阅读说明：本技术 一种可调控的猕猴脊髓损伤方法 (Adjustable macaque spinal cord injury method ) 是由 邹杨鸿 周广平 张志婷 林郁 耿鑫 李经辉 徐玲 杜玲丽 余化霖 彭琴 王建红 于 2020-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种可调控的猕猴脊髓损伤方法,在猕猴的椎管目标脊髓节段内植入弹性球囊,球囊远端注水口埋于附近皮下；通过往球囊内注入不同体积的生理盐水,制作不同损伤程度的猕猴脊髓损伤模型。通过在猕猴椎管内使用球囊进行压迫的方法,构建可以调控损伤程度、调控损伤时程及损伤位置的猕猴脊髓损伤模型,造模效果持久,损伤渐进式,损伤程度行为可视化,对猕猴创伤小,致死率低,可用于模拟并研究脊髓外伤、脊髓内/外肿瘤、椎间盘突出、脊髓先天性畸形、脊髓感染等病变的病理损伤机制及治疗策略,对上述各类疾病的临床前试验具有重要意义。(The invention relates to an adjustable macaque spinal cord injury method, wherein an elastic balloon is implanted into a spinal cord segment of a vertebral canal target of a macaque, and a water injection port at the far end of the balloon is buried under the nearby skin; physiological saline with different volumes is injected into the saccule to manufacture the macaque spinal cord injury models with different injury degrees. The macaque spinal cord injury model which can regulate and control the injury degree, the injury time course and the injury position is constructed by using the saccule for compression in the macaque spinal canal, the modeling effect is durable, the injury is progressive, the injury degree behavior is visual, the macaque injury is small, the lethality rate is low, and the macaque spinal cord injury model can be used for simulating and researching pathological injury mechanisms and treatment strategies of pathological changes such as spinal cord trauma, spinal cord internal/external tumors, intervertebral disc herniation, spinal cord congenital malformation, spinal cord infection and the like, and has important significance for preclinical tests of various diseases.)

一种可调控的猕猴脊髓损伤方法

技术领域

本发明属于医学动物研究技术领域，具体涉及一种可调控的猕猴脊髓损伤方法。

背景技术

脊髓损伤是一类严重的临床疾病，脊髓损伤患者的生命较少受到直接威胁，生存期长，但生存质量却极其低下，往往生活无法自理，对个人、家庭和社会都造成了极大的负担。因而，采用实验动物制备脊髓损伤模型，研究脊髓损伤的病理损伤机制及治疗策略，是生物学，乃至医学界急需解决的课题之一。

现有的大多数脊髓损伤模型都是采用啮齿动物和其他小动物一起开发的，其问题在于：

1）啮齿动物和其他小动物椎管结构小，难以实现局部损伤，造模往往是全脊髓或一侧脊髓损伤，无法精细调控损伤程度。2）啮齿动物和其他小动物在康复过程中，脊髓损伤后出现的截瘫、褥疮、尿潴留等症状恢复迅速，而人类脊髓损伤后通常恢复较慢或难以恢复，两者相差甚远。所以这些模型并不适合模拟人类脊髓损伤，最重要的是，啮齿动物在生理条件、脊髓解剖结构和脊髓血液供应方面与人类有很大不同，因此，啮齿动物模型不能总是反映人类的情况。

恒河猕猴（rhesus monkey，以下简称猕猴）在基因、解剖、病理、生理，分子调控和行为上均与人类接近，其脊髓及椎管大小相对而言较人类更为接近，且猕猴具有较高的认知水平、复杂的行为，人类脊髓损伤后造成的感觉、精细动作，肢体活动等方面的症状均可在猕猴上表现，所以，猕猴在模拟人类脊髓疾病上具备其他实验动物不可替代的优势。

目前所知的猕猴脊髓损伤模型仍然是延用了啮齿类动物的建模方法：通过砸伤、横断切割、钳夹等方法对猕猴脊髓进行一侧损伤或全部损伤。这些方法存在以下问题：1）操作复杂，手术创伤大，致死率高。2）损伤程度不可调控，不论是一侧损伤还是全脊髓损伤，都直接造成对应肢体的直接截瘫，而临床上轻症患者例感觉异常、精细活动障碍、跛行等症状无法模拟。3）损伤不可逆转，但是在临床上，脊髓肿瘤、椎间盘突出的患者，在手术摘除肿瘤或突出的椎间盘后会获得一定程度的恢复，目前已有的实验动物脊髓损伤的建模方法并不能模拟这一过程。

因此，基于目前已有的非人灵长类动物脊髓损伤模型较少，且均存在弊端，造模效果差、不可调控、损伤不可逆，致死率高等，对猕猴这种宝贵的实验动物造成资源浪费。

亟待发明一种简单、可调控症状的猕猴脊髓损伤技术方案来解决上述技术问题。

发明内容

针对上述问，本发明提供一种操作更加简单、创伤更小，且可以对猕猴脊髓的损伤程度进行调控的猕猴脊髓损伤的方法。

具体技术方案是：一种可调控的猕猴脊髓损伤方法，包括如下步骤：

1）在猕猴的椎管目标脊髓节段内植入弹性球囊，球囊远端注水口埋于附近皮下；

2）打开皮下切口，通过往球囊内注入不同体积的生理盐水，制作不同损伤程度的猕猴脊髓损伤模型，通过猕猴行为评价脊髓损伤的程度及发展进程；

3）压迫一段时间后撤除球囊。猕猴的症状存在一定程度逆转。

目前，各种动物脊髓损伤模型几乎集中在啮齿类动物或其他小型动物上进行，鲜见非人灵长类动物模型。猕猴具有较高的认知水平、复杂的行为，人类脊髓损伤后造成的感觉、精细动作，肢体活动等方面的症状均可在其身上表达，通过猕猴制作脊髓损伤模型具有其他常规实验动物无可比拟的优势。

猕猴的脊柱分为颈椎、胸椎、腰椎、荐骨、尾椎等几个部分，其中颈椎7个，胸椎12个，与人类相同，脊髓的被膜由外向内依次为黄韧带、硬膜外间隙、硬脊膜、蛛网膜、软脊膜、脊髓，解剖层次类似于人类，其脊神经支配的节段也与人类大致相同。猕猴脊髓受损后，脊髓的传导束受到影响，轻者表现为感觉障碍、足趾抓握障碍、下肢体活动不利等，若损伤持续加重则会出现一侧瘫、截瘫、大小便失禁等症状，与人类脊髓受损后出现的症状类似。

给猕猴进行MRI手术前定位后，确定目标锥***置同时测量目标锥体处椎管直径大小。从定位点进行手术，依次切开皮肤，目标锥体与其下一锥体之间的棘间韧带，打开黄韧带，将球囊从此间隙植入目标锥体的椎管内硬脊膜外间隙，球囊尾端注水口延至皮下，根据所需模型哪一侧先出现症状决定球囊置于脊髓的左侧或右侧，同时根据模型需要的症状严重程度决定球囊中注入生理盐水的体积，球囊注入的液体量的控制是一个循序渐进且可控的过程。

可造成动物模型出现以下几种状态：

1）患侧脊髓支配节段以下肢体感觉障碍，手指或足趾抓握障碍；

2）患侧脊髓支配节段以下肢体肌力下降，活动障碍；

3）患侧脊髓支配节段以下肢体瘫痪；

4）双侧脊髓支配节段以下肢体瘫痪、大小便失禁等。

植入球囊后逐层缝合切口，球囊尾端埋在皮下。

球囊可长期置于体内使其症状稳定表达，若需要症状由轻向重调整，只需皮下打开一小切口，继续往球囊内注入一定体积的生理盐水即可。若需要模拟临床上脊髓肿瘤或椎间盘突出患者行肿瘤切除或突出椎间盘摘除术后的情况，只需抽出球囊内液体。

进一步，所述步骤2）植入的球囊注入生理盐水后直径大小为1~1.5cm，且不会引起排异反应。

选择球囊要选择充满液体后最大直径在1-1.5cm这个范围内的型号的球囊，这个取值范围是根据猕猴的椎管管腔直径的大小决定的，通过研究在磁共振扫描中发现猕猴的椎管管腔直径的大小约为0.9-1.2cm。

进一步，所述步骤1）植入球囊部位为第10胸椎。

优选的球囊植入部位为第10胸椎，是因为通过不断的研究后发现第10胸椎损伤截面以下恰好可以造成下肢感觉运动功能障碍，且对双上肢功能不会造成影响，便于观察下肢功能障碍行为表现。若损伤发生在第10胸椎之上的节段，可能会出现胸腹部的肌肉和神经功能障碍；若损伤第10胸椎以下节段，可能会出现下肢功能部分保留的情况，不利于观察典型的行为表现。而且从解剖的角度来说，第10胸椎的定位和解剖的操作难度也相对其他椎体更容易。因此，第10胸椎是对双下肢的感觉运动功能障碍进行评价较为理想的损伤位置。

提供一种操作更加简单、创伤更小，且可以对猕猴脊髓的损伤程度进行调控的猕猴脊髓损伤的方法。可以根据需要调控脊髓损伤的程度以及出现的相应症状；可以在轻症的情况下继续向加重症状的方向调整；可模拟人类脊髓占位性病变通过手术解除后的情况。模型稳定，球囊长期置于体内可使症状稳定表达；操作简单，损伤小，硬脊膜没有遭到破坏和严重挤压，手术操作中几乎不会对脊髓产生人为操作产生的影响，动物致死率较低。

进一步，所述步骤1）植入球囊部位为颈椎、胸椎或腰椎。

本发明的有益效果：通过在猕猴椎管内使用球囊进行压迫的方法，构建可以调控损伤程度、调控损伤时程及损伤位置的猕猴脊髓损伤模型，造模效果持久，损伤渐进式，损伤程度行为可视化，对猕猴创伤小，致死率低，可用于模拟并研究脊髓外伤、脊髓内/外肿瘤、椎间盘突出、脊髓先天性畸形、脊髓感染等病变的病理损伤机制及治疗策略，该研究对上述各类疾病的临床前试验具有重要意义。

附图说明

图1是本发明可调控的猕猴脊髓损伤方法中在目标脊髓节段内植入弹性球囊示意图。

图2是第一种实施例中植入球囊后，球囊内注入生理盐水后磁共振影像图。

图3是对比列1中植入球囊后，球囊内注入生理盐水后磁共振影像图。

图4是对比列2中植入球囊后，球囊内注入生理盐水后磁共振影像图。

上图中：1-椎管，2-目标脊髓节段，3-球囊，4-棘突。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

一种可调控的猕猴脊髓损伤方法，包括如下步骤：

1）猕猴手术前行MRI扫描，确定第10胸椎位置，同时同时测量第10胸椎对应椎管直径大小。

2）猕猴手术时保持无菌操作，根据术前定位确认第10胸椎位置，依次切开皮肤，第10、11胸椎之间的棘间韧带，沿黄韧带中间缝隙向两边撑开黄韧带，将球囊从此间隙植入第10胸椎对应的椎管内右侧硬脊膜外间隙，球囊尾端注水口延至皮下。往球囊内注入少量生理盐水，逐层缝合切口，球囊注水口埋于皮下，缝合皮肤，请参考图1。

3）猕猴观察一周（无症状，因球囊对脊髓的压迫尚在猕猴可代偿范围内）；术后第每周定期在无菌条件下打开一皮肤小切口，往球囊口再次加注等体积的生理盐水，缝合切口，定期记录猕猴患侧行为。

4）待球囊注入生理盐水后直径大小为1cm时，请参考图2，猕猴下肢出现完全瘫痪，在无菌条件下打开一皮肤小切口，抽出球囊内全部液体，缝合切口，猕猴脊髓损伤症状获得一定程度恢复。

实施例2：

一种可调控的猕猴脊髓损伤方法，包括如下步骤：

1）猕猴手术前行MRI扫描，确定第10胸椎位置，同时同时测量第10胸椎对应椎管直径大小。

2）猕猴手术时保持无菌操作，根据术前定位确认第10胸椎位置，依次切开皮肤，第10、11胸椎之间的棘间韧带，沿黄韧带中间缝隙向两边撑开黄韧带，将球囊从此间隙植入第10胸椎对应的椎管内右侧硬脊膜外间隙，球囊尾端注水口延至皮下。往球囊内注入少量生理盐水，逐层缝合切口，球囊注水口埋于皮下，缝合皮肤，请参考图1。

3）猕猴观察一周（无症状，因球囊对脊髓的压迫尚在猕猴可代偿范围内）；术后第每周定期在无菌条件下打开一皮肤小切口，往球囊口再次加注等体积的生理盐水，缝合切口，定期记录猕猴患侧行为。

4）待球囊注入生理盐水后直径大小为1.5cm时，猕猴下肢出现完全瘫痪，在无菌条件下打开一皮肤小切口，抽出球囊内全部液体，缝合切口，猕猴脊髓损伤症状获得一定程度恢复。

同一只猕猴在脊髓渐进式损伤后表现的几种状态依次是：

A：正常行走状态；

B：跛行状态（右下肢无力）；

C：右下肢瘫痪状态（左下肢可以自行收拢，右下肢瘫痪自然伸直）；

D：双下肢瘫痪状态（双下肢自然伸直，只能靠双上肢爬行）。

本发明的可调控的猕猴脊髓损伤方法通过影像学评价和行为学评价均取得较好的成果，满足模拟并研究脊髓外伤、脊髓内/外肿瘤、椎间盘突出、脊髓先天性畸形、脊髓感染等病变。

对比列1：

1）猕猴手术前行MRI扫描，确定第10胸椎位置，同时同时测量第10胸椎对应椎管直径大小。

2）猕猴手术时保持无菌操作，根据术前定位确认第10胸椎位置，依次切开皮肤，第10、11胸椎之间的棘间韧带，沿黄韧带中间缝隙向两边撑开黄韧带，将球囊从此间隙植入第10胸椎对应的椎管内右侧硬脊膜外间隙，球囊尾端注水口延至皮下。往球囊内注入少量生理盐水，逐层缝合切口，球囊注水口埋于皮下，缝合皮肤，请参考图1。

3）猕猴观察一周（无症状，因球囊对脊髓的压迫尚在猕猴可代偿范围内）；术后第每周定期在无菌条件下打开一皮肤小切口，往球囊口再次加注等体积的生理盐水，缝合切口，定期记录猕猴患侧行为。

4）待球囊注入生理盐水后直径大小为0.8cm时，请参考图3，球囊其最大直径小于椎管管腔直径，会出现无法完全压迫椎管的情况。

对比列2：

1）猕猴手术前行MRI扫描，确定第10胸椎位置，同时同时测量第10胸椎对应椎管直径大小。

2）猕猴手术时保持无菌操作，根据术前定位确认第10胸椎位置，依次切开皮肤，第10、11胸椎之间的棘间韧带，沿黄韧带中间缝隙向两边撑开黄韧带，将球囊从此间隙植入第10胸椎对应的椎管内右侧硬脊膜外间隙，球囊尾端注水口延至皮下。往球囊内注入少量生理盐水，逐层缝合切口，球囊注水口埋于皮下，缝合皮肤，请参考图1。

3）猕猴观察一周（无症状，因球囊对脊髓的压迫尚在猕猴可代偿范围内）；术后第每周定期在无菌条件下打开一皮肤小切口，往球囊口再次加注等体积的生理盐水，缝合切口，定期记录猕猴患侧行为。

4）待球囊注入生理盐水后直径大小为1.8cm时，请参考图4，球囊充盈椎管后，脊髓已经严重挤压变形，球囊过大也会与猕猴椎管不匹配。

本发明所公开的调控猕猴脊髓损伤方法完全适用于猕猴的颈、胸、腰椎的任意椎体，本领域技术人员在使用该方法在手术操作技术上完全可行，只要术前磁共振定位下确认好目标椎体，根据椎管直径大小选择合适球囊。就可以将球囊植入颈、胸、腰椎的任意椎体。

以上通过具体的和优选的实施例详细的描述了本发明，但本领域技术人员应该明白，本发明并不局限于以上所述实施例，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。