一种多肽分子及其应用
阅读说明：本技术 一种多肽分子及其应用 (Polypeptide molecule and application thereof ) 是由 陈超 林树珊 李玉 李晓平 陈小锋 李文佳 刘亮 付正 于 2020-03-04 设计创作，主要内容包括：本申请提供了一种FGF21多肽,其具有下述性能中的一种或多种：结构稳定,半衰期较长；免疫原性较低；生物活性效力高；可增强降糖活性及降脂活性。本申请还提供了一种融合蛋白或免疫缀合物,其包含本申请所述的FGF21多肽。(The present application provides an FGF21 polypeptide having one or more of the following properties: the structure is stable, and the half-life period is longer; the immunogenicity is low; the biological activity efficacy is high; can enhance the activity of reducing blood sugar and blood fat. The present application also provides a fusion protein or immunoconjugate comprising the FGF21 polypeptide described herein.)
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种多肽分子及其应用。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一种由小肠L细胞分泌的肠促胰素，其可以刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，从而维持病患体内胰岛素的平衡。GLP-1通过胰岛素间接起作用，仅对二型糖尿病起作用，限制了其应用范围及效果；同时有报道指出GLP-1存在潜在的致甲状腺癌风险。
FGF21属于FGF家族(fibroblast growth factors，FGFs)成员之一。FGF21可以促进脂肪细胞对葡萄糖的吸收，增强胰岛素敏感性，同时与胰岛素相比，FGF21不会引起低血糖等副作用，更能有效保护β胰岛细胞，促进胰岛β细胞的再生与修复，而且由于没有促***活性，也不会导致潜在的肿瘤风险。FGF21有希望成为治疗1型糖尿病的药物。此外，FGF21也有很好的降脂作用，是一个很有潜力的降脂药。
然而，FGF21在成药性方面也面临着巨大的挑战。这一方面是由于FGF21的半衰期很短，在小鼠模型中其半衰期仅为一小时左右(Xu et al.，2009)。另一方面，FGF21在体内的生物学活性也有限。因此，亟需对FGF21进行改造。
发明内容
本申请提供了一种FGF21多肽，其至少具有下述特点的一种或多种：(1)结构稳定，半衰期较长；(2)免疫原性较低；(3)生物活性效力高；(4)可增强降糖活性及降脂活性。
一方面，本申请提供了一种FGF21多肽，其与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，在下述位置处包含氨基酸取代：L98、S167、P171、R175和R19。
在某些实施方式中，所述FGF21多肽还在选自下组的一个或多个位置处包含氨基酸取代：R135、A180、A31和G43。
在某些实施方式中，所述FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，在选自下列组的氨基酸残基处包含氨基酸取代：(1)L98、S167、P171、R175和R19；(2)L98、S167、P171、R175、R19和R135；(3)L98、S167、P171、R175、R19和A180；(4)L98、S167、P171、R175、R19、A31和G43；以及，(5)L98、S167、P171、R175、R19、R135、A31和G43。
在某些实施方式中，所述L98处的氨基酸取代为L98R。
在某些实施方式中，所述S167处的氨基酸取代为S167H。
在某些实施方式中，所述P171处的氨基酸取代选自P171A、P171G和P171N。
在某些实施方式中，所述R175处的氨基酸取代为R175L。
在某些实施方式中，所述R19处的氨基酸取代为R19V。
在某些实施方式中，所述FGF21多肽还包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：R135V、A180E、A31C和G43C。
在某些实施方式中，所述FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，包含选自下列组的氨基酸取代：(1)L98R、S167H、P171A、R175L和R19V；(2)L98R、S167H、P171G、R175L和R19V；(3)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V和R135V；(4)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V和A180E；(5)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V和R135V；(6)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V、A31C和G43C；(7)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V、A31C和G43C；(8)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V、R135V、A31C和G43C；(9)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V、R135V、A31C和G43C；以及，(10)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V和A180E。
在某些实施方式中，所述多肽包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:2-11。
另一方面，本申请提供了一种融合蛋白或免疫缀合物，其包含本申请所述的FGF21多肽。
在某些实施方式中，所述的融合蛋白或免疫缀合物还包含免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域位于所述FGF21多肽的C端。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域为人IgG的Fc或其功能性变体。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:12-13。
在某些实施方式中，所述融合蛋白还包含连接子。在某些实施方式中，所述连接子为肽连接子。
在某些实施方式中，所述连接子的N端与所述免疫球蛋白Fc结构域的C端连接，且所述连接子的C端与所述FGF21多肽的N端连接。
在某些实施方式中，所述连接子包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白或免疫缀合物包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:17-26。
在某些实施方式中，所述的融合蛋白或免疫缀合物还包含GLP-1或其功能性变体。在某些实施方式中，所述GLP-1或其功能性变体包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQIDNO:14-15。
在某些实施方式中，所述的融合蛋白或免疫缀合物还包含免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域位于所述FGF21多肽的C端。
在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域为人IgG的Fc或其功能性变体。所述免疫球蛋白Fc结构域包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:12-13。
在某些实施方式中，所述的融合蛋白或免疫缀合物还包含连接子。在某些实施方式中，所述连接子为肽连接子。
在某些实施方式中，所述连接子包括第一连接子，所述第一连接子的N端与所述Fc的C端连接，且所述第一连接子的C端与所述FGF21多肽的N端连接。在某些实施方式中，所述连接子包括第二连接子，所述第二连接子的N端与所述GLP-1或其变体的C端连接，且所述第二连接子的C端与所述Fc的N端连接。
在某些实施方式中，所述第一连接子和所述第二连接子各自独立地包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:16。
在某些实施方式中，所述的融合蛋白或免疫缀合物包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:27-36。
另一方面，本申请提供了一种分离的核酸分子，其编码本申请所述的FGF21多肽和/或本申请所述的融合蛋白或免疫缀合物。
另一方面，本申请提供了一种载体，其包含本申请所述的分离的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含或表达本申请所述的FGF21多肽、本申请所述的融合蛋白或免疫缀合物、本申请所述的分离的核酸分子或本申请所述的载体。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本申请所述的FGF21多肽、本申请所述的融合蛋白或免疫缀合物、本申请所述的分离的核酸分子、本申请所述的载体、或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
在某些实施方式中，本申请所述的FGF21多肽、本申请所述的融合蛋白或免疫缀合物用于制备治疗药物的用途，所述药物用于治疗由FGF21的代谢失调引起的疾病。在某些实施方式中，根据本申请所述的用途，其中所述FGF21的代谢失调引起的疾病包括糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本公开的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本公开的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本公开的内容使得本领域技术人员能够对所公开的
具体实施方式
进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示了本申请所述FGF21多肽SDS-PAGE电泳检测结果
图2显示了本申请所述融合蛋白的结构示意图。
图3A-图3H显示了本申请所述融合蛋白的质谱检测图。
图4A-图4B显示了本申请所述融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果。
图5A-图5B显示了本申请所述融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果。
图6显示了本申请所述融合蛋白对db/db小鼠血糖的影响的比较结果。
图7A-图7D显示了本申请所述融合蛋白的质谱检测图。
图8显示了本申请所述融合蛋白对db/db小鼠体重的影响的比较结果。
图9显示了本申请所述融合蛋白对db/db小鼠血糖的影响的比较结果。
图10显示了本申请所述融合蛋白对db/db小鼠体重增长率的影响的比较结果。
图11显示了本申请所述融合蛋白对db/db小鼠摄食量的影响的比较结果。
图12显示了本申请所述融合蛋白对db/db小鼠总胆固醇的影响的比较结果。
图13显示了本申请所述融合蛋白对db/db小鼠空腹血糖的影响的比较结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。本申请提供了一种FGF21多肽，其结构稳定，半衰期较长；免疫原性较低；生物活性效力高；可增强降糖活性及降脂活性。
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
在本申请中，术语“FGF21多肽”通常是指成纤维细胞生长因子21(FGF21基因，Fibroblast growth factor 21)编码的蛋白质。在本申请中，所述FGF21多肽可以为人(Homo sapiens)FGF21，其氨基酸序列的NCBI参考序列号为NP_061986.1。由FGF21基因编码的蛋白质是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的成员，是内分泌亚家族的成员之一。FGF21是FGF21受体的主要内源性激动剂，其由共受体FGF受体1和β-Klotho组成。
在本申请中，当描述序列中氨基酸残基的取代时，表述“XnY”通常表示序列中第n位的残基X被残基Y取代。例如，氨基酸取代“R175L”表示，序列中第175位的残基R被残基L取代。在本申请中，术语“R19”通常是指天然FGF21的氨基酸序列的第19位氨基酸残基R。在本申请中，所述天然FGF21的为人野生型FGF21，其氨基酸序列的NCBI参考序列号为NP_061986.1；成熟的FGF21序列较FGF21野生型缺少前导序列，其含有181个氨基酸。在本申请中，术语“天然FGF21序列”通常是指成熟的人FGF21序列，其氨基酸序列可以如SEQ ID NO:1所示。
在本申请中，术语“免疫球蛋白Fc结构域”通常是指包含免疫球蛋白(例如，抗体)的CH2和CH3恒定区部分的结构域。例如，所述免疫球蛋白Fc结构域可以为由免疫球蛋白(例如，抗体)的铰链区、CH2和CH3恒定区部分组成的结构域。例如，所述免疫球蛋白可以为人免疫球蛋白。例如，所述免疫球蛋白可以为人IgG1。
在本申请中，术语“功能性变体”通常是指在目标蛋白(例如所述FGF21多肽、所述融合蛋白或免疫缀合物、所述免疫球蛋白Fc结构域或所述GLP-1)的氨基酸序列的基础上进行取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，然而仍保留至少一个该目标蛋白的生物学特性的蛋白质或多肽。在本申请中，所述“一个或多个”氨基酸替换中的“多个”通常是指大于1个氨基酸的替换。例如，1～30个、1～20个、1～10个、1～5个、如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、或30个氨基酸的替换。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或***而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性。例如，所述取代可以为保守取代。
在本申请中，所述功能性变体还可以为所述目标蛋白(例如所述FGF21多肽、所述融合蛋白或免疫缀合物、所述免疫球蛋白Fc结构域或所述GLP-1)的同源物。在本申请中，所述同源物可以为，例如，与所述目标蛋白的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
在本申请中，术语“融合蛋白”通常指由两个或更多个蛋白或多肽融合得到的蛋白。在本申请中，所述的融合蛋白可包含所述的FGF21多肽。编码所述两个或更多个蛋白或多肽的基因或核酸分子可彼此连接而形成融合基因或融合的核酸分子，该融合基因或融合的核酸分子可编码所述融合蛋白。所述融合蛋白可通过用于生物学研究或治疗的重组DNA技术人工创造。在本申请中，所述融合蛋白还可包含除所述FGF21多肽以外的结构域。在本申请中，所述的融合蛋白还可以包含连接所述FGF21多肽和所述除FGF21多肽以外的结构域的连接子，和/或其他结构域。
在本申请中，术语“连接子”通常是指可通过肽键连接两个或多个多肽的功能性结构。在本申请中，术语“连接子”、“linker”和“接头”可互换使用。当形成本申请的融合蛋白时，可以使用连接子。连接子可由通过肽键连接在一起的氨基酸构成。本申请的连接子可为任何长度或组成的连接子。在某些实施方案中，连接子可由通过肽键连接的1-20个氨基酸构成。例如，所述氨基酸可选自20种天然存在的氨基酸。在某些实施方式中，所述氨基酸可选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在某些实施方案中，所述连接子由空间上不受阻碍的多个氨基酸构成。例如，所述空间上不受阻碍的氨基酸可以为甘氨酸和丙氨酸。所述连接子可以为富含G的多肽，例如，其可以选自(G)3-S(即“GGGS”)、(G)4-S(即“GGGGS”)和(G)5-S(即“GGGGGS”)。在一些实施方案中，所述连接子可包含GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGSA。其它合适的连接子可包括：GGGGGSGGGSGGGGS、GGGKGGGG、GGGNGSGG、GGGCGGGG和GPNGG等。本申请中所述的连接子还可为非肽连接子。例如，可以使用烷基连接子，例如-NH-(CH2)S-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基连接子可被任何无空间位阻的基团进一步取代，所述无空间位阻的基团可包括但不限于低级烷基(例如C1-C6)、低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2或苯基。示例性的非肽连接子还可以为聚乙二醇连接子，其中连接子的分子量可以为100-5000kD，例如100-500kD。
在本申请中，术语“免疫缀合物”通常是指包含所述的FGF21多肽，以及缀合至所述FGF21多肽的其他组分的缀合物。所述免疫缀合物可以是重组的多肽。在本申请中，所述缀合至所述的FGF21多肽的组分可以包括细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂和/或放射性同位素等。例如，用于形成所述缀合物的合适的细胞毒性剂和化疗剂的实例可以参见W0 05/103081。在本申请中，所述免疫缀合物还可以包含连接所述FGF21多肽和所述缀合至所述的FGF21多肽的组分的连接子，和/或其他结构域。
在本申请中，术语“GLP-1”通常指回肠内分泌细胞分泌的一种肽。在本申请中，所述GLP-1可以为人GLP-1。人GLP-1的氨基酸序列的UniProtKB/Swiss-Prot登录号为P0C6A0.1。所述GLP-1可作为2型糖尿病药物作用的靶点。GLP-1可作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录、胰岛素的合成和分泌并可刺激胰岛β细胞的增殖和分化，抑制胰岛β细胞凋亡，增加胰岛β细胞数量。
在本申请中，术语“核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR，具体操作可参见Sambrook等人，MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York N.Y.,1993。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有本申请所述的免疫缀合物，可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是HEK293细胞。在本申请中，术语“药物组合物”通常指包括活性成分与惰性或活性载体的组合，从而使该组合物适于体内或体外或离体的诊断或治疗用途。
在本申请中，术语“代谢失调引起的疾病”通常是指在体内因生物化学过程发生障碍，某些代谢物质(例如糖、脂质、蛋白质、嘌呤等)堆积或缺乏而引起的疾病。本申请所述代谢失调引起的疾病可由先天因素引起的或由后天因素引起的。所述先天因素可包括先天性遗传缺陷，例如粘脂病。所述后天因素可包括内脏的病理变化和功能障碍，例如肾功能衰竭、肾病综合征等；还可包括药物、食物在内的外界因素，例如，长期服用抗癫痫药引起的血25-羟维生素D降低，继之血中钙、磷降低，碱性磷酸酶增高；进食含过多脂肪和/或胆固醇食物引起的高脂蛋白血症、动脉硬化和胆石症。在本申请中，所述代谢失调引起的疾病可包括糖尿病、脂肪肝、肥胖和胰腺炎。
在本申请中，术语“药学上可接受的佐剂”是指药学可接受的制剂载体、溶液或加强制剂特性的添加剂。此类添加剂是所属领域技术人员熟知的。尽管任何药学可接受稀释剂是适宜的，但特别优选非肠道给药的赋形剂是盐水溶液。例如，氯化钠、甘露醇等。在本申请中，术语“IgG恒定区结构域”通常是指包括抗体重链恒定区、铰链区和抗体轻链恒定区的多肽结构域或多肽片段。所述的抗体可以是IgG抗体，例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型的抗体。在本申请中，术语IgG恒定区结构域的“片段”通常是指IgG恒定区结构域的一部分，但仍保留至少其部分活性。例如，所述片段可包括CL、CH1、铰链区、CH2和CH3中的一个或多个结构域或片段。
在本申请中，所述“第一”、“第二”只是为了在描述上进行区分，并没有其它含义。例如，所述第一连接子、所述第二连接子。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，并且在其最广泛的意义下，是指两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物亚单位组成的化合物。所述两个或更多个亚单位可通过肽键连接。在某些实施方式中，所述两个或更多个亚单位可通过其他键连接，如酯键、醚键、氨基等。蛋白质或多肽必须含有至少两个氨基酸并且对于可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有设限。在本申请中，术语“氨基酸”通常是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括氨基酸的D和L光学异构体(例如甘氨酸及其D和L光学异构体)、氨基酸类似物和肽模拟物等。
在本申请中，术语“同源性”、“同一性”或“相似性”可互换地使用，通常是指两个肽或蛋白质之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可通过比较各序列中可为比较目的来比对的位置而确定。在所比较的分子中，当其序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么这些分子在那个位置上是同源的。序列之间的同源性程度随着序列共有的匹配或同源位置的数目而变化。“无关”或“非同源的”序列表示被比较的序列间共有小于40％的同一性，或者小于25％的同一性。
在本申请中，当表示多肽的氨基酸序列同一性时，术语“至少80％序列同一性”通常是指与各参考序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在本申请中，当与数值关联使用时，术语“约”通常包括如下范围内的数值：该范围具有比所示数值小5％的下限并具有比所示数值大5％的上限。
在本申请中，术语“组合物”通常是两种或更多种物质的组合，例如，活性剂与其它惰性或活性化合物的组合。
在本申请中，术语“治疗有效量”通常指对受试者产生治疗益处所需的活性成分的最小剂量。例如，对于表现出患有或易感2型糖尿病、肥胖症或代谢综合征的患者或为预防其发病的患者而言，“治疗有效量”是指能够诱导、改进或者造成与上述紊乱相关或因与之对抗所致的病理症状、疾病进展、生理情况改善的剂量。
本申请中，术语“受试者”或“患者”可为人，但也可为非人动物，更具体而言可为同伴动物(如狗、猫等)、农场动物(如牛、羊、猪、马等)或者实验室动物(如大鼠、小鼠、豚鼠等)等。
FGF21多肽
一方面，FGF21多肽，其与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，在下述位置处包含氨基酸取代：L98、S167、P171、R175和R19。在本申请中，所述L98、S167、P171和R175可分别指SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第98位残基L，第167位残基S，第171位残基P和第175位残基R。
在本申请中，所述FGF21多肽还可在选自下组的一个或多个位置处包含氨基酸取代：R135、A180、A31和G43。在本申请中，所述R135、A180、A31和G43可分别指SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第135位残基R，第180位残基A，第31位残基A和第43位残基G。
在本申请中，所述FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，其可在选自下列组的氨基酸残基处包含氨基酸取代：(1)L98、S167、P171、R175和R19；(2)L98、S167、P171、R175、R19和R135；(3)L98、S167、P171、R175、R19和A180；(4)L98、S167、P171、R175、R19和Q173；(5)L98、S167、P171、R175、R19、A31和G43；(6)L98、S167、P171、R175、R19、R135和Q173；以及，(7)L98、S167、P171、R175、R19、R135、A31和G43。
在本申请中，所述FGF21多肽在L98处的氨基酸取代可为L98R。
在本申请中，所述FGF21多肽在S167处的氨基酸取代可为S167H。
在本申请中，所述FGF21多肽在P171处的氨基酸取代可选自P171A、P171G和P171N。
在本申请中，所述FGF21多肽在R175处的氨基酸取代可为R175L。
在本申请中，所述FGF21多肽在R19处的氨基酸取代可为R19V。
在本申请中，所述FGF21多肽还可包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：R135V、A180E、A31C和G43C。在本申请中，所述R135V、A180E、A31C和G43C可分别指SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第135位残基R可被残基V取代，第180位残基A可被残基E取代，第31位残基A可被残基C取代，第43位残基G可被残基C取代。
在本申请中，所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，可包含选自下组的氨基酸取代：(1)L98R、S167H、P171A、R175L和R19V；(2)L98R、S167H、P171G、R175L和R19V；(3)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V和R135V；(4)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V和A180E；(5)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V和R135V；(6)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V、A31C和G43C；(7)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V、A31C和G43C；(8)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V、R135V、A31C和G43C；(9)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V、R135V、A31C和G43C；以及，(10)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V和A180E。
在本申请中，所述的FGF21多肽可包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO:2-11。
例如，本申请所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比可包含L98R、S167H、P171A、R175L和R19V的氨基酸取代。例如，所述包含L98R、S167H、P171A、R175L和R19V的氨基酸取代的多肽可为FGF21-1，其序列可如SEQ ID NO:2所示。
又例如，本申请所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比可包含L98R、S167H、P171G、R175L和R19V的氨基酸取代。例如，所述包含L98R、S167H、P171G、R175L和R19V的氨基酸取代的多肽可为FGF21-2，其序列可如SEQ ID NO:3所示。
又例如，本申请所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比可包含L98R、S167H、P171G、R175L、R19V和R135V的氨基酸取代。例如，所述包含L98R、S167H、P171G、R175L、R19V和R135V的氨基酸取代的多肽可为FGF21-3，其序列可如SEQ ID NO:4所示。
又例如，本申请所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比可包含L98R、S167H、P171G、R175L、R19V和A180E的氨基酸取代。例如，所述包含L98R、S167H、P171G、R175L、R19V和A180E的氨基酸取代的多肽可为FGF21-4，其序列可如SEQ ID NO:5所示。
又例如，本申请所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比可包含L98R、S167H、P171N、R175L、R19V和Q173T的氨基酸取代。例如，所述包含L98R、S167H、P171N、R175L、R19V和Q173T的氨基酸取代的多肽可为FGF21-5。
又例如，本申请所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比可包含L98R、S167H、P171A、R175L、R19V和R135V的氨基酸取代。例如，所述包含L98R、S167H、P171A、R175L、R19V和R135V的氨基酸取代的多肽可为FGF21-6，其序列可如SEQ ID NO:6所示。
又例如，本申请所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比可包含L98R、S167H、P171A、R175L、R19V、A31C和G43C的氨基酸取代。例如，所述包含L98R、S167H、P171A、R175L、R19V、A31C和G43C的氨基酸取代的多肽可为FGF21-7，其序列可如SEQ ID NO:7所示。
又例如，本申请所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比可包含L98R、L98R、S167H、P171N、R175L、R19V、R135V和Q173T的氨基酸取代。例如，所述包含L98R、S167H、P171N、R175L、R19V、R135V和Q173T的氨基酸取代的多肽可为FGF21-8。
又例如，本申请所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比可包含L98R、S167H、P171G、R175L、R19V、A31C和G43C的氨基酸取代。例如，所述包含L98R、S167H、P171G、R175L、R19V、A31C和G43C的氨基酸取代的多肽可为FGF21-9，其序列可如SEQ ID NO:8所示。
又例如，本申请所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比可包含L98R、S167H、P171G、R175L、R19V、R135V、A31C和G43C的氨基酸取代。例如，所述包含L98R、S167H、P171G、R175L、R19V、R135V、A31C和G43C的氨基酸取代的多肽可为FGF21-10，其序列可如SEQ ID NO:9所示。
又例如，本申请所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比可包含L98R、S167H、P171A、R175L、R19V、R135V、A31C和G43C的氨基酸取代。例如，所述包含L98R、S167H、P171A、R175L、R19V、R135V、A31C和G43C的氨基酸取代的多肽可为FGF21-11，其序列可如SEQ ID NO:10所示。
又例如，本申请所述的FGF21多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比可包含L98R、S167H、P171A、R175L、R19V和A180E的氨基酸取代。例如，所述包含L98R、S167H、P171A、R175L、R19V和A180E的氨基酸取代的多肽可为FGF21-12，其序列可如SEQ ID NO:11所示。
融合蛋白或免疫缀合物
另一方面，本申请提供了一种融合蛋白或免疫缀合物，其可包含本申请所述的FGF21多肽。
a.Fc
在本申请中，所述的融合蛋白或免疫缀合物还可包含免疫球蛋白Fc结构域。在本申请中，所述免疫球蛋白Fc结构域可位于所述FGF21多肽的C端。
在本申请的所述的融合蛋白或免疫缀合物中，所述免疫球蛋白Fc结构域可以为人IgG的Fc或其功能性变体。例如，所述免疫球蛋白Fc结构域可包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:12-13。
例如，在本申请中所述免疫球蛋白Fc结构域可为人IgG的Fc(参见UniProt KB或Swiss-Prot中登录号为P01861.1的蛋白质)。所述人IgG的Fc可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述免疫球蛋白Fc结构域也可为人IgG的Fc的功能性变体。例如，所述人IgG的Fc的功能性变体可以为在所述人IgG1的Fc的氨基酸序列基础上，利用天然或非天然存在的氨基酸在特定的氨基酸残基处进行修饰而获得的多肽或蛋白质。例如，所述修饰可基于在特定位置***、替换或删除保守或非保守的一个或多个氨基酸来产生，也可包含在特定位置引入非氨基酸结构的修饰。
例如，所述免疫球蛋白Fc结构域的功能性变体可为IgG-Fc-PAAK，其可包含SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列。所述IgG-Fc-PAAK可包含S228P，F234A，L235A和R409K的突变，以及K440的删除。例如，与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列相比，所述IgG-Fc-PAAK的第228位残基S可被残基P取代，第234位残基F可被残基A取代，第235位残基L可被残基A取代，第235位残基L可被残基A取代，且第440位残基K可被删除。
b.连接子
在本申请中，所述融合蛋白还可包含连接子。在本申请中，所述连接子可以为肽连接子。在本申请中，所述连接子的N端可与所述免疫球蛋白Fc结构域的C端连接，且所述连接子的C端可与所述FGF21多肽的N端连接。在本申请中，所述连接子可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述连接子可包含第一连接子和第二连接子。例如，所述第一连接子的N端可以与所述免疫球蛋白Fc结构域的C端连接，且所述第一连接子的C端可以与所述FGF21多肽的N端连接。又例如，所述第二连接子的N端可以与所述GLP-1或其变体的C端连接，且所述第二连接子的C端可以与所述免疫球蛋白Fc结构域的N端连接。在本申请中，所述第一连接子和/或所述第二连接子可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
c.GLP-1
在本申请中，所述融合蛋白还可包含GLP-1或其功能性变体。在本申请中，所述GLP-1或其功能性变体可包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:14-15。
在本申请中，所述GLP-1或其功能性变体可为人GLP-1(其在UniProt KB或Swiss-Prot中登录号为P0C6A0.1)。所述GLP-1也可为人GLP-1的功能性变体。
例如，所述人GLP-1的功能性变体可为GLP-1-GEG，其可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。例如，所述GLP-1-GEG可包括A8G，G22E和R36G的突变。例如，与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列相比，所述GLP-1-GEG的第8位残基A可被残基G取代，第22位残基G可被残基E取代，第36位残基R可被残基G取代。
d.融合蛋白
单靶融合蛋白
在本申请中，所述融合蛋白可为单靶融合蛋白(在本申请中，可以简称为“单靶”)，即所述融合蛋白可包含所述FGF21多肽。
在本申请中，所述单靶融合蛋白或免疫缀合物还可包含免疫球蛋白Fc结构域。在本申请中，所述免疫球蛋白Fc结构域可位于所述FGF21多肽的C端。在本申请中，所述免疫球蛋白Fc结构域可为人IgG的Fc或其功能性变体。在本申请中，所述免疫球蛋白Fc结构域可包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:12-13。
在本申请中，所述单靶融合蛋白或免疫缀合物还可包含连接子。在本申请中，所述连接子可为肽连接子。在本申请中，所述连接子的N端可与所述免疫球蛋白Fc结构域的C端连接，且所述连接子的C端可与所述FGF21多肽的N端连接。在本申请中，所述连接子可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述单靶融合蛋白或免疫缀合物可包含下组中任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:17-26。
在本申请中，所述单靶融合蛋白从N端至C端可分别是FGF21多肽、连接子和免疫球蛋白Fc结构域。
例如，本申请所述单靶融合蛋白可为单靶1#(其可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列)，其可包含所述FGF21多肽FGF21-1。
例如，本申请所述单靶融合蛋白可为单靶2#(其可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列)，其可包含所述FGF21多肽FGF21-2。
例如，本申请所述单靶融合蛋白可为单靶3#(其可包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列)，其可包含所述FGF21多肽FGF21-3。
例如，本申请所述单靶融合蛋白可为单靶4#(其可包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列)，其可包含所述FGF21多肽FGF21-4。
例如，本申请所述单靶融合蛋白可为单靶5#，其可包含所述FGF21多肽FGF21-5。
例如，本申请所述单靶融合蛋白可为单靶6#(其可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列)，其可包含所述FGF21多肽FGF21-6。
例如，本申请所述单靶融合蛋白可为单靶7#(其可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列)，其可包含所述FGF21多肽FGF21-7。
例如，本申请所述单靶融合蛋白可为单靶8#，其可包含所述FGF21多肽FGF21-8。
例如，本申请所述单靶融合蛋白可为单靶9#(其可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列)，其可包含所述FGF21多肽FGF21-9。
例如，本申请所述单靶融合蛋白可为单靶10#(其可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列)，其可包含所述FGF21多肽FGF21-10。
例如，本申请所述单靶融合蛋白可为单靶11#(其可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列)，其可包含所述FGF21多肽FGF21-11。
例如，本申请所述单靶融合蛋白可为单靶12#(其可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列)，其可包含所述FGF21多肽FGF21-12。
在本申请中，所述单靶融合蛋白也可以包含其他修饰。例如，所述修饰可包括一个或多个氨基酸的替换、增加或删除，只要该单靶融合蛋白仍包含本申请的FGF21或其变体即可。
例如，经过修饰的单靶融合蛋白可为单靶RGHLQQ(其可包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列)，可为单靶RAHL(其可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列)，可为单靶RGHL(其可包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列)，也可为单靶RGE(其可包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列)。
双靶融合蛋白
在本申请中，所述融合蛋白也可为双靶融合蛋白(在本申请中，可以简称为“双靶”)，即所述融合蛋白可包含至少两个以上的结构域，例如，其包含所述FGF21多肽，还可包含GLP-1或其功能性变体。在本申请中，所述双靶融合蛋白还可以包含免疫球蛋白Fc结构域或其功能性变体。
在本申请中，所述双靶融合蛋白还可包含连接子。在本申请中，所述连接子可以为肽连接子。在本申请中，所述连接子可包含第一连接子和第二连接子。例如，所述第一连接子的N端可以与所述免疫球蛋白Fc结构域的C端连接，且所述第一连接子的C端可以与所述FGF21多肽的N端连接。又例如，所述第二连接子的N端可以与所述GLP-1或其变体的C端连接，且所述第二连接子的C端可以与所述免疫球蛋白Fc结构域的N端连接。在本申请中，所述第一连接子和/或所述第二连接子可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述双靶融合蛋白从N端至C端可分别为所述FGF21多肽、所述第一连接子、所述免疫球蛋白Fc结构域、所述第二连接子和所述GLP-1或其功能性变体。其中，所述FGF21多肽可包含选自下组中任一项所示的氨基酸序列SEQ ID NO:2-11或FGF21-1～FGF21-12；所述免疫球蛋白Fc结构域可包含选自下组中任一项所示的氨基酸序列SEQ IDNO:12-13；所述GLP-1或其功能性变体可包含选自下组中任一项所示的氨基酸序列SEQ IDNO:14-15；所述第一连接子和/或所述第二连接子可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述双靶融合蛋白可为双靶1#，其可包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，其从N端至C端可分别为GLP-1-GEG(其可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列)，第一连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列)，第二连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)和FGF21-1(其可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列)。
又例如，本申请所述双靶融合蛋白可为双靶2#，其可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，其从N端至C端可分别为GLP-1-GEG(其可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列)，第一连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其可包含SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列)，第二连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)和FGF21-2(其可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列)。
又例如，本申请所述双靶融合蛋白可为双靶3#，其可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，其从N端至C端可分别为GLP-1-GEG(其可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列)，第一连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其可包含SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列)，第二连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)和FGF21-3(其可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列)。
又例如，本申请所述双靶融合蛋白可为双靶4#，其可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，其从N端至C端可分别为GLP-1-GEG(其可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列)，第一连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其可包含SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列)，第二连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)和FGF21-4(其可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列)。
又例如，本申请所述双靶融合蛋白可为双靶5#，其从N端至C端可分别为GLP-1-GEG(其可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列)，第一连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列)，第二连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)和FGF21-5。
又例如，本申请所述双靶融合蛋白可为双靶6#，其可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，其从N端至C端可分别为GLP-1-GEG(其可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列)，第一连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其可包含SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列)，第二连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)和FGF21-6(其可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列)。
又例如，本申请所述双靶融合蛋白可为双靶7#，其可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，其从N端至C端可分别为GLP-1-GEG(其可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列)，第一连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)和IgG-Fc-PAAK(其可包含SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列)，第二连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)和FGF21-7(其可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列)。
又例如，本申请所述双靶融合蛋白可为双靶8#，其从N端至C端可分别为GLP-1-GEG(其可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列)，第一连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列)，第二连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)和FGF21-8。
又例如，本申请所述双靶融合蛋白可为双靶9#，其可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，其从N端至C端可分别为GLP-1-GEG(其可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列)，第一连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)和IgG-Fc-PAAK(其可包含SEQIDNO:13所示的氨基酸序列)，第二连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)和FGF21-9(其可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列)。
又例如，本申请所述双靶融合蛋白可为双靶10#，其可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，其从N端至C端可分别为GLP-1-GEG(其可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列)，第一连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其可包含SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列)，第二连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)和FGF21-10(其可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列)。
又例如，本申请所述双靶融合蛋白可为双靶11#，其可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，其从N端至C端可分别为GLP-1-GEG(其可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列)，第一连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其可包含SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列)，第二连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)和FGF21-11(其可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列)。
又例如，本申请所述双靶融合蛋白可为双靶12#，其可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，其从N端至C端可分别为GLP-1-GEG(其可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列)，第一连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其可包含SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列)，第二连接子(其可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)和FGF21-12(其可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列)。
在本申请中，所述双靶融合蛋白还可为双靶RAHL，其可包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；本申请所述双靶融合蛋白还可为双靶RGHL，其可包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列；本申请所述双靶融合蛋白还可为双靶RGHLQQ，其可包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；本申请所述双靶融合蛋白还可为双靶RAHLQQ，其可包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述目标蛋白(例如所述FGF21多肽、所述融合蛋白或免疫缀合物、所述免疫球蛋白Fc结构域或所述GLP-1)均可包括其功能性变体和/或其同源物。
核酸分子、载体、细胞、药物组合物
另一方面，本申请提供了一种分离的核酸分子，其可编码本申请所述的FGF21多肽和/或本申请所述的融合蛋白或免疫缀合物。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在本申请中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种载体，其可包含本申请所述的分离的核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在本申请中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其可包含或表达本申请所述的FGF21多肽、本申请所述的融合蛋白或免疫缀合物、本申请所述的分离的核酸分子或本申请所述的载体。其包含所述的融合蛋白，所述的免疫缀合物，所述的核酸分子，或所述的载体。在本申请中，每种或每个细胞可包含一个或一种本申请所述的载体。在本申请中，每种或每个细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述细胞中，例如真核细胞(例如哺乳动物细胞)。例如，所述哺乳动物细胞可以是HEK293细胞。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
药物组合物、制药用途
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其可包含本申请所述的FGF21多肽、本申请所述的融合蛋白或免疫缀合物、本申请所述的分离的核酸分子、本申请所述的载体、或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
在本申请中，所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，***给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
另一方面，本申请提供了本申请所述的FGF21多肽、本申请所述的融合蛋白或免疫缀合物用于制备治疗药物的用途，所述药物可用于治疗由FGF21的代谢失调引起的疾病。
例如，本申请的药物组合物可以抑制或延缓疾病的发展或进展，和/或可以减轻和/或稳定疾病状态。
本申请所述的药物组合物可以包含治疗有效量的所述所述FGF21多肽、融合蛋白或免疫缀合物。所述治疗有效量是能够预防和/或治疗(至少部分治疗)患有或具有发展风险的受试者中的病症或病症(例如由FGF21的代谢失调引起的疾病)和/或其任何并发症而所需的剂量。
另一方面，本申请提供了一种治疗由FGF21的代谢失调引起的疾病的方法，其包括向受试者施用本申请所述的FGF21多肽、本申请所述的融合蛋白或免疫缀合物。
另一方面，本申请提供了所述的FGF21多肽、本申请所述的融合蛋白或免疫缀合物，其治疗由FGF21的代谢失调引起的疾病。
在本申请中，所述FGF21的代谢失调引起的疾病可包括糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的嵌合抗原受体、载体、细胞、组合物的工作方式，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1 FGF21多肽的制备
1.1表达载体Plasmid-X的构建
委托苏州金唯智生物科技有限公司合成目的基因，包括FGF21-1(其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)、FGF21-7(其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)、FGF21-RHAL(与SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列相比,L98处的氨基酸取代为L98R，S167处的氨基酸取代为S167H，P171处的氨基酸取代为P171A，以及R175处的氨基酸取代为R175L)，在37℃条件下，利用内切酶HindⅢ和EcoRⅠ(TAKARA，Japan)消化处理目的基因序列和载体质粒pXC17.4，采用GelExtraction Kit试剂盒按厂商说明纯化回收消化产物。利用DNALigation Kit Ver.2.1(TAKARA，Japan)按厂商说明将纯化回收的目的基因和载体连接，16℃恒温处理1小时，得到重组表达质粒。
将上述重组表达质粒转化到感受态细胞DH5a中，取菌体涂布氨苄平板。挑取平板上的单克隆于1ml LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L和琼脂2％，抗生素含量100μg/mL)中培养后提取质粒，经苏州金唯智生物技术有限公司测序验证正确，采用Invitrogen质粒大提试剂盒提取一系列经验证正确的表达载体，用限制性内切酶PvuⅠ酶切(TAKARA，Japan)，进行线性化后利用乙醇沉淀方法纯化回收，-20℃保藏备用。
1.2载体转染及在细胞中表达
将CHO宿主细胞用Cellvento CHO-200培养基(Merck)复苏培养后，当细胞密度约4.76×106cells/mL时收集细胞进行转染。转染细胞约1×107cell，质粒约40μg，通过电击方法转染(Bio-Rad，Gene pulser Xcell)。电击后细胞于20mL Cellvento CHO-200培养基中培养。培养第二天，离心收集细胞，并在加入L-Methionine sulfoximine(Sigma-aldrich)至终浓度50μM的20mL Cellvento CHO-200培养基中重悬培养。当细胞密度约0.6×106cell/mL时，对获得的混合克隆株用Cellvento CHO-200培养基进行传代，传代细胞密度约0.2×106cell/mL。当细胞存活率约90％左右时，收集细胞培养液。
1.3融合蛋白纯化及检测
将细胞培养液在200g下离心10min，取上清在8000rpm下离心30min后，收集上清，利用Ni-charged MagBeads(L00295，金斯瑞)及Am Mag MR磁力架(L00723，金斯瑞)，对离心后的细胞培养液上清进行亲和纯化，平衡液为20mM PBS，0.5M NaCl，pH7.4；洗脱液为20mMPBS，0.5M NaCl，0.5M咪唑缓冲液pH7.4，收集目标吸收峰下蛋白洗脱液样品，同时对收集的样品经还原处理后，通过10％SDS-PAGE电泳检测，SDS检测结果见表1和图1。
表1 FGF21多肽SDS-PAGE检测结果分析
实施例2双靶融合蛋白的制备
本申请所述融合蛋白包括单靶融合蛋白和双靶融合蛋白，其结构如图2所示。
2.1表达载体Plasmid-X2的构建
委托苏州金唯智生物科技有限公司合成双靶融合蛋白的目的基因，包括双靶1#(其氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示)、双靶2#(其氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示)、双靶3#(其氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示)、双靶4#(其氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示)、双靶5#、双靶6#(其氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示)、双靶7#(其氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示)、双靶8#、双靶9#(其氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示)、双靶10#(其氨基酸序列如SEQID NO:34所示)、双靶11#(其氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示)、和双靶12#(其氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示)。
在37℃条件下，利用内切酶HindⅢ和EcoRⅠ(TAKARA，Japan)消化处理目的基因序列和载体质粒pXC17.4，采用Gel Extraction Kit试剂盒按厂商说明纯化回收消化产物。利用DNALigation Kit Ver.2.1(TAKARA，Japan)按厂商说明将纯化回收的目的基因和载体连接，16℃恒温处理1小时，得到重组表达质粒。
将上述重组表达质粒转化到感受态细胞DH5a中，取菌体涂布氨苄平板。挑取平板上的单克隆于1ml LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L和琼脂2％，抗生素含量100μg/mL)中培养后提取质粒，经广州艾基生物技术有限公司测序验证正确，采用Invitrogen质粒大提试剂盒提取一系列经验证正确的表达载体，用限制性内切酶PvuⅠ酶切(TAKARA，Japan)，进行线性化后利用乙醇沉淀方法纯化回收，-20℃保藏备用。
2.2载体转染及在细胞中表达
将CHO宿主细胞用Cellvento CHO-200培养基(Merck)复苏培养后，当细胞密度约4.76×106个细胞/mL时收集细胞进行转染。转染细胞约1×107个细胞，质粒约40μg，通过电击方法转染(Bio-Rad，Gene pulser Xcell)。电击后细胞于20mL Cellvento CHO-200培养基中培养。培养第二天，离心收集细胞，并在加入L-蛋氨酸砜亚胺(Sigma-aldrich)至终浓度50μM的20mL Cellvento CHO-200培养基中重悬培养。当细胞密度约0.6×106个细胞/mL时，对获得的混合克隆株用Cellvento CHO-200培养基进行传代，传代细胞密度约0.2×106个细胞/mL。当细胞存活率约90％时，收集细胞培养液。
2.3融合蛋白纯化及检测
将细胞培养液在200g下离心10min，取上清在8000rpm下离心30min后，收集上清，利用Protein A层析柱(EzFast Protein ADiamond，博格隆)对离心后的细胞培养液上清进行亲和纯化，平衡液为20mM PBS，0.15M NaCl，pH7.4；洗脱液为0.1M甘氨酸缓冲液pH3.2，收集目标吸收峰下蛋白洗脱液，用20mM PBS pH7.4缓冲液透析后取部分样品进行质谱检测，质谱(Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，型号G6530，Agilent Technologies)检测分子量，与理论分子量一致，且为同源二聚体形式。部分样品的质谱结果参加图3A至图3H。同时对收集的样品经还原(参见图4A)与非还原(参见图4B)后通过10％SDS-PAGE电泳检测。其结果如图4A、图4B和表2所示。其中，双靶1#的质谱结果如图3A所示，双靶2#的质谱结果如图3B所示，双靶4#和双靶5#的质谱结果如图3C所示，双靶6#的质谱结果如图3D所示，双靶7#的质谱结果如图3E所示，双靶9#的质谱结果如图3F所示，双靶10#的质谱结果如图3G所示，双靶11#的质谱结果如3H所示。
在图4A中，样品分别是：1：对照：双靶RAHL(其氨基酸序列如SEQ ID No.41所示)；2：Marker(标记物)；3：双靶1#；4：双靶2#；5：双靶3#；6：双靶4#；7：双靶5#；8：双靶6#；9：双靶7#；10：双靶8#；11：双靶9#；12：双靶10#；13：双靶11#；14：双靶11#上清液；15：双靶11#上清液；以上样品除样品14外均各含有20mM的DTT。
在图4B中，样品分别是：1：Marker(标记物)；2：双靶1#；3：双靶2#；4：双靶3#；5：双靶4#；6：双靶5#；7：双靶6#；8：双靶7#；9：双靶8#；10：双靶9#；11：双靶10#；12：双靶11#；13：对照：双靶RAHL；14：双靶10#上清；15：双靶10#；其中样品15含有20mM的DTT，为经还原处理的样品。
其中，双靶RAHL依照下述方法进行制备：
首先，利用PCR扩增获得上游片段(包含GLP-1部分)和下游片段(Fc-FGF21)，PCR扩增程序为：98℃，预变性5min；98℃，变性10s；56℃退火10s；72℃延伸5s或10s；重复30个循环；72℃继续延伸8min。然后用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用OMEGA胶回收试剂盒回收上游片段和下游片段。将获得的上游片段与下游片段通过SOE PCR获得全长序列。SOE PCR扩增程序为：98℃，预变性5min；98℃，变性10s；56℃退火10s；72℃延伸15s；重复30个循环；72℃继续延伸8min。然后用Gel Extraction Kit试剂盒(OMEGA，America)回收全长目的基因。
在37℃条件下，利用内切酶HindⅢ和EcoRⅠ(TAKARA，Japan)消化处理全长目的基因序列和载体质粒pcDNA3.4，采用Gel Extraction Kit试剂盒(OMEGA，America)按厂商说明纯化回收消化产物。利用DNALigation Kit Ver.2.1(TAKARA，Japan)按厂商说明将纯化回收的目的基因和载体连接，16℃恒温处理1小时，得到重组表达质粒。
将上述重组表达质粒转化到感受态细胞DH5a中，取菌体涂布氨苄平板。挑取平板上的单克隆于1ml LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L和琼脂2％，抗生素含量100μg/mL)中培养后提取质粒，经测序验证正确后，采用Invitrogen质粒大提试剂盒提取一系列经验证正确的表达载体，用限制性内切酶PvuⅠ(TAKARA，Japan)酶切，进行线性化后利用乙醇沉淀方法纯化回收，-20℃保藏备用。
实验过程中用到的引物如下：上游片段(包含GLP-1部分)扩增引物包括：引物AUZ-F(SEQ ID No:37)，引物lfc1-R(SEQ ID NO:38)。下游片段(Fc-FGF21)扩增引物包括：引物lfc1-F(SEQ ID NO:39)，引物fgf21-R(SEQ ID NO:40)。SOE PCR引物包括：引物AUZ-F(SEQID NO:37)，引物fgf21-R(SEQ ID NO:40)。
将HEK293F宿主细胞(Invitrogen，Freestyle 293F)用293Expi Medium培养基复苏培养，当细胞密度约1×106细胞/mL时对宿主细胞进行转染。转染细胞约3×107细胞，线性化表达载体约30μg，采用Expi Fectamine293 Reagent转染试剂盒进行。转染后细胞于30mL的293Expi Medium培养基中培养。培养第二天，开始使用遗传霉素G418(Merck)对转化子进行筛选，根据细胞生长情况，每3天更换一次培养基，约14天后，可见有抗性的克隆出现，可进行扩大培养。细胞传代密度约0.5×106细胞/mL，对获得的混合克隆株用293ExpressionMedium培养基进行传代培养。当细胞存活率约90％时，收集细胞培养液。
将细胞培养液在200g下离心10min，取上清在8000rpm下离心30min后，收集上清，利用Protein A层析柱(EzFast Protein ADiamond，博格隆)对离心后的细胞培养液上清进行亲和纯化，平衡液为20mM PBS，0.15M NaCl，pH7.4；洗脱液为0.1M甘氨酸洗脱pH3.2，收集目标吸收峰下蛋白洗脱液，用PBS缓冲液透析后取部分样品进行质谱检测，质谱(Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，型号G6530，Agilent Technologies)检测分子量，与理论分子量一致，且为同源二聚体形式。结果如表3所示。
同时对收集的样品通过10％SDS-PAGE电泳检测。
表2融合蛋白(发酵培养7天)质谱检测结果分析
结果显示，由于包含具备了特定位点的氨基酸突变组合的FGF21多肽，本申请所述的融合蛋白均能够有效避免FGF21降解的问题。其中本申请所述融合蛋白的完整蛋白百分比均在83％以上，并且绝大部分都能达到92％以上。
实施例3双靶融合蛋白和单靶融合蛋白的制备
3.1表达载体Plasmid-X2的构建
委托苏州泓迅生物科技股份有限公司进行基因合成双靶融合蛋白的目的基因，包括双靶RGHLQQ(其氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示)，双靶RAHLQQ(其氨基酸序列如SEQIDNO:44所示)，单靶RGHLQQ(其氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示)，双靶RAHL(其序列如SEQID NO:41所示)。在37℃条件下，利用内切酶HindⅢ和EcoRⅠ(TAKARA，Japan)消化处理目的基因序列和载体质粒pXC17.4，采用Gel Extraction Kit试剂盒按厂商说明纯化回收消化产物。利用DNALigation Kit Ver.2.1(TAKARA，Japan)按厂商说明将纯化回收的目的基因和载体连接，16℃恒温处理1小时，得到重组表达质粒。
将上述重组表达质粒转化到感受态细胞DH5a中，取菌体涂布氨苄平板。挑取平板上的单克隆于1ml LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L和琼脂2％，抗生素含量100μg/mL)中培养后提取质粒，经广州艾基生物技术有限公司测序验证正确，采用Invitrogen质粒大提试剂盒提取一系列经验证正确的表达载体，用限制性内切酶PvuⅠ酶切(TAKARA，Japan)，进行线性化后利用乙醇沉淀方法纯化回收，-20℃保藏备用。
3.2载体转染及在细胞中表达
将CHO宿主细胞用Cellvento CHO-200培养基(Merck)复苏培养后，当细胞密度约4.76×106个细胞/mL时收集细胞进行转染。转染细胞约1×107个，质粒约40μg，通过电击方法转染(Bio-Rad，Gene pulser Xcell)。电击后细胞于20mL Cellvento CHO-200培养基中培养。培养第二天，离心收集细胞，并在加入L-Methionine sulfoximine(Sigma-aldrich)至终浓度50μM的20mL Cellvento CHO-200培养基中重悬培养。当细胞密度约0.6×106个细胞/mL时，对获得的混合克隆株用Cellvento CHO-200培养基进行传代，传代细胞密度约0.2×106个细胞/mL。当细胞存活率约90％时，收集细胞培养液。
3.3融合蛋白纯化及检测
将细胞培养液在200g下离心10min，取上清在8000rpm下离心30min后，收集上清，利用Protein A层析柱(EzFast Protein ADiamond，博格隆)对离心后的细胞培养液上清进行亲和纯化，平衡液为20mM PBS，0.15M NaCl，pH7.4；洗脱液为0.1M甘氨酸洗脱pH3.2，收集目标吸收峰下蛋白洗脱液，用PBS缓冲液透析后取部分样品进行质谱检测，质谱(Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，型号G6530，Agilent Technologies)检测分子量，与理论分子量一致，且为同源二聚体形式。结果如表3和图7所示。其中，图7A1显示双靶RAHLQQ发酵4天非还原质谱检测结果；图7A2显示双靶RGHLQQ发酵4天非还原质谱检测结果；图7B1显示双靶RAHLQQ发酵4天还原质谱检测结果；图7B2显示双靶RGHLQQ发酵4天还原质谱检测结果；图7C1显示双靶RAHLQQ发酵7天非还原质谱检测结果；图7C2显示双靶RGHLQQ发酵7天非还原质谱检测结果；图7D1显示双靶RAHLQQ发酵7天还原质谱检测结果；图7D2显示双靶RGHLQQ发酵7天还原质谱检测结果；。
表3融合蛋白还原处理质谱加测结果分析
同时对收集的样品通过10％SDS-PAGE电泳检测，结果如表4和图5A、5B所示。
其中，在图5A中，1：双靶RGHLQQ上清-非还原；2：双靶RAHLQQ上清-非还原；3.RAHL上清-非还原；4：双靶RGHLQQ上清-还原；5：双靶RAHLQQ上清-还原；6：RAHL纯化样品-还原；7：Marker(标记物)。在图5B中，还原1组：双靶RGHLQQ纯化样品；还原2组：双靶RAHLQQ纯化样品；还原3组：RAHL上清；非还原1组：双靶RGHLQQ纯化样品；非还原2组:双靶RAHLQQ纯化样品；非还原3组：双靶RAHL纯化样品。
表4融合蛋白SDS-PAGE检测结果分析
综合实施例2和实施例3的结果说明，19位突变为Q的双靶融合蛋白的目的条带占约75％，而19位突变为V双靶融合蛋白的目的条带则可以占约90％以上。这就说明，FGF21多肽的第19位突变为V相较于突变为Q更能够有效防止FGF21乃至包含其的所述融合蛋白的降解作用。
实施例4小鼠模型体内血糖测试
选择6周周龄的SPF级别的db/db小鼠(购自江苏集萃药康生物科技有限公司)作为肥胖性II型糖尿病模式动物进行检测，按照10nmol/kg的剂量进行皮下注射，在第0天进行第一次给药，在第6天进行第二次给药。取溶媒PBS作为对照，取实施例2中制备的双靶1#、双靶2#、双靶3#、双靶4#、双靶7#、双靶9#和实施例3中制备的双靶RAHL进行检测。检测方法为每天早上(给药前)小鼠尾尖取血，罗康全卓越型血糖仪检测血糖，结果如图6所示。于实验最后一天动物过夜禁食，第二天早上小鼠眼眶取血制备血清，罗氏全自动生化分析仪检测空腹血糖。
图6显示，溶媒对照组动物血糖维持稳定，且处于高血糖水平(>23.0mmol/L)。与空白溶媒组相比，各个样品均能显著的降低血糖。其中双靶3#蛋白降低血糖较弱，单次给药仅能维持到24-48小时。其他样品均能明显降低血糖，且双靶9#、双靶1#、双靶2#、双靶4#、双靶7#、双靶3#等的降糖效果尤为显著。
空腹血糖的检测结果显示，与空白溶媒组相比，双靶1#、双靶4#等均能够显著降低空腹血糖。可见由于包含具备了特定位点的氨基酸突变组合的本申请所述FGF21多肽，本申请所述的融合蛋白能够显著降低空腹血糖。
实施例5小鼠体重检测
取实施例4中的小鼠进行给药后体重检测。按照与实施例4中相同的方法进行给药，并记录每天的体重变化。体重-时间曲线结果如图8所示。
图8的结果显示，给药后，与溶媒对照组相比，双靶1#、双靶2#、双靶4#、双靶7#、双靶9#均能持续地显著降低体重。双靶RAHL仅在给药第一周(第0天到第7天)能够降低体重。可见由于包含具备了特定位点的氨基酸突变组合的本申请所述FGF21多肽，本申请所述的融合蛋白能够显著降低小鼠体重。
实施例 6db/db小鼠模型中融合蛋白双靶RAHL、双靶1#、双靶7#的降糖及改善血脂药效研究
融合蛋白在db/db小鼠模型(江苏集萃药康生物科技有限公司)中的药效研究。实验过程为：对纯化的融合蛋白用10mM的PBS稀释，对符合实验要求的db/db小鼠随机选择分组，共4组：包括对照溶媒组(10mM的PBS稀释)、双靶RAHL组、双靶1#组和双靶7#组。按每只db/db小鼠注射10nM/kg相应的融合蛋白进行计算给药，给药体积为10ml/kg，每种融合蛋白注射8只小鼠，每周给药一次，给药两周。
给药后临床观察血糖、体重和摄食量的变化情况(结果见图9-11，其中图9显示注射所述融合蛋白后，小鼠的血糖变化；图10显示注射所述融合蛋白后，小鼠的体重增长率的变化；图11显示注射所述融合蛋白后，小鼠摄食量的变化)。
表5融合蛋白对小鼠血糖、体重增长率和摄食量的影响
溶媒组
双靶RAHL组
双靶1#组
双靶7#组
第一次注射后第12天血糖(mmol/L)
27.5±3.0
17.8±5.0***
10.3±4.0***
6.9±4.0***
第一次注射后第12天体重增长率(％)
15.8±4.6
9.3±2.9**
2.6±3.8***
-3.8±2.9***
第一次注射后第12天摄食量(g/个)
7.9
7.5
6.3
4.7
图9-11和表5的结果说明，与溶媒对照组相比，双靶RAHL、双靶1#、双靶7#均能明显的降糖血糖、降糖体重和降低摄食量，其中双靶RAHL、双靶1#、双靶7#的治疗效果更为优异。
给药两周后，处死小鼠，检测其血液中总胆固醇(CHO)水平和空腹血糖，以评价药物对血脂以及空腹血糖的改善作用(结果见图12-13，其中图12显示注射所述融合蛋白后，小鼠的CHO水平变化；图13显示注射所述融合蛋白后，小鼠的空腹血糖的变化)。
表6融合蛋白对小鼠CHO和空腹血糖的影响
溶媒组
双靶RAHL组
双靶1#组
双靶7#组
总胆固醇(CHO)水平(mmol/L)
4.8±1.1
4.4±0.8
3.5±0.6**
3.8±1.0
空腹血糖(mmol/L)
36.0±6.7
23.0±7.6
17.1±8.8
12.6±6.9
图12-13和表6的结果说明，与溶媒对照组相比，双靶1#能够显著降低总胆固醇水平(P<0.01)，双靶RAHL和双靶7#对血脂也显示出降低趋势；双靶RAHL、双靶1#、双靶7#均能降低空腹血糖，其中双靶1#和7#降空腹血糖的效果更优异。可见由于包含具备了特定位点的氨基酸突变组合的本申请所述FGF21多肽，本申请所述的融合蛋白能够显著降糖并改善血脂。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
序列表
<110> 广东东阳光药业有限公司；南北兄弟药业投资有限公司
<120> 一种多肽分子及其应用
<130> PP0847CN
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 181
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 2
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> FGF21-1
<400> 2
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 3
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> FGF21-2
<400> 3
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Leu Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 4
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> FGF21-3
<400> 4
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Val Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Leu Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 5
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> FGF21-4
<400> 5
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Leu Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 6
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> FGF21-6
<400> 6
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Val Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 7
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> FGF21-7
<400> 7
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Cys His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 8
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> FGF21-9
<400> 8
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Cys His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Leu Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 9
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> FGF21-10
<400> 9
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Cys His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Val Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Leu Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 10
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> FGF21-11
<400> 10
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Cys His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Val Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 11
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> FGF21-12
<400> 11
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 12
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 13
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG-Fc-PAAK
<400> 13
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 14
<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 15
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> GLP-1-GEG
<400> 15
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> Linker
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 17
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 单靶1#
<400> 17
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
245 250 255
Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
260 265 270
Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala
275 280 285
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
290 295 300
Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg
305 310 315 320
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys
325 330 335
Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser
340 345 350
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
355 360 365
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly
370 375 380
Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro
385 390 395 400
Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln
405 410 415
Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
420
<210> 18
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 单靶2#
<400> 18
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
245 250 255
Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
260 265 270
Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala
275 280 285
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
290 295 300
Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg
305 310 315 320
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys
325 330 335
Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser
340 345 350
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
355 360 365
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly
370 375 380
Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro
385 390 395 400
Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln
405 410 415
Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
420
<210> 19
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 单靶3#
<400> 19
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
245 250 255
Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
260 265 270
Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala
275 280 285
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
290 295 300
Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg
305 310 315 320
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys
325 330 335
Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser
340 345 350
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
355 360 365
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Val Phe Leu Pro Leu Pro Gly
370 375 380
Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro
385 390 395 400
Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln
405 410 415
Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
420
<210> 20
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 单靶4#
<400> 20
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
245 250 255
Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
260 265 270
Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala
275 280 285
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
290 295 300
Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg
305 310 315 320
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys
325 330 335
Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser
340 345 350
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
355 360 365
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly
370 375 380
Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro
385 390 395 400
Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln
405 410 415
Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
420
<210> 21
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 单靶6#
<400> 21
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
245 250 255
Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
260 265 270
Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala
275 280 285
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
290 295 300
Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg
305 310 315 320
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys
325 330 335
Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser
340 345 350
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
355 360 365
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Val Phe Leu Pro Leu Pro Gly
370 375 380
Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro
385 390 395 400
Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln
405 410 415
Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
420
<210> 22
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 单靶7#
<400> 22
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
245 250 255
Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
260 265 270
Glu Cys His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala
275 280 285
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
290 295 300
Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg
305 310 315 320
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys
325 330 335
Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser
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355 360 365
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370 375 380
Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro
385 390 395 400
Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln
405 410 415
Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
420
<210> 23
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 单靶9#
<400> 23
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
245 250 255
Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
260 265 270
Glu Cys His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala
275 280 285
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
290 295 300
Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg
305 310 315 320
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys
325 330 335
Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser
340 345 350
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
355 360 365
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly
370 375 380
Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro
385 390 395 400
Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln
405 410 415
Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
420
<210> 24
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 单靶10#
<400> 24
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
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130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
245 250 255
Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
260 265 270
Glu Cys His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala
275 280 285
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
290 295 300
Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg
305 310 315 320
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys
325 330 335
Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser
340 345 350
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
355 360 365
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Val Phe Leu Pro Leu Pro Gly
370 375 380
Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro
385 390 395 400
Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln
405 410 415
Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
420
<210> 25
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 单靶11#
<400> 25
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
245 250 255
Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
260 265 270
Glu Cys His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala
275 280 285
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
290 295 300
Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg
305 310 315 320
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys
325 330 335
Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser
340 345 350
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
355 360 365
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370 375 380
Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro
385 390 395 400
Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln
405 410 415
Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
420
<210> 26
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 单靶12#
<400> 26
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
245 250 255
Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
260 265 270
Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala
275 280 285
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
290 295 300
Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg
305 310 315 320
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys
325 330 335
Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser
340 345 350
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
355 360 365
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly
370 375 380
Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro
385 390 395 400
Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln
405 410 415
Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
420
<210> 27
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 双靶1#
<400> 27
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser
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Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
50 55 60
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
65 70 75 80
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85 90 95
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
100 105 110
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
115 120 125
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
130 135 140
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
145 150 155 160
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
165 170 175
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
180 185 190
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
195 200 205
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
210 215 220
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
225 230 235 240
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
245 250 255
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
260 265 270
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
290 295 300
Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
305 310 315 320
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
325 330 335
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
340 345 350
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
355 360 365
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
370 375 380
Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
385 390 395 400
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
405 410 415
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
420 425 430
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
435 440 445
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu
450 455 460
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
465 470
<210> 28
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 双靶2#
<400> 28
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser
35 40 45
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
50 55 60
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
65 70 75 80
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
85 90 95
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
100 105 110
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
115 120 125
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
130 135 140
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
145 150 155 160
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
165 170 175
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
180 185 190
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
195 200 205
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
210 215 220
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
225 230 235 240
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
245 250 255
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
260 265 270
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
290 295 300
Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
305 310 315 320
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
325 330 335
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
340 345 350
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
355 360 365
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
370 375 380
Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
385 390 395 400
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
405 410 415
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Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
465 470
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<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 双靶12#
<400> 36
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser
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115 120 125
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
130 135 140
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
225 230 235 240
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
245 250 255
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
260 265 270
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
290 295 300
Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
305 310 315 320
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325 330 335
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
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Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
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Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
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Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
385 390 395 400
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
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Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
420 425 430
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
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Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu
450 455 460
Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
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<211> 37
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<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物lfc1-F
<400> 39
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<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
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<223> 引物fgf21-R
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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115 120 125
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245 250 255
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
260 265 270
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
290 295 300
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
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405 410 415
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
420 425 430
Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
435 440 445
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Leu
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Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
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Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
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Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
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Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
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Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
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Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
435 440 445
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Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
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<223> 双靶RAHLQQ
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Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
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Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
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Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Gln Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
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Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
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<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
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<223> 单靶RAHL
<400> 46
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<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 单靶RGE
<400> 48
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
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Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
245 250 255
Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
260 265 270
Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala
275 280 285
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
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325 330 335
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355 360 365
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly
370 375 380
Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro
385 390 395 400
Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Gly Ser Gln
405 410 415
Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
420
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