阅读说明：本技术 携带二硫键异构酶信号肽的重组载体及其用途 (Recombinant vector carrying disulfide isomerase signal peptide and application thereof ) 是由 金渶睦 金完燮 严基安 于 2019-01-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种携带二硫键异构酶信号肽的重组载体及其用途。更具体地,本发明重组载体的用途的优点在于,可通过大肠杆菌表达系统产生其氨基酸序列不以蛋氨酸开头的蛋白质。因此,本发明不需要用于商业可用性的额外工艺,例如糖基化等,因此期望将来在诸如开发治疗剂等的各种用途中找到有用的应用。(The invention relates to a recombinant vector carrying disulfide bond isomerase signal peptide and application thereof. More specifically, the use of the recombinant vector of the present invention is advantageous in that a protein whose amino acid sequence does not start with methionine can be produced by an E.coli expression system. Therefore, the present invention does not require an additional process for commercial availability, such as glycosylation and the like, and thus is expected to find useful applications in various uses such as development of therapeutic agents and the like in the future.)

携带二硫键异构酶信号肽的重组载体及其用途

技术领域

本发明涉及一种携带二硫键异构酶信号肽的重组载体及其用途。

本申请要求于2018年1月26日在韩国知识产权局递交的韩国专利申请10-2018-0010055的优先权和利益，并且该申请的说明书和附图中公开的所有内容都包含在本申请中。

背景技术

为了大量生产重组蛋白用于各种目的，例如研究、治疗或其他商业目的，目前使用各种载体和宿主，其中，使用大肠杆菌表达系统表达所需蛋白质并随后纯化蛋白质的方法，由于可以以较少的成本和精力获得大量的蛋白质，因此得到了有效的利用。

然而，由于哺乳动物和细菌在细胞内环境上存在差异，因此，在利用大肠杆菌系统获得不同类型的人类蛋白质时，需要为每种蛋白质建立特定的表达和纯化条件。尤其是，大肠杆菌产生的所有蛋白质的氨基酸序列都是从蛋氨酸(Met)开始的，相反，在人体内发现的或从高等生物中表达的蛋白质，通过翻译后修饰被蛋白酶降解，并被激活或受到各种蛋白质修饰，如附着糖链的糖基化、磷酸化、乙酰化和羧化。因此，许多商业化蛋白质的氨基酸序列不是从蛋氨酸开始的，因此，大肠杆菌产生的蛋白质是不利的，因为蛋白质需要经受一个额外的过程，例如通过酶反应的蛋白水解性裂解。

同时，已知的是，胸腺肽β4(TB4)在新生血管形成、伤口愈合、毛发生长等方面发挥功效，因此目前正在进行临床试验和FDA批准的审查，以用作各种疾病(如缺血性心脏病、角膜损伤、眼科疾病和大疱性表皮松解症)的治疗剂，并有望成为脱发的治疗剂。

由于胸腺肽β4可作为上述各种疾病的治疗剂，因此预计将来胸腺肽β4作为治疗肽释放时将有巨大的需求，但存在的问题是，当通过合成来生产肽时，需要较高的生产成本，当肽从宿主(宿主菌株)如大肠杆菌中表达出来时，还需要额外的工作，如在生产后通过酶反应进行裂解，以修饰以蛋氨酸为起始的蛋白质序列，但这方面的研究仍然不足。

发明内容

技术问题

本发明人为解决如上所述的相关领域的问题付出了大量的努力，结果证实了当使用包含二硫键异构酶信号肽的重组载体时，可以通过大肠杆菌表达系统产生其所需氨基酸序列不以蛋氨酸开头的蛋白质，从而基于此完成本发明。

因此，本发明的目的是提供一种重组载体，其包含编码二硫键异构酶信号肽的碱基序列。

此外，本发明的另一个目的是提供一种重组载体，其包含编码二硫键异构酶信号肽和胸腺肽β4的碱基序列。

此外，本发明的另一个目的是提供用重组载体转化的转化体。

此外，本发明的另一个目的是提供一种制备胸腺肽β4蛋白质的方法，所述方法包括：用重组载体转化大肠杆菌，然后在培养基中培养大肠杆菌。

然而，本发明要实现的技术问题不限于上述问题，本领域技术人员可以从以下描述中清楚地理解未提及的其他问题。

技术方案

本发明涉及一种包含二硫键异构酶信号肽的重组载体及其用途，本发明提供一种包含编码二硫键异构酶信号肽的碱基序列的重组载体。

此外，本发明提供一种重组载体，其包含编码二硫键异构酶信号肽和胸腺肽β4的碱基序列。

另外，本发明提供了一种用重组载体转化的转化体。

此外，本发明提供一种制备胸腺肽β4蛋白的方法，所述方法包括：用重组载体转化大肠杆菌，然后在培养基中培养该大肠杆菌。

有利效果

当使用本发明的包含二硫键异构酶信号肽的重组载体时，可以通过大肠杆菌表达载体产生其氨基酸序列不以蛋氨酸开头的蛋白质，并且因此，优点是，所述重组载体不需要进行一个额外过程(如蛋白酶处理)就商业上可用。特别是，尽管胸腺肽β4作为各种疾病的治疗剂已使用一段时间，但胸腺肽β4存在一个问题，即当胸腺肽β4在宿主(宿主菌株)中表达时，胸腺肽β4被细胞内蛋白酶降解，因此不能产生。本发明使胸腺肽β4能够通过大肠杆菌表达系统产生，从而可有效地用于开发用于脱发以及缺血性心脏病、角膜损伤、眼科疾病和大疱性表皮松解症的治疗剂，并且进一步地，本发明的大肠杆菌表达系统可用于生产各种治疗性蛋白质，例如甲状旁腺激素、人类生长激素和用于治疗骨质疏松症的粒细胞集落刺激因子(GCSF)，因此有望作为有用的技术被广泛应用。

附图说明

图1示意性地示出确认合成质粒DsbC-SP TB4的DNA序列与参考DNA序列的对齐(alignment)的结果。

图2示出DsbC-SP TB4的载体图。

图3示意性地示出了转化的大肠杆菌菌株BL21的生长程度。

图4示意性地示出用1.0mM IPTG诱导胸腺肽β4(TB4)蛋白质表达的结果。

图5示出了用SDS-PAGE确认转化的目标蛋白质带的结果。

具体实施方式

本发明人确认，当使用包含二硫键异构酶信号肽的重组载体时，可通过大肠杆菌表达系统产生其氨基酸序列不以蛋氨酸开头的蛋白质，从而基于此完成本发明。

下面，将详细描述本发明。

本发明提供一种重组载体，其包含编码二硫键异构酶信号肽的碱基序列。

此外，本发明提供一种重组载体，其包含SEQ ID NO:7的碱基序列，其中胸腺肽β4连接到二硫键异构酶信号肽的羧基端。

如本文所用，“载体”是指在DNA重组实验中，通过将目标DNA片段导入宿主细菌等而能够增殖的DNA，也被称为克隆载体，其中载体DNA被限制性酶等裂解以打开环，并且目标DNA片段被***载体并与载体连接，以引入到宿主菌中。随着宿主菌的增殖，与目标DNA片段连接的载体DNA被复制并分布到每个子细胞中，细菌的***使目标DNA片段代代相传，通常使用质粒和噬菌体染色体。

如本文所使用的，“质粒”是指在细胞中稳定维持并一代代传至后代的基因的总称，其独立于染色体而存在并自主繁殖，但包含在真核细胞的线粒体或叶绿体中的DNA通常称为细胞器DNA，与质粒不同。基因的存在对正常细胞存活并不总是必须的，但在细菌细胞中，基因具有多种功能，如接合转移(F因子)、抗生素抗性(R因子)和抗细菌材料的合成(细菌素)(大肠杆菌素因子)。此外，还有将植物细胞转化为肿瘤的那些，如土壤细菌中存在的Ti质粒，还发现了各种形式，例如当传递因子相互共存时(即使它们没有自己的传递机制)被共同传递的那些；或者，即使共存也不能传递的那些。质粒常被用作组织转化DNA实验(基因操作技术)的载体。

如本文所用，“启动子”是指连接到结构基因上游部分的基因组区域，并且用于调节与之连接的结构基因以转录成mRNA。启动子通过结合多个通用转录因子而被激活，并且包括广泛调节基因表达的TATA盒、CAAT盒区域、响应于外部刺激而影响基因表达的区域、促进几乎所有基因表达而不考虑位置和方向的增强子等。由于生物体基本代谢所需的蛋白质必须在细胞中保持恒定的浓度，因此与这些基因连接的启动子通常只在通用转录因子的作用下被激活。相比之下，在正常情况下没有作用、只在特殊情况下才需要发挥作用的蛋白质，与组织特异性启动子或诱导相应结构基因的表达的诱导启动子相连。也就是说，组织特异性启动子是在生物体发育过程中通过结合被激活的特异性转录因子而激活的，诱导性启动子是由周围环境因子的外部刺激激活的特异性转录因子的结合而激活的。

如本文所用，所述“操纵子”也被称为操作基因，并且在细菌的基因调控期间用于调节特定基因的表达。操纵子主要位于结构基因旁边，在特定情况下调节所需基因的表达或不表达。

如本文所使用的，“重组载体”是指包含可操作地连接以表达基因***体的基本调节元件的基因构建物，作为能够在宿主细胞中表达目标蛋白质或目标RNA的载体，并且是指本领域已知的质粒、病毒或其他载体，其中，可以***或引入编码启动子和可操作地连接到启动子的目标蛋白质的基因碱基序列。

另外，本发明提供一种利用本发明制备的重组载体转化的转化体。

如本文所用，“转化”是指个体或细胞的特征被DNA(一种来自外界的遗传物质)遗传修饰。

本发明的另一方面提供一种制备转化蛋白质的方法，所述方法包括：a)构建本发明的重组载体；b)用重组载体转化大肠杆菌；以及c)在培养基中培养大肠杆菌。

在本发明的一个示例性实施方式中，使用pGE载体和参考DNA序列构建质粒，其中胸腺肽β4(TB4)连接到作为信号肽的二硫键异构酶信号肽(DsbC-SP)的羧基端(C-端)(参见实施例1)。

在本发明的另一示例性实施方式中，使用所构建的质粒构建转化的大肠杆菌菌株BL21和DH5α(参见实施例2)，并且确认了转化的大肠杆菌菌株BL21的生长(参见实施例3)。

在本发明的另一个示例性实施方式中，确认TB4在转化的大肠杆菌菌株中表达(参见实施例4)。

以下，将提出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例只是为了更容易理解本发明，本发明的内容不受以下实施例的限制。

实施例1.质粒的构建

为了合成能够表达胸腺肽β(TB4)的质粒，利用pGE载体和其中TB4与作为信号肽的二硫键异构酶信号肽(DsbC-SP)的羧基端(C-端)相连的参考DNA序列，合成了将DNA序列***载体的质粒。

用于质粒合成的碱基序列如下表1所示。

[表1]

结果表明，合成质粒的DNA序列与参考DNA序列是一致并匹配的(Http://Multalin.toulouse.inra.fr/)，两个序列100％相同，如图1所示。

此外，如图2所示的载体图可以被确认，并且合成的质粒被命名为“DsbC-SP TB4”。

实施例2.转化的大肠杆菌菌株的构建

通过使用实施例1中方法构建的质粒执行以下实验来构建转化的大肠杆菌菌株。

<2-1>LB培养基的制备

为了制备LB(Luria Bertani)培养基肉汤(LB液体培养基)，将800mL三次水(tertiary water)放入2L烧杯中，量取25.03g LB肉汤，将LB肉汤放入2L烧杯中，然后搅拌所得混合物，直到完全溶解。然后，通过添加三次水将最终体积调整为1L，将所得产物转移到2L瓶中，所述瓶在121℃和30分钟的条件下进行灭菌。

2-2.补充卡那霉素的LB琼脂平板的制备

为了制备LB琼脂平板，将300mL三次水放入2L烧杯中，将19.98g LB琼脂放入2L烧杯中，并搅拌所得混合物，直到其完全溶解。然后，通过添加三次水将最终体积调整至500mL，将所得产品转移到2L瓶中，并在121℃和30分钟的条件下对瓶子进行灭菌。然后，在高压灭菌锅温度为40～50℃时，将瓶从高压灭菌锅中取出，转移到干净的工作台上，加入500μL卡那霉素(储备浓度为50mg/mL)，直至浓度达到50μg/mL。将约20mL LB琼脂溶液分配到有盖培养皿中，有盖培养皿在干净的工作台上干燥，直到有盖培养皿的LB琼脂凝固，然后将完全干燥的有盖培养皿用塑料薄膜包裹，并在冰箱(2℃至8℃)中储存长达1个月。

2-3.用于蛋白质表达的转化的大肠杆菌菌株的构建

首先，为了利用通过实施例1中方法合成的质粒(DsbC-SP TB4)构建用于表达目标蛋白质的转化的大肠杆菌菌株BL21(BL21/DsbC-SPTB4)，根据用户方案TB009(Novagen)进行转化，并将转化菌株铺在添加50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，并在培养器中37℃培养过夜(14小时)。

结果表明，转化的大肠杆菌BL21在添加卡那霉素(50μg/mL)的LB琼脂平板上形成菌落，用环针法收集BL21/DsbC-SP TB4单菌落。添加卡那霉素(50μg/mL)的LB琼脂平板用封口膜密封，并在冰箱(2℃至8℃)中保存长达1个月。

然后，将收集的BL21/DsbC-SP TB4接种于含有4mL LB肉汤的14mL圆底管中，在37℃和200rpm的条件下在振荡培养器中培养过夜(14小时)，将200μL培养液接种到含有100mLLB肉汤的250mL烧瓶中，然后每隔30分钟测量OD₆₀₀值，当OD₆₀₀＝约0.2时终止培养。大肠杆菌菌株通过以4000rpm离心分离15分钟回收，OD₆₀₀＝1.0时的体积按以下计算公式计算。

(OD₆₀₀＝1.0时的体积)＝(培养结束时的体积)x(培养结束时的OD₆₀₀值)

通过放入含有灭菌甘油的LB肉汤使颗粒再悬浮，使得具有按上述公式计算的体积的15％的体积，然后将200μL的每个悬浮液等份加入灭菌的微管中，并将微管储存在深冷冻箱(-80℃至-70℃)或液氮罐(-196℃)中。

然后，由于用同样的方法构建了转化的大肠杆菌菌株DH5α(DH5α/DsbC-SP TB4)，从而用DsbC-SP TB4质粒大量生产质粒DNA，得到了形成菌落的平板。

如上所述构建的DH5α/DsbC-SP TB4经受了针对BL21/DsbC-SP TB4的单个菌落的相同的处理，并被储存在深冷冻箱(-80℃至-70℃)或液氮罐(-196℃)中。

实施例3.构建的大肠杆菌菌株的生长的确认

为了确认通过实施例2中的方法构建的大肠杆菌BL21的生长，将20ml LB肉汤和20μl卡那霉素原液(50mg/ml)置于50ml锥形管中。取出深冷冻箱中储存的DsbC-SP TB4 1小瓶后，在37℃的水浴中解冻小瓶2至3分钟。将解冻后的细胞接种于含有LB肉汤和卡那霉素的50ml锥形管中，在37℃、200rpm的振荡培养器中培养3h。然后，将2.5ml培养液接种到含有250ml LB肉汤的带挡板的锥形烧瓶中，并在接种后每小时取样1ml培养液。用紫外分光光度计测定所提取培养液的OD₆₀₀值，当测得的OD₆₀₀值为0.8或更高时，将培养液稀释后再次测定。

结果，如图3所示，可以确认使用合成质粒(DsbC-SP TB4)转化的大肠杆菌菌株BL21(BL21/DsbC-SP TB4)培养6小时后，OD₆₀₀值已增加到约2.5。

实施例4.在构建的大肠杆菌菌株中TB4表达的确认

4-1.DsbC-SP TB4表达的确认

为了确认胸腺肽β4(TB4)蛋白质在通过实施例2中的方法构建的大肠杆菌菌株中的表达，将DsbC-SP TB4细胞原液在添加卡那霉素(50μg/mL)的20mL LB培养基中解冻。然后，该细胞原液在37℃和200rpm的振荡培养器中培养3小时(初级种子培养液)，之后在含有卡那霉素(50μg/mL)的20mL LB培养基中1/10000稀释，然后培养过夜(二级种子培养液)。将2.5ml二级种子培养液接种到250ml LB中，在37℃和200rpm的振荡培养器中再次培养，每1h测量OD₆₀₀值。

当测得的OD₆₀₀值达到0.6时，加入IPTG进行诱导，以变为1.0mM，诱导后3h终止培养。通过以4000rpm离心分离10mL培养液30分钟来回收细胞，并根据用户指南用B-PER压碎小球(B-PER：细菌蛋白质提取试剂)，然后以15000rpm离心10分钟，仅分离上清液。将分离的上清液与4倍Laemmli样品缓冲液按1:3的比例混合，制成用于SDS-PAGE的样品并将其装载到凝胶上，然后样品在200V下电泳30分钟，考马斯染色30分钟，然后脱色。随后，用凝胶成像分析目标蛋白质带。

当诱导蛋白质表达时，BL21/DsbC-SP TB4的生长程度如图4所示。

4-2.DsbC-SP TB4的N端测序

将DsbC-SP TB4细胞原液在补充卡那霉素(50μg/mL)的20mL LB培养基中解冻，并在37℃和200rpm下的振荡培养器中培养3小时(初级种子培养液)。然后，将初级种子培养液在20mL补充卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中1/10000稀释，过夜培养(二级种子培养液)。将2.5ml二级种子培养液接种到250ml LB中，在37℃和200rpm的振荡培养器中再次培养，每1h测量OD₆₀₀值。

当测得的OD₆₀₀值达到0.6时，加入IPTG进行诱导，以变为1.0mM，诱导后3h终止培养。通过以4000rpm离心分离10mL培养液30分钟来回收细胞，并根据用户指南用B-PER(B-PER：细菌蛋白质提取试剂)压碎颗粒，然后以15000rpm离心10分钟，仅分离上清液。将分离的上清液与4倍Laemmli样品缓冲液按1:3的比例混合，制成用于SDS-PAGE的样品并将其装载到凝胶上，之后样品在200V下进行30分钟的电泳。将样品转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用丽春红染色所述膜，确认转化的目标蛋白质带。

结果，如图5所示，确认诱导带出现在与TB4标准相同的位置，并且每个条带描述如下表2所示。

[表2]

M	标记
		1	Gly-TB4(Y-20150303)
2	用1.0mM的IPTG在OD 0.6进行诱导

此外，如下表3所示，通过分析与上述预期目标带大小(5至6kDa)相对应的蛋白质N端的10个氨基酸的序列，该序列与WT(野生型)_TB4的序列相匹配。

[表3]

同时，WT_TB4的氨基酸序列如下表4所示，特别是粗体部分是指10个N端氨基酸的序列。

[表4]

由上可以看出，通过实施例2的方法构建的大肠杆菌菌株是用具有WT_TB4序列的质粒转化并表达WT_TB4的菌株。

作为参考，本发明二硫键异构酶信号肽的碱基序列和氨基酸序列如下表5所示，但不限于此。

[表5]

本发明的上述描述是为了说明目的而提供的，并且本发明所属领域的技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应当理解，上述实施方式在所有方面仅是示例性的，而非限制性的。

工业实用性

当使用包含二硫键异构酶信号肽的重组载体时，可以通过大肠杆菌表达系统产生其氨基酸序列不以蛋氨酸开头的蛋白质，因此，优点在于，重组载体不需要额外的工艺(例如蛋白酶处理)以获得商业可用性。特别是，尽管胸腺肽β4作为各种疾病的治疗剂已使用一段时间，但胸腺肽β4存在一个问题，即当胸腺肽β4在宿主(宿主菌株)中表达时，胸腺肽β4被细胞内蛋白酶降解而不能产生。本发明使胸腺肽β4能够通过大肠杆菌表达系统产生，从而可用于开发用于脱发以及缺血性心脏病、角膜损伤、眼科疾病和大疱性表皮松解症的治疗剂，并且进一步，本发明的大肠杆菌表达系统可用于生产各种治疗性蛋白质，例如甲状旁腺激素、人类生长激素和用于治疗骨质疏松症的粒细胞集落刺激因子(GCSF)，因此有望作为有用的技术被广泛应用。

<110> 汇恩斯株式会社

<120> 携带二硫键异构酶信号肽的重组载体及其用途

<130> MPO20-063CN

<150> KR 10-2018-0010055

<151> 2018-01-26

<160> 16

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DsbC-SP

<400> 1

atgaagaaag gttttatgtt atttaccttg ttggcagcgt tttcaggctt tgttcaggct 60

60

<210> 2

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TB4

<400> 2

tccgacaaac ccgatatggc tgagatcgag aaattcgata agtcgaaact gaagaagaca 60

gagacgcaag agaaaaatcc actgccttcc aaagaaacga ttgaacagga gaagcaagca 120

ggcgaatcgt aa 132

<210> 3

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EcoRI

<400> 3

gaattc 6

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Tac启动子

<400> 4

ttgacaatta atcatcggct cgtataatg 29

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Lac操纵子

<400> 5

ttgtgagcgg ataacaa 17

<210> 6

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> XhoI

<400> 6

ctcgag 6

<210> 7

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DsbC-SP TB4

<400> 7

atgaagaaag gttttatgtt atttaccttg ttggcagcgt tttcaggctt tgttcaggct 60

tccgacaaac ccgatatggc tgagatcgag aaattcgata agtcgaaact gaagaagaca 120

gagacgcaag agaaaaatcc actgccttcc aaagaaacga ttgaacagga gaagcaagca 180

ggcgaatcgt aa 192

<210> 8

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> WT_TB4

<400> 8

Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys

1 5 10 15

Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu

20 25 30

Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser

35 40

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DsbC-SP1

<400> 9

atgaagaaag gttttatgtt atttaccttg ttggcagcgt tttcaggctt tgttcaggct 60

60

<210> 10

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DsbC-SP1

<400> 10

Met Lys Lys Gly Phe Met Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Phe Ser Gly

1 5 10 15

Phe Val Gln Ala

20

<210> 11

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DsbC-SP2

<400> 11

atgaaaaaaa ttattaaggc atcggtatta cttctttcat taagtaccgc cttcacgatg 60

aatgccgag 69

<210> 12

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DsbC-SP2

<400> 12

Met Lys Lys Ile Ile Lys Ala Ser Val Leu Leu Leu Ser Leu Ser Thr

1 5 10 15

Ala Phe Thr Met Asn Ala Glu

20

<210> 13

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DsbC-SP3

<400> 13

atgcggacaa aattacttgg ggcgctgatg gtgttcggga ttattaccgg cacggctcat 60

gcgtca 66

<210> 14

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DsbC-SP3

<400> 14

Met Arg Thr Lys Leu Leu Gly Ala Leu Met Val Phe Gly Ile Ile Thr

1 5 10 15

Gly Thr Ala His Ala Ser

20

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DsbA-SP

<400> 15

atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggcggcg 60

60

<210> 16

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DsbA-SP

<400> 16

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Phe Ser Ala

1 5 10 15

Ser Ala Ala