变、添加、缺失以及取代在内的某些改变，由此所改变的多核苷酸保留所述参考多核苷酸的生物功能或活性。

在一个实施例中，多核苷酸包括在严格条件下与靶核酸序列杂交的核苷酸序列。在“严格条件”下杂交描述了这样的杂交方案：彼此至少60％相同的核苷酸序列维持杂交。通常，严格条件在限定的离子强度和pH下被选择为比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)，在所述温度下，与靶序列互补的探针中的50％在平衡时与靶序列杂交。由于靶序列通常过量存在，所以在Tm下，探针中的50％在平衡时被占据。

如本文所使用的，陈述“序列同一性”或例如包括“与……50％相同的序列”是指序列在一个比较窗口内在逐核苷酸的基础上或在逐氨基酸的基础上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过以下来计算：在比较窗口内比较两个经过最佳比对的序列，确定相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)出现在这两个序列中的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数(即，窗口大小)，以及将结果乘以100以产生序列同一性百分比。包含与本文所描述的参考序列中的任何一个具有至少约50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、86％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体维持参考多肽的至少一种生物活性。

用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包含“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“实质性同一性”。“参考序列”的长度为至少12个、但通常为15个到18个并且经常为至少25个单体单元，包含核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可以各自包括(1)在这两个多核苷酸之间类似的序列(即，完整多核苷酸序列的仅一部分)和(2)在这两个多核苷酸之间存在差异的序列，两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过以下执行：在“比较窗口”内比较这两个多核苷酸的序列以识别和比较具有序列相似性的局部区。“比较窗口”是指具有至少6个连续位置的概念性区段，通常为约50个到约100个，更通常为约100个到约150个，其中序列与具有相同数目的连续位置的参考序列在这两个序列进行最佳比对后进行比较。比较窗口可以包括与参考序列(所述参考序列不包括添加或缺失)相比约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)以用于这两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实施方案(美国威斯康星州麦迪逊科学大道575号遗传学电脑集团(Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)的威斯康星遗传学软件包7.0版本(WisconsinGenetics Software Package Release7.0)的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者通过检查和由所选择的各种方法中的任何一种生成的最佳比对(即，导致比较窗口内的最高百分比同源性)来进行。还可以参考如例如通过Altschul等人,1997,《核酸研究》25:3389中公开的BLAST程序家族。序列分析的详细讨论可以见于Ausubel等人,《当代分子生物学实验手册》,约翰威立父子公司(John Wiley&Sons,Inc.),1994-1998,第15章,第19.3单元。

如本文所使用的，“分离的多核苷酸”是指已经从其两侧的处于天然存在状态的序列纯化的多核苷酸，例如，已经从通常与其相邻的序列移除的DNA片段。“分离的多核苷酸”还指互补DNA(cDNA)、重组DNA或自然中不存在且已经通过人手制造的其它多核苷酸。在具体实施例中，分离的多核苷酸是合成多核苷酸、半合成多核苷酸或获自或源自重组来源的多核苷酸。

在各个实施例中，多核苷酸包括编码本文所设想的多肽的mRNA。在某些实施例中，mRNA包括帽、一个或多个核苷酸和poly(A)尾。

描述多核苷酸的朝向的术语包含：5'(通常是具有游离磷酸基的多核苷酸的端)和3'(通常是具有游离羟基(OH)的多核苷酸的端)。多核苷酸序列可以注释以5'-3'朝向或3'-5'朝向。对于DNA和mRNA，5'-3'链被指定为“有义”链、“正”链或“编码”链，因为其序列与前信使(前mRNA)的序列是一致的[RNA中的尿嘧啶(U)而非DNA中的胸腺嘧啶(T)除外]。对于DNA和mRNA，作为通过RNA聚合酶转录的链的3'-5'互补链被命名为“模板”、“反义”、“负”或“非编码”链。如本文所使用的，术语“相反朝向”是指以3'-5'朝向书写的5'-3'序列或以5'-3'朝向书写的3'-5'序列。

术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，DNA序列5'A G T C A T G 3'的互补链是3'T C A G T A C 5'。后一个序列常常写成左边为5'端且右边为3'端的相反补体5'C A T G A C T 3'。与其相反补体相等的序列被称为回文序列。互补性可以是“部分的”，其中核酸的碱基中仅一些碱基根据碱基配对规则是匹配的。或者，在核酸之间可以存在“完全”或“全部”的互补性。

此外，本领域的普通技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，存在许多对多肽或其变体片段进行编码的核苷酸序列，如本文所描述的。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。尽管如此，在特定实施例中具体地设想了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸，例如针对人和/或灵长类动物密码子选择而优化的多核苷酸。在特定实施例中，多核苷酸是针对表达和/或稳定性而优化的密码子。此外，还可以使用包括本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因是由于如核苷酸的缺失、添加和/或取代等一个或多个突变而改变的内源基因。

如本文所使用的，术语“核酸盒”或“表达盒”是指载体内可以表达RNA和随后表达多肽的基因序列。在一个实施例中，核酸盒含有一个或多个所关注的基因，例如一个或多个所关注的多核苷酸。在另一个实施例中，核酸盒含有一个或多个表达控制序列，例如，启动子、增强子、poly(A)序列和一个或多个所关注基因，例如，一个或多个所关注多核苷酸。载体可以包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个核酸盒。核酸盒在载体内定位且顺序地朝向，使得可以将盒中的核酸转录成RNA并在必要时转译成蛋白质或多肽、经历在转化细胞中具有活性所需的适当的转译后修饰并且通过将适合的细胞内隔区靶向细胞外隔区或分泌到细胞外隔区而易位到适合的隔区以具有生物活性。优选地，盒使其3'端和5'端适于准备***到载体中，例如，其在每一端均具有限制性核酸内切酶位点。盒可以作为单个单元移除和***到质粒或病毒载体中。

多核苷酸包含一个或多个所关注的多核苷酸。如本文所使用的，术语“所关注多核苷酸”是指对多肽或融合多肽进行编码的多核苷酸或充当用于转录抑制性多核苷酸的模板的多核苷酸，如本文所设想的。

如本文其它地方所公开的或如本领域已知的，无论编码序列本身的长度如何，本文所设想的多核苷酸可以与其它DNA序列组合，如启动子和/或增强子、非转译区(UTR)、信号序列、Kozak序列、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如，LoxP位点、FRT位点和Att位点)、终止密码子、转录终止信号以及对自裂解多肽、表位标记进行编码的多核苷酸，使得所述多核苷酸的总长度可以显著变化。因此，设想可以采用几乎任何长度的多核苷酸片段，其总长度优选地受制备的容易性和在预期的重组DNA方案中的使用的限制。

可以使用本领域中已知和可用的各种已经确立的技术来制备、操纵、表达和/或递送多核苷酸。为了表达所期望的多肽，可以将对多肽进行编码的核苷酸序列***到适当的载体中。

载体的说明性实例包含但不限于：质粒、自主复制序列和转座元件，例如，睡美人(Sleeping Beauty)、PiggyBac。

载体的另外的说明性实例包含但不限于：质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1源性人工染色体(PAC)、如λ噬菌体或M13噬菌体等噬菌体以及动物病毒。

可以用作载体的病毒的说明性实例包含但不限于：逆转录病毒(包含慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒以及乳多空病毒(例如，SV40)。

表达载体的说明性实例包含但不限于：用于在哺乳动物细胞中表达的pClneo载体(普洛麦格公司(Promega))；用于在哺乳动物细胞中进行慢病毒介导的基因转移和表达的pLenti4/V5-DEST^TM、pLenti6/V5-DEST^TM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(英杰公司(Invitrogen))。在特定实施例中，本文所公开的多肽的编码序列可以连接到用于在哺乳动物细胞中表达多肽的此类表达载体中。

在特定实施例中，载体是附加型载体或在染色体外维持的载体。如本文所使用的，术语“附加型”是指能够复制而不整合到宿主的染色体DNA中且不会从***的宿主细胞中逐渐丧失的载体，这还意味着所述载体在染色体外或附加地复制。

表达载体中存在的“表达控制序列”、“控制元件”或“调节序列”是载体的那些非转译区，包含但不限于复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)内含子、多腺苷酸化序列、5'和3'非转译区，其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和转译。此类元件的强度和特异性可能有所不同。根据所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的适合的转录和转译元件，包含普遍存在的启动子和诱导型启动子。

在特定实施例中，多核苷酸包括载体，所述载体包含但不限于表达载体和病毒载体。载体可以包括一种或多种外源、内源或异源控制序列，如启动子和/或增强子。“内源控制序列”是与基因组中的给定基因天然连接的序列。“外源控制序列”是通过基因操纵(即分子生物学技术)与被放置成与基因并置使得此基因的转录由所连接的增强子/启动子引导的序列。“异源控制序列”是与被基因操纵的细胞来自不同物种的外源序列。“合成”控制序列可以包括一种或多种内源和/或外源序列和/或在体外或计算机中所确定的为特定疗法提供最佳启动子和/或增强子活性的序列的元件。

如本文所使用的，术语“启动子”是指RNA聚合酶结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶启动并转录与启动子可操作地连接的多核苷酸。在特定实施例中，在哺乳动物细胞中起作用的启动子包括位于起始转录位点上游大约25个到30个碱基的AT富含区和/或发现距离转录起始上游70个到80个碱基的另一个序列，即N可以是任何核苷酸的CNCAAT区。

术语“增强子”是指含有能够提供增强的转录的序列并且在一些情况下可以不依赖于其相对于另一个控制序列的朝向而起作用的DNA的区段。增强子可以与启动子和/或其它增强子元件协同地或相加性地起作用。术语“启动子/增强子”是指含有能够提供启动子和增强子两者的功能的序列的DNA的区段。

术语“可操作地连接”是指并置，其中所描述的组分处于允许其以其预期的方式起作用的关系中。在一个实施例中，所述术语是指核酸表达控制序列(如启动子和/或增强子)与第二多核苷酸序列，例如，所关注的多核苷酸之间的功能性连接，其中表达控制序列引导对应于第二序列的核酸的转录。

如本文所使用的，术语“组成型表达控制序列”是指连续地或连续不断地允许可操作地连接的序列的转录的启动子、增强子或启动子/增强子。组成型表达控制序列可以是允许在各种各样的细胞和组织类型中表达的“普遍存在的”启动子、增强子或启动子/增强子或分别允许在受限种类的细胞和组织类型中表达的“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子、增强子或启动子/增强子。

适合于在特定实施例中使用的示例性普遍存在的表达控制序列包含但不限于：巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、Rous肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、H5、来自牛痘病毒的P7.5启动子和P11启动子、延伸因子1-α(EF1α)启动子、早期生长应答1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ、成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人ROSA26基因座(Irions等人,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》,25,1477-1482(2007))、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增殖性肉瘤病毒增强子阴性对照区缺失并且dl587rev引物结合位点取代的(MND)U3启动子(Haas等人,《病毒学期刊(Journal of Virology)》2003；77(17):9439-9450)。

在一个实施例中，载体包括MNDU3启动子。

在一个实施例中，载体包括包含人EF1a基因的第一内含子的EF1a启动子。

在一个实施例中，载体包括缺少人EF1a基因的第一内含子的EF1a启动子。

在特定实施例中，可能期望使用细胞、细胞类型、细胞谱系或组织特异性表达控制序列来实现期望的多核苷酸序列的细胞类型特异性、谱系特异性或组织特异性表达(例如，仅在细胞类型、细胞谱系或组织的子集中或在发育的特定阶段期间表达编码多肽的特定核酸)。

在特定实施例中，可能需要将多核苷酸表达为T细胞特异性启动子。

如本文所使用的，“条件表达”可以是指任何类型的条件表达，包含但不限于：诱导型表达；可阻遏型表达；在具有特定生理、生物或疾病状态等的细胞或组织中的表达。此定义不旨在排除细胞类型或组织特异性表达。某些实施例提供了所关注多核苷酸的条件表达，例如通过使细胞、组织、生物体等经受导致多核苷酸表达或导致由所关注多核苷酸编码的多核苷酸的表达增加或减少的治疗或病状来控制表达。

诱导型启动子/系统的说明性实例包含但不限于：类固醇诱导型启动子如编码糖皮质激素或***受体的基因的启动子(通过用对应的激素处理可诱导)、金属硫蛋白启动子(通过各种重金属处理可诱导)、MX-1启动子(通过干扰素可诱导)、“基因开关(GeneSwitch)”米非司酮可调节系统(Sirin等人,2003,《基因(Gene)》,323:67)、cumate诱导型基因开关(WO 2002/088346)、四环素依赖性调节系统等。诱导剂包含但不限于糖皮质激素、***、米非司酮(RU486)、金属、干扰素、小分子、cumate、四环素、多西环素及其变体。

还可以通过使用位点特异性DNA重组酶来实现条件表达。根据某些实施例，载体包括由位点特异性重组酶介导的重组的至少一个(通常两个)位点。如本文所使用的，术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”包含切除或整合蛋白、酶、辅因子或参与涉及一个或多个重组位点(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)的重组反应的相关蛋白，所述蛋白可以是野生型蛋白质(参见Landy,《生物技术当前述评(Current Opinionin Biotechnology)》3:699-707(1993))或突变体、衍生物(例如，含有重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段及其变体。适合于在特定实施例中使用的重组酶的说明性实例包含但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1和ParA。

多核苷酸可以包括各种各样的位点特异性重组酶中的任何位点特异性重组酶的一个或多个重组位点。应理解，位点特异性重组酶的靶位点是对整合载体(例如，逆转录载体或慢病毒载体)所需的任何一个或多个位点的补充。如本文所使用的，术语“重组序列”、“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指重组酶识别和结合的特定核酸序列。

例如，Cre重组酶的一个重组位点是loxP，其是34碱基对序列，所述碱基对序列包括8碱基对核心序列两侧的两个13碱基对反向重复序列(用作重组酶结合位点)(参见图1中Sauer,B.,《生物技术当前述评》,5:521-527(1994))。其它示例性loxP位点包含但不限于：lox511(Hoess等人,1996；Bethke和Sauer,1997)、lox5171(Lee和Saito,1998)、lox2272(Lee和Saito,1998)、m2(Langer等人,2002)、lox71(Albert等人,1995)以及lox66(Albert等人,1995)。

FLP重组酶的适当识别位点包含但不限于：FRT(McLeod等人,1996)、F₁,F₂,F₃(Schlake和Bode,1994)、F_4,F₅(Schlake和Bode,1994)、FRT(LE)(Senecoff等人,1988)、FRT(RE)(Senecoff等人,1988)。

识别序列的其它实例为attB序列、attP序列、attL序列和attR序列，其被重组酶λ整合酶识别，例如phi-c31。

SSR介导仅在异型位点attB(长度为34bp)与attP(长度为39bp)之间的重组(Groth等人，2000)。分别以细菌和噬菌体基因组上用于噬菌体整合酶的附接位点命名的attB和attP均含有可能由同源二聚体结合的不完全的反向重复序列(Groth等人,2000)。产物位点attL和attR对另外的介导的重组具有有效惰性(Belteki等人,2003)，从而使反应不可逆。对于催化***，已经发现携带attB的DNA***基因组attP位点比attP位点***基因组attB位点更容易(Thyagarajan等人,2001；Belteki等人,2003)。因此，典型的策略通过同源重组将携带attP的“对接位点”定位到限定的基因座中，然后所述基因座与携带attB的进入序列配合以便***。

如本文所使用的，“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指促进内部核糖体直接进入顺反子(蛋白编码区)的如ATG等起始密码子由此导致基因的非帽依赖性转译的元件。参见例如，Jackson等人,1990《生物化学科学趋势(Trends Biochem Sci)》15(12):477-83以及Jackson和Kaminski,1995《RNA》1(10):985-1000。本领域的技术人员通常采用的IRES的实例包含美国专利第6,692,736号中所描述的IRES。本领域已知的“IRES”的另外的实例包含但不限于可从小核糖核酸病毒(Jackson等人,1990)获得的IRES以及可从病毒或细胞mRNA源获得的IRES，所述病毒或细胞mRNA源如例如免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)、血管内皮生长因子(VEGF)(Huez等人,1998《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》18(11):6178-6190)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)和***(IGFII)、可转译起始因子eIF4G和酵母转录因子TFIID和HAP4、可从诺瓦根公司(Novagen)商购获得的脑心肌炎病毒(EMCV)(Duke等人,1992《病毒学期刊(J.Virol)》66(3):1602-9)以及VEGF IRES(Huez等人,1998《分子细胞生物学》18(11):6178-90)。已经报道了小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、二顺反子病毒科(Dicistroviridae)和黄病毒科(Flaviviridae)物种的病毒基因组中以及HCV、弗里德鼠白血病病毒(Friend murine leukemia virus，FrMLV)和莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMLV)中的IRES。

在一个实施例中，本文设想的多核苷酸中使用的IRES是EMCV IRES。

在特定实施例中，多核苷酸包括具有共有Kozak序列并编码期望多肽的多核苷酸。如本文所使用的，术语“Kozak序列”是指大大促进mRNA与核糖体的小亚单元的初始结合并增加转译的短核苷酸序列。共有Kozak序列是(GCC)RCCATGG(SEQ ID NO:48)，其中R是嘌呤(A或G)(Kozak,1986《细胞(Cell)》44(2):283-92以及Kozak,1987《核酸研究(NucleicAcids Res.)》15(20):8125-48)。

引导异源核酸转录物的高效终止和多腺苷酸化的元件增加异源基因表达。转录终止信号通常存在于多腺苷酸化信号的下游。在特定实施例中，载体包括对待表达的多肽进行编码的多核苷酸的3'处的多腺苷酸化序列。如本文所使用的，术语“polyA位点”或“polyA序列”表示通过RNA聚合酶II引导新生RNA转录物的终止和多腺苷酸化二者的DNA序列。多腺苷酸化序列可以通过向编码序列的3'端添加polyA尾来促进mRNA稳定性，并且因此有助于提高转译效率。裂解和多腺苷酸化由RNA中的poly(A)序列引导。哺乳动物前mRNA的核心poly(A)序列具有位于裂解-多腺苷酸化位点两侧的两个识别元件。通常，几乎不变的AAUAAA六聚***于富含U或GU残基的更加可变元件的上游20-50个核苷酸处。新生转录物的裂解发生在这两种元件之间，并且与向5'裂解产物添加的多达250个腺苷偶联。在特定实施例中，核心poly(A)序列是理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)。在特定实施例中，poly(A)序列是SV40 polyA序列、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白polyA序列(rβgpA)、其变体或本领域已知的另一适合的异源或内源polyA序列。在特定实施例中，poly(A)序列是合成的。

在一些实施例中，多核苷酸或含有多核苷酸的细胞利用***基因，包含用于减小直接毒性和/或不受控制的增殖的风险的诱导型***基因。在具体实施例中，***基因对含有多核苷酸或细胞的宿主不产生免疫性。可以使用的***基因的某个实例是半胱天冬酶-9或半胱天冬酶-8或胞嘧啶脱氨酶。可以使用特定的二聚化学诱导剂(CID)来活化半胱天冬酶-9。

在某些实施例中，多核苷酸包括导致免疫效应细胞(例如，T细胞)易于在体内进行阴性选择的基因片段。“阴性选择”是指由于个体的体内病状的改变而可以消除的输注细胞。阴性可选择表型可以由对所施用药剂，例如化合物，赋予敏感性的基因的***而产生。阴性可选择基因在本领域是已知的，并且包含但不限于：赋予更昔洛韦敏感性的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人,《细胞》,11:223,1977)；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因；细胞腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)基因以及细菌胞嘧啶脱氨酶，(Mullen等人,《美国国家科学院院刊》,89:33(1992))。

在一些实施例中，如T细胞等基因修饰的免疫效应细胞包括多核苷酸，所述多核苷酸进一步包括能够在体外选择阴性可选择表型的细胞的阳性标志物。阳性可选择标志物可以是基因，其在被引入宿主细胞后表达允许阳性选择携带基因的细胞的显性表型。这种类型的基因是本领域已知的，并且包含但不限于：赋予潮霉素B抗性的潮霉素-B磷酸转移酶基因(hph)、来自编码对抗生素G418的抗性的Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、腺苷脱氨酶基因(ADA)以及多抗药性(MDR)基因。

在一个实施例中，阳性可选择标志物和阴性可选择元件连接，使得阴性可选择元件的丧失也必然伴随着阳性可选择标志物的丧失。在特定实施例中，阳性可选择标志物和阴性可选择标志物融合，使得一者的丧失必然导致另一者的丧失。作为表达产物产生赋予上文所描述的期望阳性选择特征和阴性选择特征的多肽的融合多核苷酸的实例是潮霉素磷酸转移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)。此基因的表达产生赋予对体外阳性选择的潮霉素B抗性以及对体内阴性选择的更昔洛韦敏感性的多肽。还参见S.D.Lupton的公开案PCTUS91/08442和PCT/US94/05601，其描述了使用通过将显性阳性可选择标志物与阴性可选择标志物融合产生的双功能可选择融合基因。

优选的阳性可选择标志物源自选自由hph、nco和gpt组成的组的基因，并且优选的阴性可选择标志物源自由胞嘧啶脱氨酶、HSV-I TK、VZV TK、HPRT、APRT和gpt组成的组的基因。特定实施例中设想的示例性双功能可选择融合基因包含但不限于这样的基因：其中阳性可选择标志物源自hph或neo并且阴性可选择标志物源自胞嘧啶脱氨酶或者TK基因或可选择标志物。

在特定实施例中，对一种或多种DARIC组分、多肽或融合多肽进行编码的多核苷酸可以通过非病毒和病毒方法引入到免疫效应细胞中，例如T细胞。在特定实施例中，一种或多种多核苷酸的递送可以通过相同的方法或通过不同的方法和/或通过相同的载体或通过不同的载体来提供。

术语“载体”在本文中用于是指能够转移或转运另一个核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如***到载体核酸分子中。载体可以包含引导细胞中的自主复制的序列或可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。在特定实施例中，非病毒载体用于将本文所设想的一个或多个多核苷酸递送到T细胞。

非病毒载体的说明性实例包含但不限于质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒以及细菌人工染色体。

在特定实施例中所设想的多核苷酸的非病毒递送的说明性方法包含但不限于：电穿孔、声孔、脂质转染、显微注射、基因枪法、病毒体、脂质体、免疫脂质体、纳米颗粒、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、DEAE-葡聚糖介导的转移、基因枪和热休克。

在特定实施例中所设想的适合在特定实施例中使用的多核苷酸递送系统的说明性实例包含但不限于由阿马夏生物系统公司(Amaxa Biosystems)、马克赛特公司(Maxcyte,Inc.)、BTX分子递送系统公司(BTX Molecular Delivery Systems)和哥白尼治疗公司(Copernicus Therapeutics Inc.)提供的系统。脂质转染试剂是商业销售的(例如，Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。已经在文献中描述了适合于多核苷酸的高效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质。参见例如，Liu等人(2003)《基因治疗(Gene Therapy)》10:180-187；以及Balazs等人(2011)《药物递送杂志(Journal of Drug Delivery)》2011:1-12。在特定实施例中还设想了抗体靶向的、源自细菌的、基于无生命纳米细胞的递送。

如下文所描述的，包括对在特定实施例中所设想的一种或多种DARIC组分进行编码的多核苷酸的病毒载体可以通过向个体患者施用进行体内递送，通常通过全身施用(例如，静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或颅内输注)或局部应用。可替代地，载体可以离体递送到细胞，如从个体患者移植的细胞(例如，动员的外周血、淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检等)或通用供体造血干细胞，然后将细胞再植入患者体内。

在一个实施例中，直接向生物体施用包括对本文所设想的一种或多种DARIC组分进行编码的多核苷酸的病毒载体以在体内转导细胞。可替代地，可以施用裸DNA。通过通常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径施用，包含但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。施用这种核酸的合适的方法是本领域技术人员可获得的并且是公知的，并且尽管可以使用多于一种途径来施用特定组合物，但是特定途径通常可以提供比另一条途径更直接且更有效的反应。

适合于在特定实施例中所设想的特定实施例中使用的病毒载体系统的说明性实例包含但不限于腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒(例如，慢病毒)、单纯疱疹病毒、腺病毒以及痘苗病毒载体。

在各个实施例中，通过用腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒以及痘苗病毒载体转导细胞，将对一种或多种DARIC组分进行编码的多核苷酸引入到免疫效应细胞中，例如，T细胞。

在各个实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)转导细胞，将一个或多个多核苷酸引入到免疫效应细胞中，例如，T细胞。

AAV是一种小型(约26nm)复制缺陷型、主要是附加型无包膜病毒。AAV可以感染***和非***细胞，并且可以将其基因组并入到宿主细胞的基因组中。重组AAV(rAAV)通常至少由转基因及其调节序列和5'和3'AAV反向末端重复序列(ITR)构成。ITR序列的长度为约145bp。在特定实施例中，rAAV包括从AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10分离的ITR和衣壳序列。

在一些实施例中，使用嵌合rAAV，从一种AAV血清型分离ITR序列，并从不同的AAV血清型分离衣壳序列。例如，具有源自AAV2的ITR序列和源自AAV6的衣壳序列的rAAV被称为AAV2/AAV6。在特定实施例中，rAAV载体可以包括来自AAV2的ITR以及来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中任一种的衣壳蛋白。在优选实施例中，rAAV包括源自AAV2的ITR序列和源自AAV6的衣壳序列。在优选实施例中，rAAV包括源自AAV2的ITR序列和源自AAV2的衣壳序列。

在一些实施例中，工程和选择方法可以应用于AAV衣壳，以使其更有可能转导所关注细胞。

已经公开了rAAV载体的构建、制备和其纯化，例如在美国专利第9,169,494号；第9,169,492号；第9,012,224号；第8,889,641号；第8,809,058号；和第8,784,799号，上述美国专利中的每一个以全文引用的方式并入本文中。

在各个实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的逆转录病毒(例如，慢病毒)转导细胞，将一个或多个多核苷酸引入到免疫效应细胞中，例如，T细胞。

如本文所使用的，术语“逆转录病毒”是指RNA病毒，所述RNA病毒将其基因组RNA逆转录为线性双链DNA拷贝并且随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。适合用于特定实施例的说明性逆转录病毒包含但不限于：莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗里德鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)以及慢病毒。

如本文所使用的，术语“慢病毒”是指复杂逆转录病毒的组(或属)。说明性慢病毒包含但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施例中，优选基于HIV的载体主链(即，HIV顺式作用序列元件)。

在各个实施例中，本文所设想的慢病毒载体包括一个或多个LTR，以及以下辅助元件中的一个或多个或全部：cPPT/FLAP、Psi(Ψ)包装信号、输出元件、poly(A)序列，并且可以任选地包括WPRE或HPRE、绝缘子元件、可选择标志物和细胞***基因，如本文其它地方所讨论的。

在特定实施例中，本文所设想的慢病毒载体可以是整合的或非整合的或整合缺陷型慢病毒。如本文所使用的，术语“整合缺陷型慢病毒”或“IDLV”是指具有缺乏将病毒基因组整合到宿主细胞的基因组的能力的整合酶的慢病毒。专利申请WO 2006/010834中已经描述了无整合能力的病毒载体，所述专利申请以全文引用的方式并入本文中。

适于减小整合酶活性的HIV-1pol基因的说明性突变包含但不限于：H12N、H12C、H16C、H16V、S81R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199c、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A和K264H。

术语“长末端重复序列(LTR)”是指位于逆转录病毒DNA的末端处的碱基对的结构域，其在其天然序列环境中是直接重复序列并含有U3、R和U5区。

如本文所使用的，术语“FLAP元件”或“cPPT/FLAP”指代序列包含逆转录病毒(例如，HIV-1和HIV-2)的中心多嘌呤段和中心终止序列(cPPT和CTS)的核酸。在美国专利第6,682,907号和Zennou等人,2000,《细胞》,101:173中描述了适合的FLAP元件。

如本文所使用的，术语“包装信号”或“包装序列”是指位于逆转录病毒基因组内的psi[Ψ]序列，所述序列是将病毒RNA***病毒衣壳或颗粒中所需要的，参见例如Clever等人,1995,《病毒学期刊》,第69卷,第4期；第2101-2109页。

术语“输出元件”是指调节RNA转录物从细胞的细胞核向细胞质转运的顺式作用转录后调节元件。RNA输出元件的实例包含但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)(参见例如，Culle等人,1991.《病毒学期刊》65:1053；和Culle等人,1991《细胞》58:423)以及乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)。

在特定实施例中，通过将转录后调节元件、高效的多腺苷酸化位点和任选地转录终止信号结合到载体中来增加异源序列在病毒载体中的表达。各种转录后调节元件可以增加异源核酸在蛋白质处的表达，例如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE；Zufferey等人,1999,《病毒学期刊》,73:2886)；乙型肝炎病毒中存在的转录后调节元件(HPRE)(Huang等人,《分子细胞生物学》，5:3864)；等等(Liu等人,1995,《基因与发育》,9:1766)。

由于修饰LTR，慢病毒载体优选地含有几种安全性增强。“自失活”(SIN)载体是指复制缺陷型载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体，其中被称为U3区的右(3')LTR增强子-启动子区已经被修饰(例如，通过缺失或取代)以防止病毒转录超过第一轮病毒复制。优选地通过在载体DNA的3'LTR的U3区引入缺失(即，用于产生载体RNA的DNA)来实现自失活。因此，在逆转录期间，此缺失被转移到前病毒DNA的5'LTR。在特定实施例中，期望消除足够的U3序列以大大减少或完全消除LTR的转录活性，从而大大减少或消除转导细胞中全长载体RNA的产生。在基于HIV的慢病毒载体的情况下，已经发现这种载体耐受显著的U3缺失，包含去除LTR TATA盒(例如，从-418至-18的缺失)，而没有显著降低载体滴度。

通过用异源启动子替代5'LTR的U3区来提供另外的安全性增强以驱动病毒颗粒产生期间病毒基因组的转录。可以使用的异源启动子的实例包含例如病毒性猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如，立即早期)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(MoMLV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)和单纯性疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。

如本文所使用的，术语“假型”或“假型包装”是指其病毒包膜蛋白已经被具有优选特性的另一病毒的病毒包膜蛋白取代的病毒。例如，HIV可以用水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白进行假型包装，这允许HIV感染更广泛的细胞，因为HIV包膜蛋白(由env基因编码)通常将病毒靶向CD4+呈递细胞。

在某些实施例中，根据已知方法产生慢病毒载体。参见例如Kutner等人,《BMC生物技术(BMC Biotechnol)》2009；9:10.doi:10.1186/1472-6750-9-10.Kutner等人,《自然实验手册(Nat.Protoc.)》2009；4(4):495–505.doi:10.1038/nprot.2009.22。

根据本文所设想的某些具体实施例，大多数或所有病毒载体主链序列都源自慢病毒，例如，HIV-1。然而，应理解，可以使用或组合许多不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列，或者可以容置慢病毒序列中的某些慢病毒序列的多种取代和改变而不损害转移载体执行本文所描述的功能的能力。此外，各种慢病毒载体在本领域中是已知的，参见Naldini等人,(1996a、1996b和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998,美国专利第6,013,516号；和第5,994,136号，其中许多可以适于产生本文所设想的病毒载体或转移质粒。

在各个实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的腺病毒转导细胞，将一个或多个多核苷酸引入到免疫效应细胞中。

基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有极高转导效率并且并不需要细胞***。使用这种载体，已经获得了高滴度和高表达水平。此载体可以在相对简单的系统中大量制备。将大多数腺病毒载体工程化，使得转基因取代Ad E1a、E1b和/或E3基因；随后，在以反式提供缺失的基因功能的人293细胞中繁殖复制缺陷型载体。Ad载体可以在体内转导多种类型的组织，包含如在肝、肾和肌肉中发现的非***的分化细胞。常规Ad载体具有很大的承载能力。

复制缺陷的当前腺病毒载体的产生和繁殖可以利用命名为293的独特辅助细胞系，所述辅助细胞系通过Ad5 DNA片段从人胚胎肾细胞转化并组成性地表达E1蛋白(Graham等人,1977)。由于E3区可从腺病毒基因组中分配出来(Jones和Shenk,1978)，所以目前的腺病毒载体在293细胞的帮助下在E1、D3区或两个区中携带外源DNA(Graham和Prevec,1991)。腺病毒载体已经用于真核基因表达(Levrero等人,1991；Gomez-Foix等人,1992)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz,1992；Graham和Prevec,1992)。向不同的组织施用重组腺病毒方面的研究包含气管滴注(Rosenfeld等人,1991；Rosenfeld等人,1992)、肌肉注射(Ragot等人,1993)、外周静脉注射(Herz和Gerard,1993)以及立体定向脑内接种(Le Gal La Salle等人,1993)。在临床试验中使用Ad载体的实例涉及用于伴随肌内注射的抗肿瘤免疫的多核苷酸疗法(Sterman等人,《人基因疗法(Hum.Gene Ther.)》7:1083-9(1998)中所述。

在各个实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的单纯疱疹病毒例如，HSV-1、HSV-2转导细胞，将一个或多个多核苷酸引入到免疫效应细胞中。

成熟HSV病毒粒子由包膜的二十面体衣壳组成，其中病毒基因组由152kb的线性双链DNA分子组成。在一个实施例中，基于HSV的病毒载体缺乏一个或多个必需或非必需的HSV基因。在一个实施例中，基于HSV的病毒载体为复制缺陷型。大多数复制缺陷型HSV载体含有缺失以去除一个或多个中早期、早期或晚期HSV基因从而防止复制。例如，HSV载体可能缺乏选自由以下组成的组的立即早期基因：ICP4、ICP22、ICP27、ICP47及其组合。HSV载体的优点是其进入可以导致长期DNA表达的潜伏期的能力，以及其可以容纳高达25kb的外源DNA***物的大型病毒DNA基因组。在例如美国专利第5,837,532号、第5,846,782号和第5,804,413号以及国际专利申请WO 91/02788、WO 96/04394、WO 98/15637和WO 99/06583中描述了基于HSV的载体，所述专利中的每一个以全文引用的方式并入本文中。

G.经过基因修饰的细胞

在各个实施例中，对细胞进行修饰以表达用于治疗癌症的本文所设想的一种或多种NKG2D DARIC组分、NKG2D DARIC受体、工程化TCR、CAR、zetakine和/或融合蛋白。可以对细胞进行非基因修饰以表达本文所设想的多肽中的一种或多种多肽，或者在特定优选的实施例中，可以对细胞进行基因修饰以表达本文所设想的多肽中的一种或多种多肽。如本文所使用的，术语“基因工程化”或“基因修饰”是指将额外的遗传物质以DNA或RNA的形式添加到细胞中的总遗传物质中。在特定实施例中，术语“基因修饰细胞”、“修饰细胞”和“重定向的细胞”可互换使用。

在特定实施例中，本文所设想的一种或多种NKG2D DARIC组分被引入免疫效应细胞中并在其中表达，以改进免疫效应细胞的功效。在特定实施例中，一种或多种NKG2DDARIC组分被引入免疫效应细胞中并在其中表达，所述免疫效应细胞通过在细胞中共表达工程化抗原受体而被重定向到靶细胞。

在特定实施例中，设想了双靶向免疫效应细胞，其中靶细胞表达被NKG2D DARIC受体识别的一种或多种NKG2D配体和被另一种DARIC结合组分识别的抗原。在特定实施例中，其它DARIC结合组分结合B7-H3、BCMA、CD19、CD20、CD22、CD33、CD79A、CD79B、EGFR或EGFRvIII。

在特定实施例中，设想了双靶向免疫效应细胞，其中靶细胞表达被工程化抗原受体识别的抗原和被NKG2D DARIC受体识别的一种或多种NKG2D配体。

“免疫效应细胞”是免疫系统的任何细胞，其具有一种或多种效应功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子分泌、ADCC和/或CDC的诱导)。本文所设想的说明性免疫效应细胞是T淋巴细胞，具体地是细胞毒性T细胞(CTL；CD8⁺T细胞)、TIL和辅助T细胞(HTL；CD4⁺T细胞)。在特定实施例中，所述细胞包括αβT细胞。在特定实施例中，所述细胞包括γδT细胞。在一个实施例中，免疫效应细胞包含自然杀伤(NK)细胞。在一个实施例中，免疫效应细胞包含自然杀伤T(NKT)细胞。免疫受体细胞可以是自体的(autologous/autogeneic)(“自身的”)或非自体的(“非自身的”，例如同种异体的、同基因的或异种的)。

如本文所使用的，“自体”是指来自同一受试者的细胞。如本文所使用的，“同种异体”是指同一物种的在基因上与比较细胞不同的细胞。如本文所使用的，“同基因”是指不同受试者的在基因上与比较细胞完全相同的细胞。如本文所使用的，“异种”是指与比较细胞属于不同物种的细胞。在优选实施例中，细胞是自体的。

适用于引入本文所设想的一种或多种NKG2D DARIC组分或NKG2D DARIC受体的说明性免疫效应细胞包含T淋巴细胞。术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的并且旨在包含胸腺细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助(Th)细胞，例如T辅助1(Th1)细胞或T辅助2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助T细胞(HTL；CD4⁺T细胞)CD4⁺T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8⁺T细胞)、CD4⁺CD8⁺T细胞、CD4^-CD8^-T细胞或任何其它的T细胞亚群。适于用于特定实施例中的其它说明性T细胞群包含原初T细胞和记忆T细胞。

如本领域技术人员所理解的，其它细胞还可以用作包括本文所设想的一种或多种NKG2D DARIC组分或NKG2D DARIC受体的免疫效应细胞。在特定实施例中，免疫效应细胞还包含NK细胞、NKT细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。免疫效应细胞还包含效应细胞的祖细胞，其中可以在体内或体外诱导这种祖细胞分化成免疫效应细胞。因此，在特定实施例中，免疫效应细胞包含免疫效应细胞的祖细胞，如源自脐带血、骨髓或动员的外周血的CD34+细胞群内含有的造血干细胞(HSC)，所述HSC在受试者中施用后分化为成熟免疫效应细胞，或可以在体外诱导所述HSC分化为成熟免疫效应细胞。

如本文所使用的，术语“CD34+细胞”是指在其细胞表面上表达CD34蛋白的细胞。如本文所使用的，“CD34”是指通常充当细胞—细胞粘附因子并且参与T细胞进入***的细胞表面糖蛋白(例如，唾液黏蛋白)。CD34+细胞群含有造血干细胞(HSC)，其在施用给患者时分化并促成所有造血谱系，包含T细胞、NK细胞、NKT细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞。

在特定实施例中，提供了用于制备表达本文所设想的一种或多种NKG2D DARIC组分的免疫效应细胞的方法。在一个实施例中，所述方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，使得具有一种或多种核酸和/或载体或其组合的免疫效应细胞包括本文所设想的一种或多种NKG2D DARIC组分。在一个实施例中，所述方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达DARIC信号传导组分、NKG2D DARIC结合组分和结合B7-H3、BCMA、CD19、CD20、CD22、CD33、CD79A、CD79B、EGFR或EGFRvIII的另一种DARIC结合组分。在一个实施例中，所述方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达本文所设想的一种或多种NKG2D DARIC组分和工程化抗原受体。在某些实施例中，免疫效应细胞从个体分离并经基因修饰而无需在体外进一步操纵。然后，可以将这种细胞直接再次施用到个体。在另外的实施例中，免疫效应细胞在基因修饰之前首先在体外被活化和刺激以增殖。在这方面，可以在基因修饰之前和/或之后培养免疫效应细胞。

在特定实施例中，在本文所述的免疫效应细胞的体外操纵或基因修饰之前，从受试者获得细胞来源。在特定实施例中，经过修饰的免疫效应细胞包括T细胞。

可以从许多来源获得T细胞，包含但不限于：外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在某些实施例中，可以使用技术人员已知的任何数目的技术如沉降(例如，FICOLL^TM分离)从采集自受试者的单位血液中获得T细胞。

在其它实施例中，使用分离的或纯化的T细胞群。在一些实施例中，在PBMC的分离之后，可以在活化、扩增和/或基因修饰之前或之后将细胞毒性和辅助T淋巴细胞分类为原初、记忆和效应T细胞亚群。

在一个实施例中，分离的或纯化的T细胞群表达包含但不限于以下的标志物中的一个或多个：CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺或其组合。

在某些实施例中，T细胞从个体分离，并且在进行修饰以表达一种或多种NKG2DDARIC组分之前首先进行体外活化和刺激以增殖。

为了实现足够治疗剂量的T细胞组合物，通常对T细胞进行一轮或多轮刺激、活化和/或扩增。通常可以使用如例如以下美国专利中所述的方法使T细胞活化和扩增：第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；和第6,867,041号，上述美国专利中的每一个以全文引用的方式并入本文中。在特定实施例中，在引入对一种或多种DARIC免疫受体多肽进行编码的载体或多核苷酸之前，使T细胞活化和扩增约6小时、约12小时、约18小时或约24小时。任选地，与本文所设想的工程化抗原受体组合。

在一个实施例中，T细胞在被修饰的同时被活化。

在各个实施例中，一种产生免疫效应细胞的方法包括活化包括T细胞的细胞群以及扩增所述T细胞群。T细胞活化可以通过以下方式实现：通过T细胞TCR/CD3复合物提供初级刺激信号以及通过辅助分子(例如，CD28)提供次级共刺激信号。

可以通过使T细胞与适当的CD3结合剂(例如，CD3配体或抗CD3单克隆抗体)接触来刺激TCR/CD3复合物。CD3抗体的说明性实例包含但不限于：OKT3、G19-4、BC3和64.1。

除了通过TCR/CD3复合物提供的初级刺激信号外，T细胞应答的诱导还需要第二共刺激信号。在特定实施例中，CD28结合剂可以用于提供共刺激信号。CD28结合剂的说明性实例包含但不限于：天然CD 28配体，例如，CD28的天然配体(例如，B7蛋白家族的成员，如B7-1(CD80)和B7-2(CD86)；以及能够交联CD28分子的抗CD28单克隆抗体或其片段，例如，单克隆抗体9.3、B-T3、XR-CD28、KOLT-2、15E8、248.23.2和EX5.3D10。

在一个实施例中，提供初级刺激信号的分子例如通过TCR/CD3复合物提供刺激的分子以及共刺激分子偶联到同一表面。

在某些实施例中，提供刺激和共刺激信号的结合剂定位于细胞的表面上。这可以通过以下方式实现：使用以适合于结合剂在细胞表面上的表达的形式对结合剂进行编码的核酸转染或转导细胞，或者可替代地将结合剂偶联到细胞表面。

在另一个实施例中，提供初级刺激信号的分子例如通过TCR/CD3复合物提供刺激的分子以及共刺激分子展现在抗原呈递细胞上。

在一个实施例中，提供初级刺激信号的分子例如通过TCR/CD3复合物提供刺激的分子以及共刺激分子提供于单独的表面上。

在某个实施例中，所述结合剂中提供刺激信号和共刺激信号的一种结合剂是可溶的(在溶液中提供)，而另一种或其它结合剂提供于一个或多个表面上。

在特定实施例中，提供刺激信号和共刺激信号的结合剂两者均以可溶形式(在溶液中提供)提供。

在各个实施例中，本文所设想的用于制备T细胞的方法包括使用抗CD3和抗CD28抗体活化T细胞。

在一个实施例中，扩增通过本文所设想的方法活化的T细胞进一步包括培养包括T细胞的细胞群若干小时(约3小时)到约7天到约28天或其间的任何小时整数值。在另一个实施例中，可以将T细胞组合物培养14天。在特定实施例中，将T细胞培养约21天。在另一个实施例中，将T细胞组合物培养约2至3天。还可以期望若干刺激/活化/扩增循环，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。

在特定实施例中，适合T细胞培养的条件包含适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))和增殖和活力所必需的一个或多个因子，包含但不限于：血清(例如，胎牛血清或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、IL-21、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域的技术人员已知的适合于细胞生长的任何其它添加剂。

细胞培养基的另外的说明性实例包含但不限于：RPMI 1640、Clicks、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，其添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，其无血清或补充有适量血清(或血浆)或一组限定的激素和/或足以使T细胞生长和扩增的量的一个或多个细胞因子。

抗生素(例如，青霉素和链霉素)仅在实验培养时包含，而在培养待注入受试者体内的细胞时不包含。靶细胞保持处于支持生长所需的条件下，例如适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％的C02)。

在特定实施例中，在具有适当细胞因子如IL-2、IL-7和/或IL-15等培养基中使PBMC或分离的T细胞与通常附接到珠粒或其它表面的刺激剂和共刺激剂如抗CD3和抗CD28抗体接触。

在其它实施例中，通过工程化K562、U937、721.221、T2和C1R细胞制备人工APC(aAPC)以引导各种共刺激分子和细胞因子的稳定表达和分泌。在特定实施例中，K32或U32aAPC用于引导一个或多个基于抗体的刺激分子在AAPC细胞表面上显示。T细胞群可以通过表达各种共刺激分子的aAPC扩增，包含但不限于CD137L(4-1BBL)、CD134L(OX40L)和/或CD80或CD86。最后，aAPC提供用于扩增经过基因修饰的T细胞并且保持CD8 T细胞上的CD28表达的高效平台。WO 03/057171和US 2003/0147869中提供的aAPC以全文引用的方式并入本文中。

在特定实施例中，将对DARIC信号传导组分、NKG2D DARIC结合组分和结合B7-H3、BCMA、CD19、CD20、CD22、CD33、CD79A、CD79B、EGFR或EGFRvIII的另一种DARIC结合组分进行编码的多核苷酸引入到T细胞群中。

在特定实施例中，将对一种或多种NKG2D DARIC组分和工程化抗原受体进行编码的多核苷酸引入到T细胞群中。在特定实施例中，将对一种或多种NKG2D DARIC组分进行编码的多核苷酸引入到表达工程化抗原受体的T细胞群中。可以通过显微注射、转染、脂质转染、热休克、电穿孔、转导、基因枪、显微注射、DEAE-葡聚糖介导的转移等将多核苷酸引入到T细胞中。

在优选实施例中，通过病毒转导将多核苷酸引入到T细胞中。

适合于将多核苷酸引入到免疫效应细胞或CD34+细胞中的病毒载体系统的说明性实例包含但不限于用于基因转移的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒载体。

在一个实施例中，通过AAV转导将多核苷酸引入到T细胞中。

在一个实施例中，通过逆转录病毒转导将多核苷酸引入到T细胞中。

在一个实施例中，通过慢病毒转导将多核苷酸引入到T细胞中。

在一个实施例中，通过腺病毒转导将多核苷酸引入到T细胞中。

在一个实施例中，通过单纯疱疹病毒转导将多核苷酸引入到T细胞中。

在一个实施例中，通过牛痘病毒转导将多核苷酸引入到T细胞中。

H.组合物和调配物

本文所设想的组合物可以包括一种或多种多肽、多核苷酸、包括其的载体、基因修饰的免疫效应细胞、桥接因子等。组合物包含但不限于药物组合物。“药物组合物”是指单独地或与一种或多种其它治疗方式组合地施用于细胞或动物的在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中调配的组合物。还应理解，如果需要，组合物也可以与其它药剂组合施用，例如细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学治疗剂、前药、药物、抗体或其它各种药学活性剂。对组合物中还可以包含的其它组分实际上不存在限制，条件是另外的药剂不会不利地影响组合物递送预期疗法的能力。

短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

术语“药学上可接受的载剂”是指对桥接因子、多肽、多核苷酸、包括其的载体或基因修饰的免疫效应细胞施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。药物载剂的说明性实例可以是无菌液体，如细胞培养基、水和油，包含石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。还可以使用生理盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液作为液体载体，特别是用于可注射溶液。在特定实施例中，适合的药物赋形剂包含淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。除了任何常规培养基或药剂与活性成分不相容的情况之外，设想了其在药物组合物中的用途。补充性活性成分也可以并入到组合物中。

在一个实施例中，包括药学上可接受的载剂的组合物适于施用于受试者。在特定实施例中，包括载剂的组合物适于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌内施用。在特定实施例中，包括药学上可接受的载剂的组合物适合于心室内、脊柱内或鞘内施用。药学上可接受的载剂包含无菌水溶液、细胞培养基或分散体。这些介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是熟知的。除了任何常规培养基或药剂与桥接因子、多肽、多核苷酸、包括其的载体或基因修饰的免疫效应细胞不相容的情况之外，设想其在药物组合物中的用途。

在特定实施例中，本文所设想的组合物包括经过基因修饰的T细胞和药学上可接受的载剂。本文所设想的包括基于细胞的组合物的组合物可以通过肠内或肠胃外施用方法单独地或与其它适合的化合物组合地施用以实现期望的治疗目的。

在特定实施例中，本文所设想的组合物包括桥接因子和药学上可接受的载剂。

药学上可接受的载剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性以使其适于施用于正在治疗的人类受试者。药学上可接受的载剂应当保持或增加组合物的稳定性。药学上可接受的载剂可以是液体的或固体的并且在考虑计划的施用方式的情况下被选择以在与组合物的其它组分组合时提供期望的体积、一致性等。例如，药学上可接受的载剂可以是但不限于结合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)、填充剂(例如，乳糖和其它糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯、磷酸氢钙等)、润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、硅石、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)、崩解剂(例如，淀粉、羧基乙酸淀粉钠等)或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠等)。用于本文所设想的组合物的其它适合的药学上可接受的载剂包含但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。

此类载剂溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其它适合的添加剂。如本文所使用的，术语“缓冲剂”是指化学成分中和酸或碱而不显著改变pH的溶液或液体。本文所设想的缓冲剂的实例包含但不限于杜尔贝克氏(Dulbecco's)磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏(Ringer's)溶液、5％葡萄糖水溶液(D5W)、正常(normal)/生理(physiologic)盐水(0.9％NaCl)。

药学上可接受的载剂可以存在的量足以使组合物的pH保持处于约7。可替代地，组合物的pH的范围为约6.8至约7.4，例如6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3和7.4。在仍另一个实施例中，组合物的pH为约7.4。

本文所设想的组合物可以包括无毒的药学上可接受的培养基。组合物可以是悬浮液。如本文所使用的，术语“悬浮液”是指细胞未连接到固相支持物的非粘附性条件。例如，可以搅拌或搅动保持为悬浮液的细胞并且所述细胞未粘附到支持物，如培养皿。

在特定实施例中，本文所设想的组合物在悬浮液中调配，其中经过修饰的T细胞分散在静脉注射(IV)袋等中的可接受的液体培养基或溶液例如盐水或无血清培养基内。可接受的稀释剂包含但不限于水、PlasmaLyte、林格氏溶液、等渗氯化钠(盐水)溶液、无血清细胞培养基和适合于低温储存的培养基，例如培养基。

在某些实施例中，药学上可接受的载剂基本上不含人或动物来源的天然蛋白质，并且适合于储存包括经过修饰的T细胞群的组合物。药物组合物旨在施用到人类患者中并且因此基本上不含细胞培养组分，如牛血清白蛋白、马血清和胎牛血清。

在一些实施例中，组合物在药学上可接受的细胞培养基中调配。此类组合物适于施用于人类受试者。在特定实施例中，药学上可接受的细胞培养基是无血清培养基。

无血清培养基相比于含有血清的培养基具有若干优点，包含组合物得到简化且得到更好定义、污染物程度得到减小、可能的传染剂来源得到消除以及成本降低。在各个实施例中，无血清培养基是无动物的并且可以任选地是无蛋白质的。任选地，培养基可以含有生物药学上可接受的重组蛋白。“无动物”培养基是指组合物源自非动物来源的培养基。重组蛋白替代无动物培养基中的天然动物蛋白质，并且营养物从合成的、植物或微生物来源获得。相比之下，“无蛋白质”培养基被定义为基本上不含蛋白质。

特定实施例中使用的无血清培养基的说明性实例包含但不限于QBSF-60(质量生物有限公司(Quality Biological,Inc.))、StemPro-34(生命技术公司(LifeTechnologies))和X-VIVO 10。

在优选实施例中，包括经过修饰的T细胞的组合物在PlasmaLyte中调配。

在各个实施例中，包括经过修饰的T细胞的组合物在冷冻保存培养基中调配。例如，可以使用具有低温保存药剂的低温保存培养基在解冻后保持高细胞存活率结果。特定实施例中使用的低温保存培养基的说明性实例包含但不限于CryoStor CS10、CryoStorCS5和CryoStor CS2。

在一个实施例中，组合物在包括50:50勃脉力A:CryoStor CS10的溶液中调配。

在特定实施例中，组合物基本上不含支原体、内毒素和微生物污染。关于内毒素，“基本上不含”是指每剂细胞的内毒素含量低于FDA针对生物制剂允许的含量，其为每天5EU/kg体重的总内毒素，针对平均70kg的人而言为每总剂量细胞350EU。在特定实施例中，本文所设想的组合物含有约0.5EU/mL到约5.0EU/mL、或约0.5EU/mL、1.0EU/mL、1.5EU/mL、2.0EU/mL、2.5EU/mL、3.0EU/mL、3.5EU/mL、4.0EU/mL、4.5EU/mL或5.0EU/mL。

在特定实施例中，对药学上可接受的载剂溶液的调配对本领域的技术人员来说是熟知的，这和开发用于将本文所描述的特定组合物用于各种治疗方案中的适合的给药和治疗方案一样，包含例如肠内和肠胃外，例如血管内、静脉内、动脉内、骨内、心室内、脑内、颅内、脊柱内、鞘内和髓内施用和调配。本领域技术人员应当理解，本文所设想的特定实施例可以包括如制药领域中熟知并且在例如以下各项中描述的调配物等其它调配物：《雷明顿:药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第I卷和第II卷,第22版,Loyd V.Allen Jr编辑.Philadelphia,PA:医药出版社(PharmaceuticalPress)；2012，所述文献以全文引用的方式并入本文中。

在特定实施例中，组合物包括一定量的表达本文所设想的一种或多种DARIC组分的免疫效应细胞，包含CAR T细胞。如本文所使用的，术语“量”是指包括本文所设想的一种或多种DARIC组分等的用于在存在桥接因子的情况下实现有益或期望的预防或治疗结果(包含临床结果)的“有效量(an amount effective/an amount effective)”的细胞。

“预防有效量”是指包括本文所设想的一种或多种DARIC组分等的对于实现期望的预防结果有效的细胞的量。通常，但不一定，因为预防剂量是在疾病之前或疾病早期用于受试者的，所以预防有效量小于治疗有效量。

“治疗有效量”是指包括本文所设想的一种或多种DARIC组分的在存在桥接因子的情况下对于“治疗”受试者(例如，患者)有效的细胞的量。当指示治疗量时，待施用的组合物、细胞、桥接因子等的精确量可以由内科医生考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染程度或转移程度以及患者(受试者)的病状的个体差异来确定。

通常可以说，包括本文所述的免疫效应细胞的药物组合物可以以10^2至10¹⁰个细胞/kg体重，优选地10^5至10⁶个细胞/kg体重(包含那些范围内的所有整数值)的剂量施用。细胞的数目将取决于组合物的期望最终用途，其中包含的细胞的类型也是如此。对于本文所提供的用途，细胞的体积通常为一升或更少，可以为500mL或更少，甚至250mL或100mL或更少。因此，所期望细胞的密度通常大于10⁶个细胞/mL，并且通常大于10⁷个细胞/mL，通常10⁸个细胞/mL或更大。临床相关数目的免疫细胞可以分配到累积等于或超过10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个或10¹²个细胞的多次输注中。在一些实施例中，特别是因为所有输注的细胞将被重定向到特定的靶抗原，所以可以施用范围在10⁶/千克(每患者10⁶到10¹¹个)的较低数目的细胞。

如果需要，治疗还可以包含施用如本文所描述的有丝***原(例如，PHA)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-18和TNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1α等)以增强免疫应答的诱导。

通常，包括如本文所描述的活化和扩增的细胞的组合物可以用于治疗和预防免疫受损个体中出现的疾病。特别地，本文所设想的组合物用于治疗癌症。在特定实施例中，免疫效应细胞可以单独施用，或作为药物组合物与载剂、稀释剂、赋形剂和/或与如IL-2等其它组分或其它细胞因子或细胞群组合施用。

在特定实施例中，药物组合物包括与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合的一定量的基因修饰的T细胞。

在特定实施例中，药物组合物包括一定量的与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合的桥接因子。

在特定实施例中，组合物包括有效量的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞包括本文所设想的单独或与桥接因子和/或一种或多种治疗剂组合的一种或多种DARIC组分，如放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等。所述组合物还可以与抗生素组合施用。本领域可接受这种治疗剂作为如本文所描述的如特定癌症等特定疾病状态的标准治疗。所设想的示例性治疗剂包含细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂、治疗性抗体或其它活性剂和辅助剂。

在特定实施例中，将包括有效量的包括本文所设想的一种或多种NKG2D DARIC组分的免疫效应细胞的组合物施用于受试者，并且将包括有效量的桥接因子的组合物随后并且任选地重复施用于受试者。

在某些实施例中，包括免疫效应细胞的组合物可以与任何数目的化学治疗剂结合施用，所述免疫效应细胞包括本文所设想的一种或多种NKG2D DARIC组分。化学治疗剂的说明性实例包含：烷化剂，如硫柳汞和环磷酰胺(CYTOXAN^TM)；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；亚乙基亚胺和甲基胺类(methylamelamines)，包含六甲蜜胺、曲他胺、替派、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲密胺(trimethylolomelamine)；氮芥类(nitrogen mustard)，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、依弗酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosurea)，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、卡拉比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-二氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、去甲氧基柔红霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素类、菌酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物类，如甲氨蝶呤和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素类，如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗-肾上腺类，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；百垂布西(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；

雷佐生；西佐喃；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三环乙亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；盖克托辛(gacytosine)；***糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇( 新泽西州普林斯顿百时美施贵宝肿瘤学(Bristol-MyersSquibb Oncology))和多西紫杉醇(

法国安东尼市罗纳普朗克乐安(Rhne-Poulenc Rorer))；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；诺维本；诺安托；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，如Targretin^TM(贝沙罗汀)、Panretin^TM(阿利维A酸)；ONTAK^TM(地尼白细胞介素-毒素连接物)；埃斯波霉素；卡培他滨；以及药学上可接受的盐、酸或以上任一种的衍生物。此定义还包含用于调节或抑制对癌症的激素作用的抗激素剂，如抗***，包含例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基三苯氧胺、曲沃昔芬、雷洛西芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；和抗雄激素类，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及药学上可接受的盐、酸或以上任一种的衍生物。

多种其它治疗剂可以与本文所述的组合物结合使用。在一个实施例中，将包括免疫效应细胞的组合物与抗炎剂一起施用，所述免疫效应细胞包括本文所设想的一种或多种NKG2D DARIC组分。抗炎剂或药物包含但不限于类固醇和糖皮质激素(包含倍他米松、布***、***、醋酸氢化可的松、氢化可的松、氢化可的松、甲基强的松龙、***龙、***、曲安奈德)、包含阿司匹林的非甾体类抗炎药(NSAIDS)、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、抗TNF药物、环磷酰胺和霉酚酸酯。

其它示例性NSAID选自由以下组成的组：布洛芬、萘普生、萘普生钠、如(罗非昔布)和(塞来昔布)等Cox-2抑制剂以及唾液酸盐。示例性镇痛药选自由以下组成的组：对乙酰氨基酚、羟考酮、盐酸丙氧芬的曲马多。示例性糖皮质激素选自由以下组成的组：可的松、***、氢化可的松、甲基强的松龙、***龙或***。示例性生物应答调节剂包含针对细胞表面标志物(例如，CD4、CD5等)的分子、细胞因子抑制剂如TNF拮抗剂(例如，依那西普

)、阿达木单抗 和英夫利昔单抗 趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物应答调节剂包含单克隆抗体以及重组形式的分子。示例性DMARD包含硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、金(口服(金诺芬)和肌内)和米诺环素。

适合与包括本文所设想的一种或多种NKG2D DARIC组分的经过修饰的T细胞进行组合治疗的治疗性抗体的说明性实例包含但不限于阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、可那木单抗(conatumumab)、达雷木单抗(daratumumab)、杜利他单抗(duligotumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛珠单抗(dalotuzumab)、度伐单抗(durvalumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)(HuLuc63)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、因达单抗(indatuximab)、奥妥珠格图单抗(inotuzumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、罗沃单抗(lorvotuzumab)、卢卡珠单抗(lucatumumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、莫西姆单抗(moxetumomab)、纳武单抗(nivolumab)、奥卡鲁单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(siltuximab)、四丙珠单抗(teprotumumab)和乌布妥昔单抗(ublituximab)。

在某些实施例中，本文所述的组合物与细胞因子结合施用。如本文所使用的“细胞因子”是指由一种细胞群释放的蛋白质的通用术语，所述蛋白质作为细胞间介体作用于另一种细胞。这种细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子以及传统的多肤激素。细胞因子中包含生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺氨酸；胰岛素；胰岛素原；松弛肽；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体产生素(LH)；肝细胞生长因子；纤维母细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β；副中肾管抑制物质；小鼠***关连肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板产生素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；***I和***II；促红细胞产生素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素α、干扰素β和干扰素γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；以及粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15，一种肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及其它包含LIF和试剂盒配体(KL)的多肽因子。如本文所使用的，术语细胞因子包含来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。

I.治疗方法

包括本文所设想的NKG2D DARIC受体和/或工程化抗原受体的免疫效应细胞提供了改进的过继性免疫疗法的方法，以用于预防、治疗和改善癌症、GVHD、传染病、自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫缺陷或预防、治疗或改善与其相关的至少一种症状。

包括DARIC信号传导组分、NKG2D DARIC结合组分和结合B7-H3、BMCA、CD19、CD20、CD22、CD33、CD79A、CD79B、EGFR或EGFRvIII的另一种DARIC结合组分的免疫效应细胞提供了改进的过继性免疫疗法的方法以用于预防、治疗和改善癌症、GVHD、传染病、自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫缺陷或预防、治疗或改善与其相关的至少一种症状。

在特定实施例中，包括NKG2D DARIC受体的免疫效应细胞提供改进的过继性免疫疗法的方法以在降低中靶抗原、脱靶细胞毒性的风险(识别正常非靶细胞上的靶抗原)的同时微调针对表达靶抗原的靶细胞(例如，肿瘤细胞)的细胞毒性应答的安全性和功效。

在具体实施例中，预防、治疗或改善癌症、GVHD、传染病、自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫缺陷的至少一种症状的方法包括向受试者施用有效量的包括NKG2D DARIC受体的一种或多种组分和另一种DARIC结合组分、工程化TCR、CAR或其它治疗性转基因的经过修饰的免疫效应细胞或T细胞以将细胞重定向到靶细胞。通过转导可化学调节的免疫刺激信号，经过基因修饰的细胞是更有效且安全的细胞免疫疗法。

在特定实施例中，对一种或多种免疫效应细胞(例如，T细胞)进行修饰以表达NKG2D DARIC结合组分和NKG2D DARIC信号传导组分两者。在这种情况下，向有需要的受试者施用经过修饰的细胞，并且通过在免疫效应细胞上表达的NKG2D结合组分与在靶细胞上表达的靶抗原的相互作用使其归巢到靶细胞。在已经向受试者施用经过修饰的细胞之前、与向受试者施用经过修饰的细胞几乎相同的时间或已经向受试者施用经过修饰的细胞之后，向受试者施用桥接因子。在存在桥接因子的情况下，三元复合物形成于NKG2D DARIC抗原组分、桥接因子与NKG2D DARIC信号传导组分之间。在形成三元复合物之后，NKG2D DARIC受体将免疫刺激信号转导到免疫效应细胞，所述免疫效应细胞进而引发来自免疫效应细胞的针对靶细胞的细胞毒性应答。

在特定实施例中，对一种或多种免疫效应细胞(例如，T细胞)进行修饰以表达NKG2D DARIC信号传导组分。在这种情况下，向有需要的受试者施用经过修饰的细胞。在已经向受试者施用经过修饰的细胞之前、与向受试者施用经过修饰的细胞几乎相同的时间或已经向受试者施用经过修饰的细胞之后，向受试者施用NKG2D DARIC结合组分。另外，可以通过以下方式向受试者施用NKG2D DARIC结合组分：在与桥接因子的预成型复合物中；与桥接因子相同的时间，但是在单独的组合物中；或在与桥接因子不同的时间。在存在或不存在桥接因子的情况下，NKG2D结合组分结合在靶细胞上表达的靶抗原。在存在桥接因子的情况下，三元复合物形成于NKG2D DARIC抗原组分、桥接因子与NKG2D DARIC信号传导组分之间。在形成三元复合物之后，NKG2D DARIC受体将免疫刺激信号转导到免疫效应细胞，所述免疫效应细胞进而引发来自免疫效应细胞的针对靶细胞的细胞毒性应答。

在各个实施例中，包括NKG2D DARIC受体和/或另一种DARIC结合组分或工程化抗原受体的免疫效应细胞使用双靶向策略微调针对靶细胞的细胞毒性应答的安全性和功效，其中一个或多个靶细胞表达被第二DARIC结合组分或工程化抗原受体识别的一种或多种靶抗原和被NKG2D DARIC受体识别的一种或多种NKG2D配体。

在特定实施例中，对一种或多种免疫效应细胞(例如，T细胞)进行修饰以表达NKG2D DARIC结合组分和NKG2D DARIC信号传导组分两者以及第二DARIC结合组分或工程化抗原受体(例如，CAR)。在这种情况下，向有需要的受试者施用经过修饰的细胞，并且通过均在免疫效应细胞上表达的NKG2D结合组分和第二DARIC结合组分或CAR两者与在靶细胞上表达的靶抗原的相互作用使其归巢到靶细胞。CAR与靶细胞上的靶抗原的相互作用可以引发来自免疫效应细胞的针对靶细胞的细胞毒性应答。在已经向受试者施用经过修饰的细胞之前、与向受试者施用经过修饰的细胞几乎相同的时间或已经向受试者施用经过修饰的细胞之后，向受试者施用桥接因子。在存在桥接因子的情况下，三元复合物形成于NKG2D DARIC抗原组分或第二DARIC结合组分、桥接因子与NKG2D DARIC信号传导组分之间。在形成三元复合物之后，NKG2D DARIC受体将免疫刺激信号转导到免疫效应细胞，所述免疫效应细胞进而引发或加强来自免疫效应细胞的针对靶细胞的细胞毒性应答。在特定实施例中，可以在缓解或消退不完整并且病状复发或变得难治的情况下诱导NKG2D DARIC受体活化。

在特定实施例中，对一种或多种免疫效应细胞(例如，T细胞)进行修饰以表达NKG2D DARIC信号传导组分。在这种情况下，向有需要的受试者施用经过修饰的细胞。在已经向受试者施用经过修饰的细胞之前、与向受试者施用经过修饰的细胞几乎相同的时间或已经向受试者施用经过修饰的细胞之后，向受试者施用NKG2D DARIC结合组分。另外，可以通过以下方式向受试者施用NKG2D DARIC结合组分和任选地第二DARIC结合组分：在与桥接因子的预成型复合物中；与桥接因子相同的时间，但是在单独的组合物中；或在与桥接因子不同的时间。在存在或不存在桥接因子的情况下，NKG2D结合组分和任选地第二DARIC结合组分结合在靶细胞上表达的靶抗原。在存在桥接因子的情况下，三元复合物形成于NKG2DDARIC抗原组分和/或第二DARIC结合组分(如果存在的话)、以及桥接因子与NKG2D DARIC信号传导组分之间。在形成三元复合物之后，NKG2D DARIC受体将免疫刺激信号转导到免疫效应细胞，所述免疫效应细胞进而引发来自免疫效应细胞的针对靶细胞的细胞毒性应答。在特定实施例中，可以在缓解或消退不完整并且病状复发或变得难治的情况下诱导NKG2DDARIC受体活化。

在特定优选的实施例中，通过用一种或多种NKG2D DARIC组分对T细胞(例如，原代T细胞)进行基因修饰，将原代T细胞的特异性重定向到表达一种或多种NKGD2配体的肿瘤细胞或癌细胞。

在特定优选的实施例中，通过用一种或多种NKG2D DARIC组分和第二DARIC结合组分或被定向到靶抗原的工程化抗原受体对T细胞(例如，原代T细胞)进行基因修饰，将原代T细胞的特异性重定向到表达靶抗原和一种或多种NKGD2配体的肿瘤细胞或癌细胞。

在特定实施例中，本文所设想的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗实体瘤或癌症。

在特定实施例中，本文所设想的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗实体瘤或癌症，包含但不限于：肾上腺癌、肾上腺皮质癌、***癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/CNS癌、乳腺癌、支气管肿瘤、心脏肿瘤、***、胆管癌、软骨肉瘤、脊索瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、原位导管癌(DCIS)子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、眼癌、输卵管癌、纤维组织肉瘤、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、头颈癌、血管母细胞瘤、肝细胞癌、下咽癌、眼内黑色素瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、平滑肌肉瘤、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、肺类癌、恶性间皮瘤、髓样癌、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、中线癌、口腔癌、粘膜肉瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、少突神经胶质瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰岛细胞肿瘤、***状癌、副神经节瘤、甲状旁腺癌、***癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、***癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、小肠癌、胃癌、汗腺癌、滑膜瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌，尿道癌症、子宫癌、子宫肉瘤、***癌、血管癌、外阴癌和威尔姆斯肿瘤。

在特定实施例中，本文所设想的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗实体瘤或癌症，包含但不限于肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、骨癌、甲状腺癌、肾癌或皮肤癌。

在特定实施例中，本文所设想的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗各种癌症，包含但不限于胰腺癌、膀胱癌和肺癌。

在特定实施例中，本文所设想的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗液体癌或血液癌。

在特定实施例中，本文所设想的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗B细胞恶性肿瘤，包含但不限于：白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

在特定实施例中，本文所设想的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗液体癌，包含但不限于白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病、毛细胞白血病(HCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性粒细胞白血病(CML)、慢性髓单核细胞白血病(CMML)和真性红细胞增多症、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、塞扎里氏综合征(Sézary syndrome)、前体T淋巴母细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、明显多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨的孤立性浆细胞瘤以及髓外浆细胞瘤。

在本文所设想的方法中使用的优选细胞包含自体(autologous/autogeneic)(“自我”)细胞、优选地造血细胞、更优选地T细胞以及更优选地免疫效应细胞。

在特定实施例中，方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的表达一种或多种NKG2D DARIC组分和任选地第二DARIC结合组分或工程化抗原受体的经过修饰的免疫效应细胞或包括其的组合物，并且还向受试者施用桥接因子。在某些实施例中，细胞用于治疗处于患有癌症、GVHD、传染病、自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫缺陷风险的患者。因此，特定实施例包括治疗或预防癌症、传染病、自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫缺陷或改善其的至少一种症状，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所设想的经过修饰的免疫效应细胞和桥接因子。

在特定实施例中，方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的表达NKG2D DARIC信号传导组分和任选地工程化抗原受体的经过修饰的免疫效应细胞或包括其的组合物，并且还向受试者施用NKG2D DARIC结合组分和任选地第二DARIC结合组分和桥接因子，任选地其中所述NKG2D DARIC结合组分和/或第二结合组分在施用之前与桥接因子结合。在某些实施例中，细胞用于治疗处于患有癌症、GVHD、传染病、自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫缺陷风险的患者。因此，特定实施例包括治疗或预防癌症、传染病、自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫缺陷或改善其的至少一种症状，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所设想的经过修饰的免疫效应细胞、NKG2D DARIC结合组分和桥接因子。

施用经过修饰的免疫效应细胞、NKG2D DARIC结合组分和/或桥接因子的数量和频率将由如患者的病状以及患者的疾病的类型和严重性等因素确定，即使适当的剂量和剂量时间表可以通过临床试验确定。

在一个说明性实施例中，提供给受试者的有效量的经过修饰的免疫效应细胞为至少2×10⁶个细胞/kg、至少3×10⁶个细胞/kg、至少4×10⁶个细胞/kg、至少5×10⁶个细胞/kg、至少6×10⁶个细胞/kg、至少7×10⁶个细胞/kg、至少8×10⁶个细胞/kg、至少9×10⁶个细胞/kg、或至少10×10⁶个细胞/kg或更多个细胞/kg，包含所有中间剂量的细胞。

在另一个说明性实施例中，提供给受试者的有效量的经过修饰的免疫效应细胞为约2×10⁶个细胞/kg、约3×10⁶个细胞/kg、约4×10⁶个细胞/kg、约5×10⁶个细胞/kg、约6×10⁶个细胞/kg、约7×10⁶个细胞/kg、约8×10⁶个细胞/kg、约9×10⁶个细胞/kg、或约10×10⁶个细胞/kg或更多个细胞/kg，包含所有中间剂量的细胞。

在另一个说明性实施例中，提供给受试者的有效量的经过修饰的免疫效应细胞为约2×10⁶个细胞/kg到约10×10⁶个细胞/kg、约3×10⁶个细胞/kg到约10×10⁶个细胞/kg、约4×10⁶个细胞/kg到约10×10⁶个细胞/kg、约5×10⁶个细胞/kg到约10×10⁶个细胞/kg、2×10⁶个细胞/kg到约6×10⁶个细胞/kg、2×10⁶个细胞/kg到约7×10⁶个细胞/kg、2×10⁶个细胞/kg到约8×10⁶个细胞/kg、3×10⁶个细胞/kg到约6×10⁶个细胞/kg、3×10⁶个细胞/kg到约7×10⁶个细胞/kg、3×10⁶个细胞/kg到约8×10⁶个细胞/kg、4×10⁶个细胞/kg到约6×10⁶个细胞/kg、4×10⁶个细胞/kg到约7×10⁶个细胞/kg、4×10⁶个细胞/kg到约8×10⁶个细胞/kg、5×10⁶个细胞/kg到约6×10⁶个细胞/kg、5×10⁶个细胞/kg到约7×10⁶个细胞/kg、5×10⁶个细胞/kg到约8×10⁶个细胞/kg或6×10⁶个细胞/kg到约8×10⁶个细胞/kg，包含所有中间剂量的细胞。

本领域普通技术人员将认识到，可能需要多次施用特定实施例中设想的组合物以实现期望的疗法。例如，组合物可以在1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、5年、10年或更长时间的跨度内施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次或更多次。经过修饰的免疫效应细胞、DARIC组分和桥接因子可以通过以下方式施用：在同一或不同组合物中；同时在一种或多种组合物中；或在不同的时间在多于一种组合物中。经过修饰的免疫效应细胞、DARIC组分和桥接因子可以通过相同的施用途径或不同途径施用。

在某些实施例中，可能希望向受试者施用活化的T细胞，并且随后重新抽血(或进行单采血液成分术)、从中活化T细胞并且向患者重新输注这些活化的和扩增的T细胞。可以每隔几周进行多次此过程。在某些实施例中，可以抽取10cc到400cc的血来活化T细胞。在某些实施例中，抽取20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc或400cc或更多量的血来活化T细胞。不受理论束缚，使用此多次抽血/多次重新输注方案可以用于选出某些T细胞群。

在一个实施例中，治疗诊断患有癌症的受试者的方法包括：从受试者中除去免疫效应细胞；通过将对一种或多种NKG2D DARIC组分进行编码的一种或多种载体引入到细胞中来修饰免疫效应细胞并且产生经过修饰的免疫效应细胞群；以及向同一受试者施用经过修饰的免疫效应细胞群。在优选实施例中，免疫效应细胞包括T细胞。

在一个实施例中，治疗诊断患有癌症的受试者的方法包括：从受试者中除去免疫效应细胞；通过将对一种或多种NKG2D DARIC组分和第二DARIC结合组分或工程化抗原受体进行编码的一种或多种载体引入到细胞中来修饰免疫效应细胞并且产生经过修饰的免疫效应细胞群；以及向同一受试者施用经过修饰的免疫效应细胞群。在优选实施例中，免疫效应细胞包括T细胞。

用于施用特定实施例中所设想的细胞组合物的方法包含任何有效导致重新引入经过离体修饰的免疫效应细胞或重新引入免疫效应细胞的经过修饰的祖细胞的方法，所述免疫效应细胞在引入受试者时分化为成熟免疫效应细胞。一种方法包括通过引入对一种或多种NKG2D DARIC组分和第二DARIC结合组分或工程化抗原受体进行编码的一种或多种载体并且将转导的细胞返回到受试者来离体修饰外周血T细胞。

用于施用特定实施例中所设想的细胞组合物的方法包含任何有效导致重新引入经过离体修饰的免疫效应细胞或重新引入免疫效应细胞的经过修饰的祖细胞的方法，所述免疫效应细胞在引入受试者时分化为成熟免疫效应细胞。一种方法包括通过引入对一种或多种NKG2D DARIC组分进行编码的一种或多种载体并且将转导的细胞返回到受试者来离体修饰外周血T细胞。

本说明书中引用的所有出版物、专利申请和经发布专利通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或经发布专利具体地且单独地指示通过引用并入一样。

尽管已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式稍为详细地描述了前述实施例，但是根据本文设想的教导，本领域的普通技术人员将容易清楚的是，可以在不脱离随附权利要求的精神或范围的情况下对其进行某些改变和修改。仅通过说明的方式而不是通过限制的方式提供以下实例。本领域技术人员将容易认识到可以在特定实施例中被改变或修改以产生本质上类似的结果的各种非关键参数。

实例

实例1

NKG2D DARIC T细胞展现出抗肿瘤应答

设计、构建并且验证NKG2D DARIC结合组分和信号传导组分。构建NKG2D DARIC慢病毒载体，所述慢病毒载体包括可操作地连接到对以下进行编码的多核苷酸的MNDU3启动子：DARIC信令组分(CD8α信号肽、FRB变体(T82L)、CD8α跨膜结构域、细胞内4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域)；P2A序列；以及DARIC结合组分(Igκ信号肽、NKG2D配体结合结构域、G4S接头、FKBP12结构域和具有截短的细胞内结构域的CD4源性跨膜结构域)。用NKG2DDARIC慢病毒载体转导的T细胞表达图1中所示的膜结合多肽。参见例如SEQ ID NO:1-5。

在存在/不存在1nM雷帕霉素的情况下，通过以5:1的效应子:靶标(E:T)比率将T细胞与表达NKG2D配体(MICA、ULBP1和ULBP2/5/6)、BCMA和GFP(K562-BCMA-GFP)的K562细胞一起培养来分析NKG2D DARIC T细胞的细胞毒性潜力，图2。

用对抗BCMA CAR或NKG2D DARIC进行编码的LVV转导来自3个供体的T细胞。在存在或不存在雷帕霉素的情况下，以5:1的E:T比率将经过转导的T细胞与K562-BCMA-GFP细胞共培养。在存在或不存在雷帕霉素的情况下，抗BCMA CAR T细胞引发针对K562-BCMA-GFP细胞的细胞毒性。相比之下，只有在存在雷帕霉素的情况下，NKG2D DARIC T细胞才会引发针对K562-BCMA-GFP细胞的细胞毒性，图3。

用对抗BCMA CAR、NKG2D CAR或NKG2D DARIC进行编码的LVV转导T细胞。在存在或不存在雷帕霉素的情况下，以1:1的E:T比率将经过转导的T细胞与K562-BCMA-GFP细胞共培养24小时。在存在或不存在雷帕霉素的情况下，抗BCMA CAR T细胞在与K562-BCMA-GFP靶细胞一起培养时诱导细胞因子表达。相比之下，只有在存在雷帕霉素的情况下，NKG2D DARICT细胞才会在与K562-BCMA-GFP靶细胞一起培养时诱导细胞因子表达，图4。

实例2

NKG2D DARIC T细胞细胞因子表达可以被抗NKG2D阻断抗体(1D11)阻断

用对NKG2D DARIC或抗EGFR CAR进行编码的LVV转导T细胞。在存在和不存在1nM雷帕霉素和5μg/mL抗NKG2D阻断抗体(1D11)的情况下，以1:1的E:T比率将经过转导的T细胞与结肠癌细胞系HCT116(表达NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2/5/6和ULBP3；图5)一起培养。

在不存在抗NKG2D阻断抗体的情况下，抗EGFR CAR T细胞在存在或不存在雷帕霉素的情况下在与HCT116靶细胞一起培养时诱导细胞因子表达，而NKG2D DARIC T细胞在存在雷帕霉素的情况下在与HCT116靶细胞一起培养时诱导细胞因子表达，图6，左图。在存在抗NKG2D阻断抗体的情况下，抗EGFR CAR T细胞在存在或不存在雷帕霉素的情况下在与HCT116靶细胞一起培养时仍诱导细胞因子表达，而抗NKG2D阻断抗体的存在显著减少或消除细胞因子表达的NKG2D DARIC T细胞诱导，图6，右图。

实例3

NKG2D DARIC T细胞展现出雷帕霉素依赖性抗肿瘤应答

用对NKG2D DARIC或抗EGFR CAR进行编码的LVV转导来自多个供体的T细胞。在存在和不存在1nM雷帕霉素的情况下，以10:1的E:T比率将经过转导的T细胞与肺癌细胞系A549(表达NKG2D配体MICA、ULBP1和ULBP2/5/6；图7)一起培养。在存在和不存在雷帕霉素的情况下，抗EGFR CAR T细胞引发针对A549细胞的细胞毒性。相比之下，只有在存在雷帕霉素的情况下，NKG2D DARIC T细胞才会引发针对A549细胞的细胞毒性，图8。

用对NKG2D DARIC或抗CD19 CAR、抗BCMA CAR或抗EGFR CAR进行编码的LVV转导T细胞。在存在或不存在雷帕霉素的情况下，以1:1的E:T比率将经过转导的T细胞与表达细胞系NALM-6、RPMI-8226和A549(图7)的NKG2D配体共培养24小时。在存在和不存在雷帕霉素的情况下，抗CD19 CAR T细胞(与Nalm-6细胞一起培养)、抗BCMA CAR T细胞(与RPMI-8226细胞一起培养)和抗EGFR CAR T细胞(与A549细胞一起培养)诱导IFNγ表达。相比之下，只有在存在雷帕霉素的情况下，NKG2D DARIC T细胞才会在与靶细胞一起培养时诱导IFNγ表达，图9。

实例4

NKG2D DARIC T细胞离体正常扩增

设计、构建并且验证包括可操作地连接到对组成型活性NKG2D CAR和GFP(chNKGD2-GFP)进行编码的多核苷酸的MNDU3启动子的慢病毒载体。chNKG2D-GFP慢病毒载体对全长NKG2D序列、CD3ζ的信号传导结构域、P2A序列和GFP进行编码。

在第0天使用可溶的抗CD3抗体和抗CD28抗体(50ng/mL)活化人PBMC(1×10⁶细胞/mL)。在温育24小时之后，用对抗EGFR-CAR、chNKG2D-GFP或NKG2D DARIC进行编码的LVV转导1×10⁶个细胞。包含另外的未经转导的样品作为对照(UTD)。在第3天按0.3×10⁶个细胞/mL洗涤并重新悬浮细胞。将细胞在含有IL-2(250IU/mL)的T细胞生长培养基中培养以扩增另外7天。培养基每隔一天进行更换。

每次培养基交换时，对细胞进行计数并使其***到所限定的密度。在10天的扩增期之后，使用CD4和CD8抗体染色对T细胞进行计数和表型分型。

未经转导的对照T细胞、抗EGFR CAR T细胞和NKG2D DARIC T细胞显示出可比较的扩增水平；而chNKG2D-GFP T细胞则示出大大降低的扩增速率，图10B。UTD和NKG2D DARIC T细胞具有类似的CD4 T细胞:CD8 T细胞比率；而chNKG2D-GFP T细胞则主要是CD8⁺，图10C。这些结果表明，即使在T细胞的表面上存在NKG2D配体表达的情况下，NKG2D DARIC架构也能够正常扩增和生长。

以1:1的效应子:靶标比率(E:T)将未经转导的对照T细胞、抗EGFR CAR T、chNKG2DT细胞和NKG2D DARIC T细胞与EGFR⁺NKG2DL⁺A549细胞共培养。在存在或不存在AP21967的情况下，chNKG2D-GFP T细胞和抗EGFR CAR T细胞两者都可以杀死A549细胞，图11A。在存在AP21967的情况下，NKG2D DARIC T细胞只杀死A549细胞。同上。

为了分析细胞因子产生，以1:1的E:T比率在存在或不存在AP21967的情况下将经过慢病毒转导的或未经转导的对照T细胞与EGFR⁺NKG2DL⁺A549肿瘤细胞共培养24小时。使用Qbead PlexScreen细胞因子测定试剂盒分析细胞因子产生。抗EGFR CAR T细胞在存在和不存在AP21967的情况下产生相对较高量的IFNγ，NKG2D DARIC T细胞在存在AP21967的情况下只产生IFNγ，并且chNKG2D T细胞在存在或不存在AP21967的情况下产生可忽略量的IFNγ，图11B。

实例5

NKG2D DARIC跨膜结构域可以促进表达

设计、构建并且验证包括可操作地连接到对以下进行编码的多核苷酸的MNDU3启动子的慢病毒载体：CD8α源性信号肽、FRB变体(T82L)、CD8α源性跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域；P2A序列；Igκ源性信号肽、NKG2D胞外域、FKBP12结构域和AMN源性跨膜结构域(NKG2D DARIC-AMN)。

如实例4中所描述的，对人PBMC进行活化、转导和扩增。UTD T细胞、NKG2D DARIC T细胞和NKG2D DARIC-AMN T细胞显示出类似的离体扩增速率，图12A。用抗NKG2D抗体对T细胞进行染色，并在CD4⁺T细胞上对DARIC结合组分表达进行定量。与NKG2D DARIC(CD4跨膜结构域)表达相比，NKG2D DARIC-AMN表达更高，图12B。

以1:1的比率将UTD T细胞、NKG2D DARIC T细胞和NKG2D DARIC-AMN T细胞与NKG2DL⁺A549细胞共培养，并且通过Qbead PlexScreen分析细胞因子产生。在存在雷帕霉素的情况下，NKG2D DARIC和NKG2D DARIC-AMN T细胞只展现出稳健的细胞因子产生，图12C。与含有CD4跨膜结构域的NKG2D DARIC T细胞相比，NKG2D DARIC-AMN T细胞展现出较低的细胞因子产生。

实例6

NKG2D定位强烈影响NKG2D DARIC活性

设计、构建并且验证各种NKG2D DARIC架构的慢病毒载体，图13A。BW2763包括可操作地连接到对以下进行编码的多核苷酸的MNDU3启动子：CD8α源性信号肽、FRB变体(T82L)多肽、NKG2D源性跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域；P2A序列；Igκ源性信号肽、NKG2D胞外域、FKBP12结构域以及CD4跨膜和截短的细胞内结构域。BW2764包括可操作地连接到对以下进行编码的多核苷酸的MNDU3启动子：CD8α源性信号肽、NKG2D胞外域、nFKBP12结构域、CD4跨膜结构域；P2A序列；CD3ζ信号传导结构域、NKG2D细胞内和跨膜结构域以及FRB变体(T82L)多肽。

如实例4中所描述的，对人PBMC进行活化、转导和扩增。用抗NKG2D抗体对UTD T细胞、NKG2D DARIC T细胞以及用BW2763或BW2764转导的T细胞进行染色，并在CD4⁺T细胞上对DARIC结合组分表达进行定量。引入NKG2D跨膜结构域(BW2763)或转换NKG2D DARIC(BW2764)的朝向产生如通过NKG2D⁺细胞的NKG2D⁺％和MFI确定的类似的NKG2D表达，图13B。

以1:1的比率将UTD T细胞、NKG2D DARIC T细胞以及用BW2763或BW2764转导的T细胞与NKG2DL⁺A549细胞共培养，并且通过Qbead PlexScreen分析细胞因子产生。NKG2DDARIC T细胞在存在雷帕霉素的情况下只产生IFNγ，而用BW2763或BW2764转导的T细胞在存在或不存在雷帕霉素的情况下都产生非常低的细胞因子水平，图13C。

实例7

含有共刺激结构域的NKG2D DARIC结合组分

设计、构建并且验证包括具有包括各种共刺激信号传导结构域的DARIC结合组分的NKG2D DARIC的慢病毒载体，例如SEQ ID NO:6-9，图14A。从TNFR2、OX40、CD27、HVEM(TNFRS14)、GITR(TNFRS18)和DR3(TNFRS25)蛋白获得共刺激结构域。

如实例4中所描述的，对人PBMC进行活化、转导和扩增。UTD T细胞、NKG2D DARIC T细胞、NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞、NKG2D.OX40 DARIC T细胞、NKG2D.CD27 DARIC T细胞、NKG2D.HVEM DARIC T细胞、NKG2D.DR3 DARIC T细胞和NKG2D.GITR DARIC T细胞显示出类似的离体扩增速率，图14B。用抗NKG2D抗体对T细胞进行染色，并在CD4⁺T细胞上对DARIC结合组分表达进行定量。表达在不同的NKG2D DARIC结合组分之间是相当的，图14C。总之，数据表明，包括共刺激结构域的DARIC结合组分没有改变离体T细胞扩增或表达。

在存在或不存在雷帕霉素的情况下，以1:1的E:T比率将UTD T细胞、NKG2D DARICT细胞、NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞、NKG2D.OX40 DARIC T细胞、NKG2D.CD27 DARIC T细胞、NKG2D.HVEM DARIC T细胞、NKG2D.DR3 DARIC T细胞和NKG2D.GITR DARIC T细胞与NKG2DL⁺HCT116细胞共培养24小时，并且通过Qbead PlexScreen分析细胞因子产生。当在存在雷帕霉素的情况下将T细胞与肿瘤细胞一起培养时，包括共刺激结构域的DARIC结合结构域始终增强细胞因子产生，图14D。在不存在雷帕霉素或NKG2DL⁺A549细胞的情况下，所有T细胞样品产生可忽略量的细胞因子。与表达其它共刺激结构域的DARIC结合组分相比，NKG2D.TNFR2 DARIC架构产生提高的细胞因子水平。同上。

实例8

NKG2D DARIC.TNFR T细胞对雷帕霉素介导的免疫抑制具有抗性

如实例4中所描述的，对人PBMC进行活化、转导和扩增。在媒剂、雷帕霉素或非免疫抑制雷帕霉素类似物AP21967中，以1:1的比率将抗EGFR CAR T细胞、NKG2D DARIC T细胞、NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞和NKG2D.OX40 DARIC T细胞与NKG2DL⁺A549细胞或NKG2DL⁺HT1080细胞共培养。

当在不存在二聚化药物的情况下与肿瘤细胞共培养时，NKG2D DARIC T细胞没有产生细胞因子，图15A和15B。当NKG2D DARIC T细胞在存在雷帕霉素和AP21967的情况下与肿瘤细胞共培养时，存在稳健的细胞因子产生。同上。如所期望的，添加雷帕霉素使得T细胞活化受到抑制并且来自抗EGFR CAR T细胞的细胞因子产生减少。同上。当对雷帕霉素和AP21967共培养物中的细胞因子产生进行比较时，观察到NKG2D DARIC T细胞和NKG2D.OX40DARIC T细胞的免疫抑制作用类似。出乎意料的是，当在雷帕霉素中培养时，NKG2D.TNFR2DARIC T细胞对免疫抑制具有抗性。在一些情况下，与AP21967相比，在存在雷帕霉素的情况下共培养的NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞中存在甚至更高的细胞因子产生。同上。

使用AP21967:雷帕霉素的比率将细胞因子产生数据归一化，图15C。使用比率分析，雷帕霉素介导的免疫抑制产生大于1的值，而小于1的值表明雷帕霉素治疗对T细胞活化具有中性或协同效应。抗EGFR CAR T细胞、NKG2D DARIC T细胞和NKG2D.OX40 DARIC T细胞的A549介导的细胞因子产生和HT1080介导的细胞因子产生两者的比率都大于1。同上。相比之下，对于所有细胞因子和所有靶细胞系，NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞的比率远远低于1。这些数据表明，包含TNFR2共刺激结构域可以部分地缓解NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞中的雷帕霉素介导的免疫抑制。

实例9

具有两个共刺激结构域的NKG2D DARIC结合组分

设计、构建并且验证对包括单或双共刺激信号传导结构域的NKG2D DARIC结合组分进行编码的慢病毒载体，图16A。从CD28、DAP10、OX40或这些结构域的组合获得用于在这个实例中使用的DARIC结合组分的共刺激结构域。

如实例4中所描述的，对人PBMC进行活化、转导和扩增。抗EGFR CAR T细胞、NKG2DDARIC T细胞、NKG2D.DAP10 DARIC T细胞、NKG2D.CD28 DARIC T细胞、NKG2D.CD28.DAP10DARIC T细胞、NKG2D.DAP10.OX40 DARIC T细胞和NKG2D.OX40.DAP10 DARIC T细胞显示出类似的离体扩增速率，并且NKG2D DARIC的表达水平与亲本NKG2D DARIC相比是相当的。

在存在或不存在雷帕霉素的情况下，以1:1的E:T比率将抗EGFR CAR T细胞、NKG2DDARIC T细胞、NKG2D.DAP10 DARIC T细胞、NKG2D.CD28 DARIC T细胞、NKG2D.CD28.DAP10DARIC T细胞、NKG2D.DAP10.OX40 DARIC T细胞和NKG2D.OX40.DAP10 DARIC T细胞与NKG2DL⁺A549细胞共培养24小时，并且通过Qbead PlexScreen分析细胞因子产生。包括CD28共刺激结构域、DAP10共刺激结构域或CD28共刺激结构域和DAP10共刺激结构域的DARIC结合组分对细胞因子产生具有最小的影响，图16B。另外，在具有或不具有OX40共刺激结构域的情况下(在任一朝向上)，包括DAP10共刺激结构域的DARIC结合组分没有使得细胞因子产生改变，图16C。

实例10

包括ICOS结构域的NKG2D DARIC

设计、构建并且验证对包括ICOS跨膜结构域和/或共刺激结构域的NKG2D DARIC架构进行编码的慢病毒载体，图17A。DmrA是FKBP12；DmrB是FKBP12 F36V；并且DmrC是FRB(2021-2113)T2098L。

如实例4中所描述的，对人PBMC进行活化、转导和扩增。使用抗EGFR CAR T细胞、NKG2D DARIC T细胞作为对照。各个DARIC T细胞组显示出类似的离体扩增速率、类似的CD4:CD8比率，并且其表达水平与亲本NKG2D DARIC相比是相当的。

在存在或不存在AP21967的情况下，以1:1的E:T比率将抗EGFR CAR T细胞和DARICT细胞与NKG2DL⁺A549细胞共培养24小时，并且通过Qbead PlexScreen分析细胞因子产生。包括单独的或与DAP10组合的ICOS跨膜结构域或共刺激结构域的DARIC结合组分对细胞因子产生具有最小的影响。相比之下，与NKG2D DARIC对照T细胞相比，包括ICOS跨膜结构域或共刺激结构域的DARIC信号传导组分显著减少细胞因子产生，图17B和图17C。

实例11

双靶向DARIC平台

设计、构建并且验证包括DARIC信号传导组分(FRB T2098L-CD8αTM-CD137-CD3ζ)、NKG2D.TNFR2 DARIC结合组分和CD19 DARIC结合组分(抗CD19 scFV-FKBP12-CD4 TM)的慢病毒载体，图18A。

如实例4中所描述的，对人PBMC进行活化、转导和扩增。用抗NKG2D抗体或重组CD19-Fc蛋白对UTD T细胞、NKG2D.TNFR2 DARIC T细胞、CD19 DARIC T细胞和NKG2D/CD19DARIC双靶向T细胞进行染色。NKG2D DARIC结合组分和CD19 DARIC结合组分在DARIC单靶向T细胞和DARIC双靶向T细胞两者中具有类似的表达水平，图18B和18C。

在具有或不具有AP21967的情况下，以1:1的E:T比率将UTD T细胞、NKG2D.TNFR2DARIC T细胞、CD19 DARIC T细胞和NKG2D/CD19 DARIC双靶向细胞与NKG2DL⁺A549细胞、NKG2DL^neg小鼠B细胞系A20和稳定表达CD19(A20-hCD19)的A20细胞共培养24小时。使用Qbead测定试剂盒从培养上清液测量细胞因子产生。在不存在AP21967或雷帕霉素的情况下，观察到可忽略的细胞因子产生。当与A549细胞和A20-CD19细胞两者一起培养时，NKG2D/CD19-DARIC双靶向T细胞产生GM-CSF。当与表达同源配体的靶细胞共培养时，NKG2D.TNFR2DARIC T细胞和CD19 DARIC T细胞产生细胞因子，图18D。

通常，在以下权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中所公开的具体实施例，而是应被解释为包含所有可能的实施例连同这种权利要求所要求的等效物的全部范围。因此，权利要求不受本公开的限制。

序列表

<110> 蓝鸟生物公司（bluebird bio, Inc.）

Leung, Wai-Hang

Jarjour, Jordan

<120> NKG2D DARIC受体

<130> BLBD-091/02WO 315698-2770

<150> US 62/730,926

<151> 2018-09-13

<150> US 62/598,902

<151> 2017-12-14

<160> 48

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 302

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的FRB T2098L-CD8aTM-CD137-CD3z NKG2D DARIC信号传导组分

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu

20 25 30

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35 40 45

Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Thr Met His Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

145 150 155 160

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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<210> 2

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的FRB T2098L-CD8aTM-CD137-CD3z NKG2D DARIC信号传导组分

<400> 2

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100 105 110

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130 135 140

Thr Met His Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

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Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

165 170 175

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245 250 255

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290 295 300

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Asn Pro Gly

<210> 3

<211> 303

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的NKG2D-FKBP12-CD4TM NKG2D DARIC结合组分

<400> 3

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Ser Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe

165 170 175

Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu

180 185 190

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245 250 255

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260 265 270

Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly

275 280 285

Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln

290 295 300

<210> 4

<211> 301

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的NKG2D-FKBP12-CD4TM NKG2D DARIC结合组分

<400> 4

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser

20 25 30

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50 55 60

Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp

65 70 75 80

Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val

85 90 95

His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu

100 105 110

Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala

115 120 125

Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro

130 135 140

Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly

145 150 155 160

Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys

165 170 175

Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly

180 185 190

Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met

195 200 205

Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln

210 215 220

Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala

225 230 235 240

Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu

245 250 255

Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Arg Met Ala Leu

260 265 270

Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly

275 280 285

Ile Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln

290 295 300

<210> 5

<211> 626

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括由病毒P2A结构域分隔的NKG2D DARIC结合组分和NKG2D DARIC

信号传导组分的合成的NKG2D DARIC多蛋白

<400> 5

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu

20 25 30

Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys

35 40 45

Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly

50 55 60

Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp

65 70 75 80

Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn

85 90 95

Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg

100 105 110

Arg Ile Ser Lys Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ser Asp Ile Tyr Ile Trp

115 120 125

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

130 135 140

Thr Met His Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

145 150 155 160

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

165 170 175

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

180 185 190

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

195 200 205

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

210 215 220

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

225 230 235 240

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

245 250 255

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

260 265 270

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

275 280 285

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ser Gly Ser

290 295 300

Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu

305 310 315 320

Asn Pro Gly Pro Ser Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu

325 330 335

Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile

340 345 350

Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys

355 360 365

Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr

370 375 380

Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val

385 390 395 400

Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His

405 410 415

Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu

420 425 430

Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln

435 440 445

Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu

450 455 460

Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Gly

465 470 475 480

Gly Gly Gly Ser Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly

485 490 495

Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly

500 505 510

Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys

515 520 525

Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu

530 535 540

Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile

545 550 555 560

Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro

565 570 575

Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly

580 585 590

Gly Arg Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu

595 600 605

Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg

610 615 620

Arg Gln

625

<210> 6

<211> 333

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的NKG2D-FKBP12-CD4TM-OX40 NKG2D DARIC结合组分

<400> 6

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser

20 25 30

Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys

35 40 45

Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser

50 55 60

Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp

65 70 75 80

Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val

85 90 95

His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu

100 105 110

Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala

115 120 125

Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro

130 135 140

Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly

145 150 155 160

Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys

165 170 175

Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly

180 185 190

Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met

195 200 205

Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln

210 215 220

Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala

225 230 235 240

Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu

245 250 255

Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Arg Met Ala Leu

260 265 270

Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly

275 280 285

Ile Phe Phe Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro

290 295 300

Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln

305 310 315 320

Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

325 330

<210> 7

<211> 465

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的NKG2D-FKBP12-CD4TM-TNFR2 NKG2D DARIC结合组分

<400> 7

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser

20 25 30

Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys

35 40 45

Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser

50 55 60

Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp

65 70 75 80

Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val

85 90 95

His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu

100 105 110

Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala

115 120 125

Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro

130 135 140

Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly

145 150 155 160

Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys

165 170 175

Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly

180 185 190

Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met

195 200 205

Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln

210 215 220

Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala

225 230 235 240

Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu

245 250 255

Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Arg Met Ala Leu

260 265 270

Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly

275 280 285

Ile Phe Phe Lys Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val

290 295 300

Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln

305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn

370 375 380

Val Thr Cys Ile Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln

385 390 395 400

Cys Ser Ser Gln Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro

405 410 415

Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys

420 425 430

Ala Phe Arg Ser Gln Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr

435 440 445

Glu Glu Lys Pro Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro

450 455 460

Ser

465

<210> 8

<211> 658

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括NKG2D DARIC信号传导组分、病毒P2A结构域和NKG2D DARIC.OX40

结合组分的合成的NKG2D DARIC多蛋白

<400> 8

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu

20 25 30

Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys

35 40 45

Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly

50 55 60

Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp

65 70 75 80

Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn

85 90 95

Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg

100 105 110

Arg Ile Ser Lys Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ser Asp Ile Tyr Ile Trp

115 120 125

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

130 135 140

Thr Met His Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

145 150 155 160

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

165 170 175

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

180 185 190

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

195 200 205

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

210 215 220

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

225 230 235 240

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

245 250 255

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

260 265 270

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

275 280 285

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ser Gly Ser

290 295 300

Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu

305 310 315 320

Asn Pro Gly Pro Ser Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu

325 330 335

Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile

340 345 350

Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys

355 360 365

Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr

370 375 380

Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val

385 390 395 400

Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His

405 410 415

Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu

420 425 430

Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln

435 440 445

Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu

450 455 460

Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Gly

465 470 475 480

Gly Gly Gly Ser Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly

485 490 495

Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly

500 505 510

Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys

515 520 525

Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu

530 535 540

Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile

545 550 555 560

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565 570 575

Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly

580 585 590

Gly Arg Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu

595 600 605

Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp

610 615 620

Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe

625 630 635 640

Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala

645 650 655

Lys Ile

<210> 9

<211> 790

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括NKG2D DARIC信号传导组分、病毒P2A结构域和NKG2D DARIC.TNFR2

结合组分的合成的NKG2D DARIC多蛋白

<400> 9

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu

20 25 30

Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys

35 40 45

Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly

50 55 60

Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp

65 70 75 80

Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn

85 90 95

Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg

100 105 110

Arg Ile Ser Lys Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ser Asp Ile Tyr Ile Trp

115 120 125

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

130 135 140

Thr Met His Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

145 150 155 160

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

165 170 175

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

180 185 190

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

195 200 205

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

210 215 220

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

225 230 235 240

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

245 250 255

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

260 265 270

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

275 280 285

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ser Gly Ser

290 295 300

Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu

305 310 315 320

Asn Pro Gly Pro Ser Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu

325 330 335

Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile

340 345 350

Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys

355 360 365

Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr

370 375 380

Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val

385 390 395 400

Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His

405 410 415

Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu

420 425 430

Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln

435 440 445

Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu

450 455 460

Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Gly

465 470 475 480

Gly Gly Gly Ser Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly

485 490 495

Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly

500 505 510

Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys

515 520 525

Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu

530 535 540

Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile

545 550 555 560

Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro

565 570 575

Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly

580 585 590

Gly Arg Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu

595 600 605

Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Lys Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gln

610 615 620

Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr

625 630 635 640

Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu Ile Thr Ala Pro Ser Ser Ser

645 650 655

Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro

660 665 670

Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly Val Glu Ala Ser Gly Ala Gly

675 680 685

Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser Pro Gly Gly His

690 695 700

Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile Val Asn Val Cys Ser Ser Ser

705 710 715 720

Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp

725 730 735

Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe

740 745 750

Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gln Leu Glu Thr Pro Glu Thr

755 760 765

Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp

770 775 780

Ala Gly Met Lys Pro Ser

785 790

<210> 10

<211> 216

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 10

Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser

1 5 10 15

Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr

20 25 30

Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu

35 40 45

Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly

50 55 60

Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn

65 70 75 80

Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys

85 90 95

Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln

100 105 110

Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met

115 120 125

Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp

130 135 140

Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile

145 150 155 160

Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro

165 170 175

Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr

180 185 190

Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr

195 200 205

Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val

210 215

<210> 11

<211> 134

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 11

Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro

1 5 10 15

Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe

20 25 30

Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln

35 40 45

Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu

50 55 60

Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr

65 70 75 80

Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu

85 90 95

Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser

100 105 110

Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile

115 120 125

Cys Met Gln Arg Thr Val

130

<210> 12

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 示例性接头序列

<400> 12

Gly Gly Gly

1

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 示例性接头序列

<400> 13

Asp Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 示例性接头序列

<400> 14

Thr Gly Glu Lys Pro

1 5

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 示例性接头序列

<400> 15

Gly Gly Arg Arg

1

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 示例性接头序列

<400> 16

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 17

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 示例性接头序列

<400> 17

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp

1 5 10

<210> 18

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 示例性接头序列

<400> 18

Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser

1 5 10 15

Leu Asp

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 示例性接头序列

<400> 19

Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 示例性接头序列

<400> 20

Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro

1 5

<210> 21

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 示例性接头序列

<400> 21

Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro

1 5 10

<210> 22

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 示例性接头序列

<400> 22

Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro

1 5 10 15

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 通过TEV蛋白酶裂解序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = Gly或Ser

<400> 23

Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa

1 5

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 通过TEV蛋白酶裂解序列

<400> 24

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 通过TEV蛋白酶裂解序列

<400> 25

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser

1 5

<210> 26

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 26

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 27

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 27

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 28

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 28

Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

1 5 10

<210> 29

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 29

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 30

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 30

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 31

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 31

Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

1 5 10

<210> 32

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 32

Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 33

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 33

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 34

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 34

Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

1 5 10

<210> 35

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 35

Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 36

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 36

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 37

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 37

Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

1 5 10

<210> 38

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 38

Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 39

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 39

Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 40

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 40

Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

1 5 10

<210> 41

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 41

Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly

1 5 10 15

Pro

<210> 42

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 42

Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 43

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 43

Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly

1 5 10 15

Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 44

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 44

Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro

1 5 10 15

Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys

20 25 30

Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr

35 40

<210> 45

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 45

Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 46

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 46

Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val

1 5 10 15

Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly

20 25 30

Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

35 40

<210> 47

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 包括2A位点的自裂解多肽

<400> 47

Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu

1 5 10 15

Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly

20 25 30

Pro

<210> 48

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 共有Kozak序列

<400> 48

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