阅读说明：本技术 一种含有二硫键的双重响应功能分子、水凝胶微球的制备方法及应用 (Preparation method and application of disulfide bond-containing dual-response functional molecule and hydrogel microsphere ) 是由 包春燕 薛源 汪晨曦 周耀武 王学斌 杨会婷 项艳鑫 冯梦婷 朱麟勇 于 2020-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种含有二硫键的双重响应功能分子,结构通式如下所示：<Image he="129" wi="635" file="DDA0002545042120000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>本发明还提供了一种由含有二硫键双重响应功能分子制备的双重响应水凝胶微球,直径可在50-500μm之间调控。本发明还提供了一种所述双重响应水凝胶微球作为细胞培养载体,能够用于粘附型细胞的黏附、扩增和非酶收获,实现在大规模培养细胞中的应用。(The invention discloses a double-response functional molecule containing a disulfide bond, which has the following structural general formula: the invention also provides a preparation method of the double-response functional molecule containing the disulfide bondThe diameter of the dual-response hydrogel microsphere can be regulated and controlled between 50 and 500 mu m. The invention also provides a dual-response hydrogel microsphere as a cell culture carrier, which can be used for adhesion, amplification and non-enzymatic harvesting of adhesion cells and realizes application in large-scale cell culture.)

一种含有二硫键的双重响应功能分子、水凝胶微球的制备方 法及应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种含二硫键的双重响应功能分子、双重响应水凝胶微球及其作为细胞载体在细胞大规模培养中的应用。

背景技术

随着细胞生物学、生化制剂、组织工程等生物医药领域的不断发展，对细胞基质的需要越来越大，迫切需要发展大规模培养细胞的技术。传统的实验室细胞培养方法形式多样且都能实现较好的实验培养目的，但当应用到工业细胞培养上则存在许多弊端。例如细胞的滚筒培养，细胞只能在滚筒内壁上贴附一层，滚筒壁的面积极大地限制了细胞的培养规模。同时，细胞的分离方法要应用酶消化或机械分离，容易引起传代细胞的干性丧失。特别是酶消化，通过去除细胞黏附所需表面蛋白和离子使细胞脱落，对细胞损伤比较大(Nikul G.Patel.,at el.(2012)Acta Biomaterialia 8(7):2559-2567)。因此，为了提高细胞的大规模培养，需要对细胞培养材料和分离方法进行改进。

针对二维细胞培养的缺点，三维空间的细胞培养除能提供更大的培养空间外，它使细胞更像在体内一样生长在三维空间里。水凝胶由于其高含水量以及和细胞外基质相类似的微观结构被认为是最具竞争的细胞支架材料。但受到氧气扩散的限制(最大为200微米，De Vos P.,et al.(2012).Adv.Drug Deliv.Rev.67–68C:15–34)，水凝胶内部常常因为孔隙率低而不适用于大规模细胞培养。于是，水凝胶微球表面细胞培养技术应运而生。微球技术可以模拟3D细胞培养环境，具有高比表面积，为细胞提供黏附位点实现大规模细胞培养，使细胞附着率高达10⁸个/mL(Peng L.,et al.(2011).Hepatology 54(3):820–828)。温度敏感的聚N异丙基丙烯酰胺(PNIPAAM)水凝胶微球是目前为止最常用于细胞黏附和分离的培养材料(一种干细胞大规模培养方法，公开号为CN104894063A的专利申请；TamuraA.et al.Biomaterials,2012,33,3803-3812)。利用其温敏可逆相转变的特性，可在相转变临界温度之上通过疏水作用实现细胞的黏附，然后降低温度到相转变临界温度之下时因亲水性的转变实现细胞的脱附。虽然该类材料无需酶的作用仅通过温度的调控实现了细胞的黏附与脱离，但为了满足细胞的生存温度，需要严格调控材料的相转变温度。因此，急需刺激响应的微凝胶材料来实现细胞的大规模培养，以弥补温敏类微凝胶技术的不足。

温和的还原和光刺激响应已被广泛应用于生物材料的功能化。因此，利用光和还原的温和刺激调控水凝胶微球表面的性质，就有可能实现细胞的黏附、生长与脱离，为三维细胞大规模培养提供可能。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种含有二硫键和光反应基团的双重响应功能分子。

本发明的第二个目的是提供一种含所述双重响应功能分子的水凝胶微球的制备方法，利用光和还原双重响应性，制备的双重响应水凝胶微球可调控细胞在该水凝胶微球表面的黏附和脱离，该材料能够模拟细胞外基质通过调控黏附蛋白的吸附与解离，介导细胞的黏附与脱离，以解决现有细胞脱离过程中使用酶消化所造成的细胞损伤的技术问题。

本发明的第三个目的是提供一种含所述双重响应功能分子的水凝胶微球在粘附型细胞大规模培养中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面提供了一种含有二硫键的双重响应功能分子，结构通式如下所示：

其中，X、Y各自独立的选自以下结构的一种：亚烷基、-O(CH₂)_m-、-(CH₂)_mO(CH₂)_n-、-(CH₂CH₂O)_m-、-(CH₂)_m(CH₂CH₂O)_n-、-(CH₂)_m(CH₂CH₂O)_nO-、-(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_nO-、-COO(CH₂)_m-、-OCO(CH₂)_m-、-(CH₂)_mCOO(CH₂)_n-、-(CH₂)_mOCO(CH₂)_n-、-CO₃(CH₂)_m-、-(CH₂)_mCO₃(CH₂)_n-、-NHCO(CH₂)_m-、-CONH(CH₂)_m-、-(CH₂)_mNHCO(CH₂)_m-、-(CH₂)_mCONH(CH₂)_n-、-NHCONH(CH₂)_m-、-(CH₂)_mNHCONH(CH₂)_n-、-(CH₂)_mNHCO(CH₂)_nO-；

X、Y可以相同也可以不同；

m≥0，n≥0；m、n均为整数；

R₁是可以与水凝胶微球成分发生化学反应的功能基团，选自以下结构中的一种：丙烯酸酯基、甲基丙烯酸酯基、巯基、氨基、羧基、叠氮基、苯乙烯基、丙炔基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、四氮唑基、乙烯基、甲醛基、CH₂CHCONH-、CH₂CHCH₂CONH-、C4～C18芳基、至少含有一个羟基、烷基或硝基的C4～C18芳基、C1～C18烷基取代或未取代的C2～C8杂环基、含有C2～C8杂环基的醚基；

R₂为可与生物活性因子发生共价键连的光反应基团，选自以下结构中的一种：

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇各自独立的选自以下结构的一种：氢、卤素、羟基、巯基、氨基、硝基、氰基、甲醛基、酮基(如：-COCH₃)、酯基(如：-COOCH₃)、酰胺基(如：-CONHCH₃)、磷酸基、磷酸酯基(如：-PO₄(CH₃)₂)、磺酸基(-SO₃H)、磺酸酯基(如：-SO₂OCH₃)、砜基(如：-SO₂CH₃)、亚砜基(如：-SOCH₃)、烷基、烷氧基。

上面给出的通式的定义中，汇集所用术语一般定义如下：

术语亚烷基为具有1-20个碳原子的饱和或不饱和脂肪族支链或支链的亚烷基，如-CH₂-、-CH₂CH₂-等。

术语C4～C18芳基是指单、二或三环烃化合物，其中至少一个环为芳香环，每个环含最多7个碳原子，例如，苯基等。

术语至少含有一个羟基、烷基或硝基的C4～C18芳基是指芳基上的至少一个氢被羟基、烷基或硝基取代的芳基，如

术语C1～C18烷基取代的C2～C18杂环基；如2-甲基环氧乙烷基、2-甲基呋喃基等。

术语未取代的C2～C18杂环基如环氧乙烷基、呋喃基等。

术语含有C2～C8杂环基的醚基如

术语卤素是指F、Cl、Br、I。

术语烷基是指含1至18个碳原子的直链或支链饱和脂肪烃基团，例如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基等。

术语烷氧基是指含1至18个碳原子的烷基末端连有氧原子的基团，例如：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基等。

较优选的，所述含有二硫键的双重响应功能分子的通式中，R₁选自以下结构中的一种：

X选自以下结构：

Y选自以下结构中的一种：

X、Y中，n5、n6、n7均为1-8的整数，n5优选为2，n6优选为2，n7优选为1或2；

R₂为以下结构中的一种：

更最优选的，所述含有二硫键的双重响应功能分子为以下结构中的一种：

其中，n5，n6和n7为1-8的整数。

最优选的，所述含有二硫键的双重响应功能分子为以下结构中的一种：

本发明的第二个方面提供了一种含所述双重响应功能分子的水凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：

将双重响应功能分子2～40mg溶解于0.1～1000mL去离子水中，加入成胶组分20～400mg混合均匀，获得固含为0.1～30％的含双重响应功能分子0.0001～0.1mM的水凝胶前体溶液；

或，将标记有双重响应功能分子的水溶性大分子2～40mg溶解于0.1～1000mL去离子水中混合均匀，获得固含为0.1～30％的含双重响应功能分子0.0001～0.1mM的水凝胶前体溶液；

氮气氛中，加入引发剂或引发助剂涡旋混合均匀，滴入含司班80的石蜡油中反应，将聚合后的微球过滤、透析，获得含所述双重响应功能分子的水凝胶微球。

所述成胶组分为水溶性乙烯、丙烯类单体、可聚合的水溶性大分子中的至少一种；优选为聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)中的至少一种或几种的混合物。所述可聚合的水溶性大分子选自乙烯基、丙烯酸酯功能化的透明质酸、聚乙二醇、壳聚糖、琼脂糖、纤维素、葡聚糖、海藻酸等，其中乙烯基、丙烯酸酯标记率为5-90％。

所述标记有双重响应功能分子的水溶性大分子为标记有双重响应功能分子的透明酸水溶性大分子(HANB)。

所述标记有双重响应功能分子的透明酸水溶性大分子(HANB)的制备方法包括以下步骤：将摩尔比为1:1:(1～5):(1～5)的含有二硫键的双重响应功能分子、丙烯酸酯功能化的透明质酸(HAMA)、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混合，溶于0℃溶于无水二氯甲烷中，恢复至室温反应，反应结束透析、经冷冻干燥，获得所述标记有双重响应功能分子的透明酸水溶性大分子(HANB)。

所述丙烯酸酯功能化的透明质酸(HAMA)的制备方法包括以下步骤：

将摩尔比为1:1的透明质酸化合物HA和甲基丙烯酸酐化合物a21溶于去离子水中，滴加氢氧化钠溶液使透明质酸体系pH值保持在7～9，于30～50℃条件下反应1～12h，在去离子水中透析、冷冻干燥，获得所述丙烯酸酯功能化的透明质酸(HAMA)。

所述引发剂或引发助剂为过硫酸钾、过硫酸铵、四甲基乙二胺中的至少一种，优选为摩尔比为1:1的过硫酸铵和四甲基乙二胺的混合物。

所述司班80在石蜡油中的体积比为0.1-1％。

所述水凝胶前体溶液和含司班80的石蜡油的体积比值为0.01-0.4。

所述滴入含司班80的石蜡油中反应的转速为100-1000rpm，时间为30-120min。

所述含双重响应功能分子的水凝胶微球的粒径控制在50-500μm，粒径分布均一，具有良好的单分散性(分散性指数PDI小于0.1)，力学性能优良，可在-20度冰箱中长期保存。

本发明的第三个方面提供了一种含所述双重响应功能分子的水凝胶微球在粘附型细胞大规模培养中的应用。

所述应用包括以下步骤：

含双重响应功能分子的水凝胶微球表面通过光照共价固定生物活性因子，细胞通过生物活性因子粘附在水凝胶微球表面并实现大规模扩增，通过还原剂的加入使细胞从水凝胶微球表面得到无酶温和释放，实现大规模细胞的培养与捕获。

所述生物活性因子可以为具有良好生物相容性的细胞黏附蛋白(如胶原蛋白、纤维黏连蛋白、层连蛋白、玻连蛋白、明胶等)、多糖(如壳聚糖等)、多肽(如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸RGD黏附肽等)、多聚赖氨酸、抗体、酶、细胞生长因子等。优选的，所述生物活性因子为能与细胞表面整合素发生亲和作用的粘附蛋白和肽，如胶原、明胶、RGD短肽等。

所述还原剂可以为具有良好生物相容性的还原性分子，如还原性谷胱甘肽(GSH)、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、二硫苏糖醇、半胱氨酸等，优选的，所述还原剂为高效率高生物相容性的还原性谷胱甘肽或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，具体使用中，还原剂溶液用氢氧化钠水溶液调中性。

所述含双重响应功能分子的水凝胶微球表面通过光照共价固定生物活性因子是通过光刺激光亲和基团与孵育的生物活性因子共价键连而得，优选实现方式可以采用以下方法实现：

将含双重响应功能分子的水凝胶微球进行定量光照，光照后的含双重响应功能分子的水凝胶微球浸泡于溶有生物活性因子的溶液中，浸泡后取出材料，用缓冲溶液清洗或置换以除去非共价方式结合在材料表面的生物活性分子，获得固定有生物活性因子的含双重响应功能分子的水凝胶微球。

所述缓冲溶液可以用DPBS溶液、PBS溶液、Tris-buffer溶液、CBS溶液或去离子水，优选DPBS溶液。

所述光照采用光源的波长根据所选光亲和基团的吸收来确定，可以为250-500nm，优选为300-400nm，光强优选为5-50mW/cm²，进一步优选为10mW/cm²，照射时间1-15分钟，优选为2分钟。

所述溶有生物活性因子的溶液的浓度为0.005-0.5mg/mL，浸泡时间为0.5-30h，优选3h。

所述细胞通过生物活性因子粘附在水凝胶微球表面并实现大规模扩增如下：将固定生物活性因子的含双重响应功能分子的水凝胶微球置于无血清的DMEM培养基中平衡，平衡后的水凝胶微球加入至24抗黏附孔板，加入分散的粘附型HUVEC细胞，使体系中细胞个数为2×10⁴个/mL，进行培养，培养条件为DMEM高糖培养基，10％胎牛血清，1％双抗，于37℃，5％的CO₂无菌培养环境，且细胞实验均在无菌条件下进行。

所述通过还原剂的加入使细胞从水凝胶微球表面得到无酶温和释放过程中，是通过还原剂的加入使含双重响应功能分子的水凝胶微球上二硫键断裂，进而使含双重响应功能分子的水凝胶微球表面共价固定的生物活性因子从表面脱离，从而使含双重响应功能分子的水凝胶微球表面黏附的细胞得到释放，还原剂刺激的含双重响应功能分子的水凝胶微球表面释放细胞的优选实现方式可以采用以下方法实现：

还原性培养基与表面黏附有细胞的含双重响应功能分子的水凝胶微球共培养，使黏附的细胞得到释放，培养条件为37℃和5％的CO₂；将释放后的细胞进行收集并用新的细胞生长培养基进行培养或冻存以备后续应用。

所述还原性培养基是通过将无菌还原剂加入到无血清培养基中，并调节pH至中性得到还原性培养基；还原剂的浓度根据加入的还原剂来确定，优选为10-60mg/mL；还原剂加入后的培养时间根据加入的还原剂来确定，优选为120分钟。

对释放后的细胞的收集方法可以通过离心或细胞过滤器收集释放后的细胞，在一个优选的实施方式中，所述细胞收集方法为离心收集释放后的细胞。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明以二硫键作为双重响应功能分子的固定结构，并在其一端引入光亲和功能基团，使该分子同时具备对光刺激和还原刺激的响应效果，在其另一端引入可与水凝胶微球组分发生化学反应的基团，使该双重响应分子能够修饰到水凝胶成胶组分上或能够与成胶组分共聚形成水凝胶微球。

本发明所述的双重响应水凝胶微球大规模培养细胞的方法，不仅能实现细胞在体外的大规模增殖，还能对增殖的细胞进行收集应用。通过本发明方法大规模收集的细胞具有高活性和增殖性，可以应用于受损组织和器官的修复。通过本发明大规模收集的细胞形态完整，可以用大规模培养特殊功能细胞以制备功能性蛋白等。

本发明制备的双重响应水凝胶微球生物相容性好；模拟细胞外基质中细胞黏附机理，通过光刺激键连生物活性分子实现细胞的黏附、扩增，并通过温和的还原反应解离生物活性分子实现细胞的释放，整体细胞黏附和释放方案温和、有效，不用酶消化而收获细胞，避免细胞表面蛋白的受损。

本发明制备的双重响应水凝胶微球实现三维细胞培养，增加了细胞生长空间，提高了细胞培养效率，最优结果为，培养5天后，细胞附着率从2×10⁴个/mL增至3.6-6.8×10⁷个/mL，扩增了1800-3400倍。与传统的温敏性微球培养材料相比，所有操作条件均可在细胞培养温度进行，无需温度调节。

本发明制备的双重响应水凝胶微球可以控制细胞黏附和脱离，通过将双重响应功能分子引入水凝胶微球而制得。利用第一重响应光偶合反应实现微球表面黏附蛋白的吸附，从而介导细胞的黏附、增殖；然后，通过第二重二硫键还原响应实现黏附蛋白的解离，从而介导细胞的脱离；最终，通过简单调控细胞黏附、增殖和脱离在比表面积大的微球表面实现细胞三维空间的大规模培养。本发明采用的原料生物相容性好，通过蛋白的吸附与解离实现细胞的黏附与脱落，避免使用胰酶，减少细胞损伤，在大型细胞培养、组织修复领域有重大应用价值。

附图说明

图1是实施例7制备的含ANB-1双响应功能分子的水凝胶微球的示意图。

图2是实施例9中表面固定Rho-Gel蛋白的水凝胶微球照片示意图。

图3是实施例9中细胞增殖培养5天后水凝胶微球照片示意图，左为荧光场，右为明场。

图4是实施例9中加入GSH还原释放细胞后的水凝胶微球表面照片示意图。

图5是实施例9中对水凝胶微球表面释放细胞的CCK-8细胞增殖活性测试结果示意图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

双重响应功能分子的合成及水凝胶微球的制备，具体如下：

实施例1

ANB-1的合成

(1)化合物a2的合成

将化合物a1(1.5g，0.01mol)溶于100mL四氢呋喃中，搅拌条件下加入1.68mol/LNaOH溶液10mL和对甲基苯磺酰氯(1.9g，0.01mol)，常温反应9h。反应结束后调节pH为中性，旋转蒸发尽量除去体系中的有机溶剂，加入适量乙酸乙酯和去离子水萃取两次。有机相用无水硫酸钠干燥并浓缩溶剂，经硅胶柱提纯得到化合物a2。

化合物a2的物理参数为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.74(d,2H),7.35(d,2H),3.83(t,J＝6.24Hz,2H),3.21(t,J＝6.35Hz,2H),2.81(m,4H),2.42(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO),δ(ppm):147.53,144.67,131.52,125.56,62.54,61.96,41.83,36.88,22.47.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₁₁H₁₇O₄S₃ ⁺[M+H]⁺:309.0Found:309.0.

(2)化合物a4的合成

将3-羟基-4-甲氧基苯甲醛化合物a3(15.2g，0.1mol)和K₂CO₃(20.7g，0.15mol)加入到500mL单口圆底烧瓶中，加入200mL乙腈溶解，磁力搅拌下，加入苄溴(25.6g，0.15mol)，加热至回流反应12h。反应结束后，冷却至室温，经过抽滤去除反应体系中的盐，将得到的滤液减压蒸馏去除溶剂，得到白色固体的粗产物。将白色固体用150mL乙酸乙酯溶解，2×150mL水洗，饱和食盐水洗，分离有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋出溶剂，用石油醚/乙醇混合溶剂重结晶可得灰白色晶状化合物a4。

化合物a4的物理参数为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ(ppm):9.81(s,1H)；7.45-7.37(m,7H)；7.01(d,J＝8.6Hz,1H)；5.24(s,2H)；3.94(s,3H).¹³C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ(ppm):190.9,153.6,150.1,136.0,130.3,128.8,128.2,127.2,126.6,112.4,109.3,70.8,56.1.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₁₅H₁₄O₃Na⁺[M+Na]⁺:265.2.Found:265.2.

(3)化合物a5的合成

冰浴条件下，在250mL单口圆底烧瓶中，加入30mL浓硝酸，磁力搅拌15min。将化合物a4(8g，0.033mol)缓慢分批加入到反应烧瓶中，继续搅拌，TLC监测反应进度。反应约0.5小时结束，将反应混合物倾入500mL冷水中，抽滤，用冷水冲洗滤饼至漏斗的滤液为中性，干燥滤饼得黄色粗产物。乙醇重结晶纯化得黄色针状晶体化合物a5。

化合物a5的物理参数为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ(ppm):10.44(s,1H),7.67(s,1H),7.45-7.36(m,6H),5.26(s,2H),4.01(s,3H).¹³C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ(ppm):187.8,153.7,151.4,134.8,128.8,127.6,125.7,110.0,108.8,71.5,56.7.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₁₅H₁₄NO₅ ⁺[M+H]⁺:288.2.Found:288.2.

(4)化合物a6的合成

将化合物a5(10g，0.035mol)加入到250mL单口圆底烧瓶中，加入100mL三氟乙酸，若化合物a5未完全溶解，可加入少量二氯甲烷，在氩气保护下，室温搅拌反应9h。反应结束后，减压旋干溶剂，加入适量二氯甲烷，再减压去除溶剂，重复三次，得灰绿色粗产物。将上述粗产物用乙酸乙酯溶解，用1M NaOH调pH至5-6，水洗，分离有机相，少量乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除溶剂，得化合物a6，未做进一步纯化，直接进行下一步反应。

化合物a6的物理参数为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):11.12(s,1H),10.16(s,1H),7.51(s,1H),7.36(s,1H),3.95(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):188.3,151.7,150.9,143.7,123.3,111.0,110.5,56.3.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₈H₇NO₅Na⁺[M+Na]⁺:220.0.Found:220.0.

(5)化合物a7的合成

将化合物a6(2g，0.01mol)加入到250mL单口圆底烧瓶中，加入100mL甲醇，若化合物a6未完全溶解，可加入少量二氯甲烷，在冰浴条件下，将NaBH₄(0.76g，0.02mol)分批加入到反应烧瓶中，继续搅拌，TLC监测反应进度。反应约0.5小时结束，用1M HCl调pH至中性，减压蒸馏旋干溶剂，加入100mL二氯甲烷溶解产物，用100mL水洗有机相，用无水硫酸钠干燥后旋蒸浓缩有机相，经硅胶色谱柱(甲醇:二氯甲烷＝1:100)纯化得到淡黄色固体化合物a7。

化合物a7的物理参数为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):9.92(s,1H),7.56(s,1H),7.34(s,1H),4.79(s,2H),3.90(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):153.30,145.42,138.84,132.89,111.71,110.42,60.62,56.43.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₈H₉NO₅Na⁺[M+Na]+:222.1.Found:222.1.

(6)化合物a8的合成

将化合物a7(2g，0.01mol)、化合物a2(3.2g，0.01mol)以及10mL氢氧化钠(0.6g，0.015mol)水溶液加入到250mL单口圆底烧瓶中，加入100mL四氢呋喃，加热回流反应24h。反应结束后，将反应冷却到室温，经抽滤除去不容固体，将滤液用减压蒸馏旋干，加入少量二氯甲烷，经硅胶色谱柱(甲醇:二氯甲烷＝1:100)纯化得到化合物a8。

化合物a8的物理参数为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.77(s,1H),7.38(s,1H),4.68(s,2H),4.23(m,2H),3.78(s,3H),3.26(m,2H),2.98-76(m,4H).¹³C NMR(100MHz,DMSO),δ(ppm):156.26,148.87,140.35,129.74,126.34,112.75,73.58,60.41,56.32,40.18,37.52.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₁₂H₁₇NO₆S₂Na⁺[M+Na]⁺:358.1Found:358.1.

(7)化合物ANB-1的合成

将上述制备的化合物a8全部溶解于100mL重蒸四氢呋喃中，加入碳酸钾(1.4g，0.015mol)，冰浴条件下缓慢滴加甲基丙烯酰氯(1.2mL，0.015mol)至体系，反应12小时。反应结束后，用2×100mL水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥有机相。减压蒸馏去除溶剂，用硅胶色谱柱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得到黄色油状化合物ANB-1。

化合物ANB-1的物理参数为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.73(s,1H),7.35(s,1H),6.41(m,1H),6.13(m,1H),4.75(s,2H),4.47(m,2H),4.09(m,2H),3.78(s,3H),2.98-84(m,4H),2.02(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO),δ(ppm):166.48,156.35,148.85,140.73,131.32,129.74,128.32,126.88,112.76,73.54,63.08,60.40,56.12,37.55,36.92,17.88.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₁₆H₂₁NO₇S₂Na⁺[M+Na]⁺:426.1Found:426.1.

实施例2

NNB-1的合成路线：

(1)a10的合成

将胱胺盐酸盐化合物a9(15g，0.1mol)加入到500mL单口圆底烧瓶中，加入150mL甲醇溶解，将BOC酸酐(二碳酸二叔丁酯)(21g，0.1mol)和三乙胺(43mL，0.3mol)溶于100mL甲醇中，常温搅拌条件下缓慢滴加至烧瓶中，滴加完毕后常温搅拌反应0.5小时。反应结束后，旋干甲醇得白色固体粗产物，加入1M NaHPO₄溶液200mL，2×100mL***洗涤水相。水相用1MNaOH调节pH＝9，2×100mL乙酸乙酯萃取水相，分离有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除溶剂，即得白色固体产物化合物a10。

化合物a10的物理参数为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ(ppm):3.36(q,J＝6.27Hz,2H),2.93(t,J＝6.18Hz,2H),2.68(m,4H),1.35(s,9H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ(ppm):155.46,77.72,42.05,40.90,37.59,28.18.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₉H₂₀N₂O₂S₂Na⁺[M+Na]⁺:275.1Found:275.1.

(2)化合物a11的合成

在500mL圆底烧瓶中，将化合物a10(2.5g，0.01mol)溶于200mL无水二氯甲烷中，分别加入溴乙酸(2.1g，0.015mol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC，2.9g，0.015mol)、DMAP(催化量)和三乙胺(2.6mL，0.015mol)，常温搅拌15分钟。将反应液用2×100mL水洗，分离有机相，用无水硫酸钠干燥后旋蒸浓缩有机相，用硅胶色谱柱(甲醇:二氯甲烷＝1:100)纯化得到白色固态化合物a11。

化合物a11的物理参数：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):4.19(s,2H),3.86(m,2H),3.19(m,2H),2.76(m,4H),1.38(s,9H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ(ppm):166.60,155.98,78.26,38.79,37.98,37.28,29.84,28.69.MS(ESI):m/z:Calcd.forC₁₁H₂₁N₂O₃S₂BrNa⁺[M+Na]⁺:395.0Found:395.0.

(3)化合物a12的合成

将化合物a7(2g，0.01mol)、化合物a11(3.2g，0.01mol)以及碳酸钾(2g，0.015mol)加入到250mL单口圆底烧瓶中，加入100mL丙酮，加热回流反应24h。反应结束后，将反应冷却到室温，经抽滤除去不容固体，将滤液用减压蒸馏旋干，加入少量二氯甲烷，经硅胶色谱柱(甲醇:二氯甲烷＝1:100)纯化得到化合物a12。

化合物a12的物理参数为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.72(s,1H),7.53(s,1H),4.63(s,2H),4.47(s,2H),3.51(t,J＝6.82Hz,2H),3.27(t,J＝6.77Hz,2H),2.88(m,4H),1.47(s,9H).¹³C NMR(100MHz,DMSO),δ(ppm):168.54,156.65,156.07,149.60,129.62,127.73,113.98,79.56,49.58,67.58,60.05,65.90,40.64,39.52,37.55,36.72,28.59.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₁₉H₃₀N₃O₈S₂ ⁺[M+H]⁺:492.1Found:492.1.

(4)化合物NNB-1的合成

在250mL三口圆底烧瓶中，将化合物a12(3.7g，0.01mol)溶解于100mL二氯甲烷:三氟乙酸＝5:1的混合溶剂中，常温搅拌反应0.5h后减压旋蒸浓缩溶剂，用硅胶色谱柱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得到化合物NNB-1。

NNB-1的物理参数为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.73(s,1H),7.23(s,1H),4.60(s,2H),4.44(s,2H),3.75(m,3H),3.50(t,J＝6.79Hz,2H),3.26(t,J＝6.80Hz,2H),2.82(m,4H).¹³C NMR(100MHz,DMSO),δ(ppm):168.37,163.69,156.86,147.93,131.75,129.87,127.24,126.08,115.70,67.79,60.49,56.58,39.85,37.70.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₁₄H₂₂N₃O₆S₂ ⁺[M+H]⁺:392.1Found:392.1.

实施例3

NAB-1的合成路线：

NAB-1的合成方法参考NNB-1的合成方法，首先按照NNB-1的合成方法中第3步制备中间体a14，然后按照第4步脱保护获得化合物NAB-1。

NAB-1的物理参数为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):6.65-6.57(m,2H),6.40-6.34(m,2H),4.45(s,2H),3.51(t,2H),3.12-2.81(m,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO),δ(ppm):167.63,158.27,136.18,122.35,114.73,62.68,39.11,38.28,36.74,35.77.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₁₂H₁₇N₅O₂S₂Na⁺[M+Na]⁺:350.1Found:350.1.

实施例4

NA-1的合成路线：

(1)化合物a16的合成：

将乙酰丙酸化合物a15(2g，0.017mol)装入圆底烧瓶并在氮气下冷却至0℃，缓慢地将7N NH₃(溶于5mL甲醇中)加入烧瓶内。3小时后，逐滴滴加5mL羟胺磺酸(3.2g，0.03mol)的无水甲醇溶液于烧瓶内，滴加完毕后将所得溶液恢复至室温并过夜反应。将反应溶液在真空条件下浓缩，并将浓缩物重悬于无水甲醇中。通过过滤除去体系中白色沉淀，将滤液通过减压浓缩，再次于无水甲醇50mL中溶解。在0℃条件下，添加三乙胺(4.3mL)和碘(2.1g，0.008mol)的无水甲醇溶液10mL至溶液呈深棕色并保持10分钟不变色，表明二氮杂环丙烷中间体氧化完成。用乙酸乙酯稀释溶液，并用1N盐酸和硫代硫酸钠的饱和水溶液多次洗涤。将体系分液并将有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩溶剂后经硅胶层析柱提纯得到化合物a16。

化合物a16的物理参数为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):10.44(s,1H),2.38-2.25(m,2H),1.85(dd,J＝9.0,6.4Hz,2H),1.11(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO),δ(ppm):178.56,28.73,28.03,24.75,19.74.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₅H₉N₂O₂ ⁺[M+H]⁺:129.1Found:129.1.

(2)NA-1的合成：

NA-1的合成方法参考实施例2制备NNB的合成方法的第二步进行缩合，然后按照第四步脱保护，获得化合物NA-1。

NA-1的物理参数为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):3.56(t,J＝6.24Hz,2H),2.98-2.82(m,6H),2.34(t,J＝6.28Hz,2H),1.60(m,2H),1.06(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO),δ(ppm):173.44,69.28,44.19,39.87,39.08,37.02,36.83,32.61,26.57.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₉H₁₉N₄OS₂ ⁺[M+H]⁺:263.1Found:263.1.

实施例5

ENB-1的合成路线：

(1)化合物a18的合成

将化合物a12(1.8g，0.005mol)加入到三口烧瓶中，加入四丁基氯化铵(催化量)，搅拌均匀后将反应液预热到40℃，搅拌下将环氧氯丙烷化合物a17(0.58g，0.01mol)滴加到反应体系中，升温至55℃，加入氢氧化钠(0.2g，0.005mol)固体反应30min，滴加1N氢氧化钠溶液至反应终点。冷却至室温后加入三氯甲烷抽滤，用盐酸调剂pH至中性，乙酸乙酯萃取产物后浓缩溶剂，经硅胶层析柱提纯得到化合物a18。

化合物a18的物理参数为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.77(d,2H),7.42(d,2H),3.86(t,J＝6.27Hz,2H),3.67-3.59(m,4H),2.75-2.71(m,6H),2.46(m,3H),2.33(m,1H).¹³C NMR(101MHz,DMSO),δ(ppm):144.43,140.37,130.55,128.53,71.58,65.32,62.93,51.33,44.28,37.95,36.40,21.38.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₁₄H₂₁O₅S₃ ⁺[M+H]⁺:365.0Found:365.0.

(2)ENB-1的合成

将化合物a18(1.8g，0.005mol)和化合物a7(1g，0.005mol)溶于100mL丙酮中，向其中加入碳酸钾(1.4g，0.01mol)固体后回流反应过夜。将反应冷却至室温后旋转蒸发除去溶剂，在乙酸乙酯和去离子水体系中萃取分液，将上层有机相分出并用无水硫酸钠进行干躁，旋转蒸发除去溶剂并经硅胶柱进行提纯得到化合物ENB-1。

ENB-1的物理参数为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.70(s,1H),7.32(s,1H),4.61(s,2H),4.23(t,J＝6.62Hz,2H),3.79(s,3H),3.67-3.61(m,3H),3.36(m,1H),2.98(m,2H),2.74-2.71(m,3H),2.36(m,1H).¹³C NMR(101MHz,DMSO),δ(ppm):156.28,148.88,140.33,129.77,128.56,112.57,73.58,71.53,65.22,60.43,56.18,52.34,44.24,37.55,36.95.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₁₅H₂₂NO₇S₂ ⁺[M+H]⁺:392.1Found:392.1.

实施例6

MAPA-1的合成路线：

(1)化合物a20的合成

a20的合成方法参考化合物NNB-1的合成方法第三步和第四步。

a20的物理参数为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.90-7.75(m,4H),7.60-7.44(m,3H),7.05-6.98(m,2H),4.47(s,2H),3.57(t,J＝6.24Hz,2H),3.07-2.68(m,6H).¹³CNMR(101MHz,DMSO),δ(ppm):194.83,167.24,165.18,138.62,136.09,132.73,131.02,130.80,128.99,114.46,67.58,40.63,39.76,38.40,37.43.MS(ESI):m/z:Calcd.forC₁₉H₂₃N₂O₃S₂ ⁺[M+H]⁺:391.1Found:391.1.

(2)化合物MAPA-1的合成

MAPA-1的合成方法参考化合物ANB-1的合成方法八步。

MAPA-1的物理参数为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.88-7.73(m,4H),7.62-7.44(m,3H),7.02-6.93(m,2H),6.45(m,1H),6.09(m,1H),5.74(m,1H),4.45(s,2H),3.50(t,J＝6.28Hz,2H),2.97-2.80(m,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO),δ(ppm):197.14,168.53,166.34,61.05,136.95,132.32,131.42,130.40,127.90,126.33,116.84,69.67,40.83,38.94.MS(ESI):m/z:Calcd.for C₂₂H₂₅N₂O₄S₂ ⁺[M+H]⁺:445.1Found:445.1.

实施例7

含ANB-1双重响应功能分子的水凝胶微球的制备

在离心管中将实施例1制备的ANB-1单体14mg溶于1mL去离子水中，并加入90mg聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)、90mg甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)以及80mg聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)，涡旋2min使其体系混合均匀，制备出固含量为27.4％、双重响应功能分子摩尔含量为0.03mM的水凝胶前体液，向前体液内通氮气15min除氧，加入100μL 2mol/L的过硫酸铵水溶液和100μ2mol/L的四甲基乙二胺水溶液，涡旋至混合均匀。将混合后的溶液匀速滴加至含有1％(体积比)司班80的石蜡油中，转速300rpm搅拌30min，将分离后的水凝胶微球经不同尺寸筛网过滤，在去离子水中透析72h后备用。制备好的水凝胶微球经共聚焦显微镜观察其直径，如图1所示，图1是实施例7制备的含ANB-1双响应功能分子的水凝胶微球的示意图。制备出的水凝胶微球直径分布在150-220μm之间，图中标尺为200μm。ANB-1微球经Zeta电位仪测得的样品的分散性指数(PDI)为0.039，证明微凝胶粒度分布集中，样品具有良好的单分散性，动态光散射(DLS)测得微凝胶平均粒径约为180μm。

实施例8

HA-NB类水凝胶微球体系的制备

(1)标记有双响应功能分子NNB-1的透明质酸大分子(HANB)的制备

丙烯酸酯功能化的透明质酸(HAMA)的制备

将1g透明质酸化合物HA溶于100mL去离子水中，将11.5mL甲基丙烯酸酐化合物a21加入到该溶液中，并滴加4mol/L氢氧化钠溶液使透明质酸体系pH值保持在8左右，于40℃条件下反应6h。将反应液经透析袋(KDa3500)在去离子水中透析3天，用冷冻干燥技术除去溶剂得到HAMA。经δ＝5.6和6.1ppm处的丙烯酸酯上的双键核磁特征峰，以δ＝1.8-2.0ppm N-乙酰氨基上甲基氢的积分为标准，通过面积对比，得到透明质酸上甲基丙烯酸酯的标记率为64.7％。

标记有双重响应功能分子(NNB-1)的透明酸水溶性大分子(HANB)的制备

将实施例2制备的NNB-1(0.33g，0.001mol)、HAMA(0.3g)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.34g，0.003mol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.57g，0.003mol)于0℃溶于10mL无水二氯甲烷中，恢复至室温反应6h。反应结束后将体系用透析袋(KDa3500)透析3天后经冷冻干燥得到HANB。经δ＝7.6和7.2ppm处的苯环上氢的核磁特征峰，以δ＝1.8-2.0ppm N-乙酰氨基上甲基氢的积分为标准，通过面积对比，得到透明质酸上NNB的标记率为3.2％。

(2)HANB水凝胶微球体系的制备

取HANB(20mg)溶于1mL去离子水制备成固含量2％含功能分子0.002mM的水凝胶前体液，并向前体液内通氮气15min除氧，加入50μL 2mol/L过硫酸铵水溶液和50μL 2mol/L四甲基乙二胺水溶液，涡旋至混合均匀。将混合后的溶液匀速滴加至含有1％(体积比)司班80的石蜡油中，转速500rpm搅拌10min，将分离后的水凝胶微球经不同尺寸筛网过滤，在去离子水中透析72h后备用。制备好的水凝胶微球经Zeta电位仪测得的样品的PDI为0.047，证明微凝胶粒度分布集中，样品具有良好的单分散性，DLS测得微凝胶平均粒径约为170μm。

双重响应水凝胶微球大规模培养细胞的应用，具体如下：

实施例9

(1)ANB-1水凝胶微球表面生物活性分子的固定

将1000颗实施例7制备的含ANB-1双重响应功能分子的水凝胶微球取出，浸泡于0.5mg/mL明胶溶液1mL中，用光强度为10mW/cm^-2、365nm波长的紫外光照射两分钟。浸泡3h后的含ANB-1双重响应功能分子的水凝胶微球用DPBS洗去表面非共价固定的蛋白，置于去离子水中平衡。为了可视化证明明胶分子在水凝胶微球表面的固定，同时选用罗丹明标记的明胶(Rho-Gel)进行光刻固定实验，如图2图所示，图2是实施例9中表面固定Rho-Gel蛋白的水凝胶微球照片示意图。球表面均匀的红色荧光表明含ANB-1双重响应功能分子的水凝胶微球表面完全被Rho-Gel所包裹(图中标尺为200μm)，实现了生物活性分子在水凝胶微球表面的高效固定。其中Rho-Gel的制备过程如下：将1g明胶溶解于50mL去离子水中，将20mg罗丹明溶于0.5mL DMSO中并缓慢滴加至明胶水溶液，搅拌反应12h后将明胶水溶液倒入透析袋(KDa3500)透析3天，经冷冻干燥得到Rho-Gel。经生物质谱测定每个明胶分子标记有7个罗丹明分子。

(2)含ANB-1双重响应功能分子的水凝胶微球表面细胞的黏附与扩增。

将上述固定有明胶的水凝胶微球离心取出，置于无血清的DMEM培养基中平衡48h。平衡后的水凝胶微球以每毫升DMEM培养基含水凝胶微球20mg的浓度加入至24抗黏附孔板里。加入分散的粘附型HUVEC细胞，使体系中细胞个数为2×10⁴个/mL，进行培养。培养条件为DMEM高糖培养基，10％胎牛血清，1％双抗，于37℃，5％的CO₂无菌培养环境，且细胞实验均在无菌条件下进行。图3是实施例9中细胞增殖培养5天后水凝胶微球照片示意图，左为荧光场，右为明场，从图中可以看出，水凝胶微球表面均匀粘附了一层HUVEC细胞，且细胞维持高活性状态，说明所固定在水凝胶微球表面的蛋白保持生物活性且介导细胞在其表面的粘附和生长。HUVEC细胞生长5天达到微球负载饱和状态，经每个水凝胶微球负载的细胞数观察计算，水凝胶微球负载HUVEC细胞增殖5天后细胞数量约达到6.2×10⁷个/mL。

(3)水凝胶微球表面粘附细胞的释放捕获

将120mg GSH溶于1mL无血清DMEM培养基中，用2N氢氧化钠调节其pH为7.2-7.4，并用无血清DMEM稀释至60mg/mL备用。将上述细胞黏附、扩增后的水凝胶微球用无血清DMEM培养基轻洗孔板三次，将配置好的GSH培养基加入到含有水凝胶微球的24孔板中，放于培养箱中培养2h，培养条件为37℃和5％的CO₂。如图4所示，图4是实施例9中加入GSH还原释放细胞后的水凝胶微球表面照片示意图。图中可以看出，水凝胶微球上负载的细胞几乎全部脱离水凝胶微球表面，释放率超过95％，说明GSH对二硫键的还原导致微球表面固定的明胶分子解离，从而介导细胞的释放。吸取出大部分GSH培养基换为血清培养基，释放的细胞和水凝胶微球经细胞滤网过滤，将过滤后的细胞离心并在新的培养皿中正常培养增殖。发现释放后的细胞正常贴壁于细胞培养皿中，如图5所示，图5是实施例9中对水凝胶微球表面释放细胞的CCK-8细胞增殖活性测试结果示意图。图中可以看出，CCK8测试证明捕获的细胞能保持高度活性正常增殖。

实施例10

(1)HANB水凝胶微球表面生物活性分子的固定

将含1000颗实施例8制备的HANB水凝胶微球取出，浸泡于0.5mg/mL胶原蛋白水溶液中，使用10mW/cm^-2、365nm紫外光照射2min，室温放置3h。将HANB水凝胶微球用DPBS洗去表面非共价固定的蛋白，置于去离子水中平衡。经过蛋白定量实验证明胶原在HANB水凝胶微球表面的有效成功固定。

(2)HANB水凝胶微球表面细胞的黏附与扩增：

将上述固定有胶原蛋白的水凝胶微球离心取出，置于无血清的DMEM培养基中平衡48h。平衡后的水凝胶微球以每毫升DMEM培养基含水凝胶微球20mg的浓度加入至24抗黏附孔板里。加入分散的粘附型HUVEC细胞，使体系中细胞个数为2×10⁴个/mL，进行培养。培养条件为DMEM高糖培养基，10％胎牛血清，1％双抗，于37℃，5％的CO₂无菌培养环境。显微镜观察，5天后HUVEC细胞扩增满整个微球表面，经每个水凝胶微球负载的细胞数观察计算，水凝胶微球负载HUVEC细胞增殖5天后细胞数量约达到6.5×10⁷个/mL。

(3)水凝胶微球表面粘附细胞的释放捕获

将20mg TCEP溶于1mL去离子水中，用氢氧化钠调节溶液pH为7.2-7.4，将调节后的TCEP溶液用去离子水稀释至10mg/mL备用。将上述细胞黏附、扩增后的水凝胶微球用无血清DMEM培养基轻洗孔板三次，将配置好的TCEP培养基加入到含有水凝胶微球的24孔板中，放于培养箱中培养2h，培养条件为37℃和5％的CO₂。经过滤分离后，证明92％的细胞已从微球表面脱落，脱落的细胞保持良好活性，可在细胞培养皿中进行正常的培养和增殖生长。

对比例1

温敏的PNIPAM水凝胶微球用于大规模细胞培养：

将N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单体(0.11g，0.01mol)、交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)(0.03g，0.002mol)溶于1mL去离子水中，体系中通入15min氮气除去氧气，制备出固含量为14％的水凝胶前体液，向水凝胶前体液中加入70μL 2mol/L的APS水溶液和70μL2mol/L的TEMED水溶液，涡旋至混合均匀。将混合后的溶液匀速滴加至含有1％(体积比)司班80的石蜡油中，转速300rpm搅拌30min，将分离后的水凝胶微球经不同尺寸筛网过滤，限制水凝胶微球粒径在150-250μm，将筛选后的水凝胶微球在去离子水中透析72h后备用。

将PNIPAM微球置于无血清的DMEM培养基中平衡48h，平衡后的水凝胶微球以每毫升DMEM培养基含水凝胶微球20mg的浓度加入至24抗黏附孔板里。加入分散的HUVEC细胞，使体系中细胞个数为2×10⁴个/mL，将细胞放置于37℃条件下进行粘附，12h后将未粘附的细胞筛选取出。经24h培养增殖后，培养有细胞的水凝胶微球经细胞染色处理后于激光共聚焦显微镜下观察细胞在水凝胶微球表面的粘附生长情况，结果显示PNIPAM水凝胶微球培养的细胞活性良好但黏附率不足85％。经PNIPAM微球培养细胞三天后，将粘附在微球上的细胞放置于20℃进行细胞释放2h，细胞的释放率只能达到85％。将释放后的细胞培养一天后染色并用共聚焦显微镜观察其生长状况，结果显示细胞存活状态良好。将细胞培养五天后进行细胞增殖统计，细胞扩增约750-1200倍。结果表明，温敏型PNIPAM水凝胶微球通过疏水性非共价作用促进细胞粘附，黏附率和细胞扩增率都比本发明的低。

对比例2

GelMA水凝胶微球用于细胞大规模培养：

将20mg GelMA溶解于1mL去离子水中，通入氮气15min除去其中氧气，向其中加入50μL 2mol/L的APS水溶液和50μL 2mol/L的TEMED水溶液，涡旋至混合均匀。将混合后的溶液匀速滴加至含有1％(体积比)司班80的石蜡油中，转速300rpm搅拌30min，将分离后的水凝胶微球经不同尺寸筛网过滤，限制GelMA微球粒径在150-250μm，将筛选后的水凝胶微球在去离子水中透析72h以除去小分子后备用。

将GelMA微球置于无血清的DMEM培养基中平衡48h，平衡后的水凝胶微球以每毫升DMEM培养基含水凝胶微球20mg的浓度加入至24抗黏附孔板里。加入分散的HUVEC细胞，使体系中细胞个数为2×10⁴个/mL，将细胞放置于培养箱中进行粘附。经24h培养增殖后，培养有细胞的水凝胶微球经细胞染色处理后于激光共聚焦显微镜下观察细胞在水凝胶微球表面的粘附生长情况，观察结果表明GelMA微凝胶共培养的细胞均黏附于GelMA微凝胶表面且存活率高。经过GelMA水凝胶微球培养三天后，将细胞培养基取出并换为胰蛋白酶溶液进行细胞释放，条件为37℃培养2min，经显微镜观察细胞释放率不足80％。将释放后的细胞培养一天后染色观察，发现细胞存活率不足85％。将细胞培养五天后进行细胞增殖统计，5天后细胞约扩增1900-3400倍。结果表明，GelMA水凝胶微球可以促进细胞黏附及增殖，但胰蛋白酶对细胞的释放带来一定的细胞损伤。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。