阅读说明：本技术 成纤维细胞生长因子23相关的低磷酸盐血症的基因治疗 (Gene therapy for fibroblast growth factor 23-associated hypophosphatemia ) 是由 G·龙齐蒂 L·加奥泽 S·查尔斯 F·明戈齐 于 2020-04-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用于FGF-23相关的低磷酸盐血症的基因治疗,特别是针对肌肉、肝脏或造血组织,更特别是肝组织的基因治疗的核酸构建体。本发明还涉及包含核酸构建体的载体,以及它们通过基因治疗治疗FGF-23相关的低磷酸盐血症,特别是XLH的用途。(The present invention relates to nucleic acid constructs for use in gene therapy for FGF-23 related hypophosphatemia, in particular for gene therapy of muscle, liver or hematopoietic tissues, more in particular liver tissues. The invention also relates to vectors comprising the nucleic acid constructs and their use for the treatment of FGF-23 related hypophosphatemia, in particular XLH, by gene therapy.)

具体实施方式

材料和方法

编码截短的FGF23的核酸的构建

通过将包含RXXR基序(人FGF23蛋白的氨基酸175-179)，之前是R175(RRHTR基序；人FGF23蛋白的氨基酸175-179)的人FGF23蛋白的氨基酸175-251(NP_065689的aa 175-251；SEQ IDNO:2)或SEQ ID NO：1的人FGF蛋白的氨基酸180-251(不包含所述RXXR基序)与不含信号肽的人血清白蛋白(NP_000468的aa 25-609或SEQ ID NO:9)通过衍生自人凝血因子IX的可切割接头(cFIX；NP_000124的氨基酸182-200；SEQ ID NO:10)融合来产生编码截短的FGF23的核酸构建体。最后，将衍生自胰凝乳蛋白酶原B2的前18个氨基酸(sp7；NP_001020371的氨基酸1-18或SEQ ID NO：7)的信号肽插入到构建体的N-末端以介导有效分泌(SEQ ID NO：12(图1A)；SEQ ID NO：52)。这些序列通过商业算法进行密码子优化。所得序列为SEQ ID NO:57，其包含SEQ ID NO:13的CDS，其编码SEQ ID NO:12的融合蛋白，5'侧翼为MluI/Kozak(表1中的构建体n°12)；和SEQ ID NO:51，其包含编码SEQ ID NO:52的融合蛋白的CDS，5'侧翼为MluI/Kozak(表1中的构建体n°10)。将密码子优化序列克隆到针对肝脏表达优化的转基因表达盒中(图1B)。

产生其他构建体用于比较(表1)。通过在针对肝脏表达优化的转基因表达盒中克隆野生型或密码子优化的人FGF23序列而产生编码天然人FGF23(SEQ ID NO:1)的核酸构建体(图1B)。

通过将包含或不包含RXXR基序(人FGF23蛋白的氨基酸175-251或180-251)的FGF23-C与天然FGF23或sp7信号肽融合来产生截短的C-末端FGF23构建体(FGF23-C)。将这些序列通过商业算法进行密码子优化，并克隆到针对肝脏表达优化的转基因表达盒中。

通过将不含RXXR基序的FGF23-C与人血清白蛋白(不含信号肽)在不存在下衍生自人凝血因子IX的可切割接头的情况下融合，或通过将包含RXXR的FGF23-C与人血清白蛋白(不含信号肽)在不存在下衍生自人凝血因子IX的可切割接头的情况下融合来产生嵌合蛋白。将衍生自胰凝乳蛋白酶原B2(sp7)的前18个氨基酸的信号肽插入到构建体的N-末端以介导有效的分泌。将这些序列通过商业算法进行密码子优化，并克隆到针对肝脏表达优化的转基因表达盒中(图1B)。

AAV载体生产

将AAV载体使用无腺病毒的瞬时转染方法(Matsushita et al.,Gene Therapy,1998,5,938-945)产生，并如前所述进行纯化(Ayuso et al.,Gene Therapy,2010,17,503-510)。使用实时定量PCR(qPCR)测定AAV载体储液的滴度，并通过SDS-PAGE，然后通过Ruby蛋白质凝胶染色和条带密度测定法确认。

体外研究

将70-80％汇合的Huh-7用表1中所示的构建体通过脂质体转染。转染两天后，收获培养基并通过蛋白质印迹分析FGF23的水平。

蛋白质印迹

转染后的Huh-7培养基和来自注射不同AAV载体的小鼠的血清加载到4-15％梯度聚丙烯酰胺凝胶上以进行SDS-PAGE。在硝酸纤维素膜上转移后，将膜封闭并与抗FGF23抗体一起孵育。将膜与适当的二抗一起孵育，并通过Odyssey成像系统可视化。

小鼠研究

向六周龄的C57BL6/J小鼠通过尾静脉静脉注射AAV载体。载体注射后1个月，通过蛋白质印迹分析循环中FGF23-C的水平。收获肝脏并通过qPCR测量载体基因组拷贝数。

向一月龄的雄性Hypduk小鼠通过尾静脉静脉注射AAV载体。注射PBS的野生型和Hypduk同窝小鼠用作对照。载体注射后3个月，每月对小鼠进行称重和测量，以在宏观水平评估疾病的纠正。载体注射后三个月进行血磷酸盐的测量和肌肉力量的功能性评估。

磷酸盐血症

为了测量循环磷酸盐水平，注射载体三个月后对小鼠进行放血。以10000xg离心10分钟后，使用标准商业试剂盒测量血清中的无机磷酸盐含量。

倒置网格测试

将小鼠置于网格上并使其适应3-5秒，然后将网格倒置并保持在包含5-7cm软垫的鼠笼上至少35cm。在三分钟期间测量跌倒次数，并报告为每分钟跌倒次数。

结果

人FGF23(FGF23-C)的C-末端部分与天然FGF23竞争并减少受体结合后的细胞内信号传输。

使用FGF23-C作为XLH疗法的一个重要限制是该肽在循环中非常不稳定。开发了基因治疗方法来从肝脏分泌这种肽并提高其稳定性。将包含RXXR基序，之前是R175(RRHTR基序；人FGF23蛋白的氨基酸175-179)的人FGF蛋白的氨基酸175-251(SEQ ID NO:2)或SEQ IDNO：1的人FGF蛋白的氨基酸180-251(不包含所述RXXR基序)通过衍生自人凝血因子IX的可切割接头(SEQ ID NO：10)与不含信号肽的人血清白蛋白(SEQ ID NO：9)融合。最后，将衍生自胰凝乳蛋白酶原B2(SEQ ID NO:7)的前18个氨基酸的信号肽插入到构建体的N-末端以介导有效的分泌(SEQ ID NO:12(图1A)；SEQ ID NO:52)。将这些序列通过商业算法进行密码子优化。所得序列为SEQ ID NO:57，其包含SEQ ID NO:13的CDS，其编码SEQ ID NO:12的融合蛋白，5'侧翼为MluI/Kozak(表1中的构建体n°12)；和SEQ ID NO:51，其包含编码SEQ IDNO:52的融合蛋白的CDS，5'侧翼为MluI/Kozak(表1中的构建体n°10)。将密码子优化序列克隆到针对肝脏表达优化的转基因表达盒中(图1B)。包含在SEQ ID NO:57中的包含SEQ IDNO:13的转基因表达盒具有序列SEQ ID NO:23。包含侧接AAV ITR的SEQ ID NO:23表达盒的AAV转移载体具有序列SEQ ID NO:24。

为了证实FGF23-C的低稳定性并测试提高其分泌和稳定性的策略，发明人用在hAAT启动子的转录控制下表达天然FGF23和FGF23-C的不同构建体转染人肝肝癌细胞(表1和图1)。

表1

N°	信号	RXXR	FGF23	cFIX	白蛋白
						1	spFGF23wt	+(wt)	wtFGF23	-	-
2	spFGF23wt	+(co)	coFGF23	-	-
						3	spFGF23wt	+(co)	wtFGF23-C	-	-
4	spFGF23wt	-	wtFGF23-C	-	-
						5	spFGF23co	+(co)	coFGF23-C	-	-
6	spFGF23co	-	coFGF23-C	-	-
						7	sp7co	+(co)	coFGF23-C	-	-
8	sp7co	-	coFGF23-C	-	-
						9	sp7co	+(co)	coFGF23-C	-	+
10	sp7co	-	coFGF23-C	+	+
						11	sp7co	-	coFGF23-C	-	+
12	sp7co	+(co)	coFGF23-C	+	+
						13	sp7co	-	-	-	+

表1.所测试构建体的描述。FGF23，成纤维细胞生长因子23；FGF23-C，FGF23的c-末端部分(氨基酸175-251)；spFGF23，天然FGF23信号肽；sp7，糜蛋白酶原B2信号肽；RXXRR，FGF23-C的氨基酸176-179；wt，天然FGF23序列；co，密码子优化；cFIX，人凝血因子IX的氨基酸182-200；白蛋白，人血清白蛋白序列的氨基酸25-609。

-构建体n°1(核苷酸(nt)序列(SEQ ID NO：25)；相应的氨基酸(aa)序列SEQ IDNO：26、1或27)。

-构建体n°2(核苷酸(nt)序列(SEQ ID NO：28)；相应的氨基酸(aa)序列SEQ IDNO：29、1、26或27)。

-构建体n°3(核苷酸(nt)序列(SEQ ID NO：30)；相应的氨基酸(aa)序列SEQ IDNO：31或32)。

-构建体n°4(核苷酸(nt)序列(SEQ ID NO：33)；相应的氨基酸(aa)序列SEQ IDNO：34或35)。

-构建n°5(核苷酸(nt)序列(SEQ ID NO：36)；相应的氨基酸(aa)序列SEQ ID NO：37或38)。

-构建体n°6(核苷酸(nt)序列(SEQ ID NO：39)；相应的氨基酸(aa)序列SEQ IDNO：40或41)。

-构建体n°7(核苷酸(nt)序列(SEQ ID NO：42)；相应的氨基酸(aa)序列SEQ IDNO：43或44)。

-构建体n°8(核苷酸(nt)序列(SEQ ID NO：45)；相应的氨基酸(aa)序列SEQ IDNO：46或47)。

-构建体n°9(核苷酸(nt)序列(SEQ ID NO：48)；相应的氨基酸(aa)序列SEQ IDNO：49或50)。

-构建体n°10(核苷酸(nt)序列(SEQ ID NO：51)；对应的氨基酸(aa)序列SEQ IDNO：52，其与SEQ ID NO：53相同)。

-构建体n°11(核苷酸(nt)序列(SEQ ID NO：54)；相应的氨基酸(aa)序列SEQ IDNO：55或56)。

-构建体n°12(核苷酸(nt)序列(SEQ ID NO：57)；对应的氨基酸(aa)序列SEQ IDNO：58，其与SEQ ID NO：12相同)。

将FGF-23和FGF23-C基因的野生型和密码子优化版本和与天然FGF23和胰凝乳蛋白酶原B2的异源信号肽(SEQ ID NO：7，sp7)融合的版本一起测试。在测试的不同序列中，包括或不包括存在于人FGF23中并负责将其切割成FGF23 N-末端和C-末端肽的RRHTR基序。

天然FGF23在转染的Huh-7细胞及其密码子优化版本(构建体n°1和2，图2A)的培养基中高效生产和分泌。除了没有RHTR基序的sp7融合的FGF23-C(结构n°8，图2A)外，培养基中没有任何FGF23-C变体产生。有趣的是，与白蛋白部分(SEQ ID NO：9)的融合增强了FGF23-C的分泌，而不管嵌合蛋白(构建体n°9-12，图2A)的组成如何。与其他含有白蛋白部分的嵌合蛋白相比，FGF23-C与白蛋白在不存在RHTR基序和衍生自人凝血因子IX(构建体n°11)的可切割接头的情况下的融合导致更高的体外分泌水平(构建体n°9、n°10和n°12，图2B)。

制备表达构建体n°7、n°9、n°11和n°12的AAV8载体：i)FGF23-C与sp7融合并包含RRHTR基序(构建体n°7)，ii)FGF23-C与sp7和白蛋白融合并包含RRHTR基序(构建体n°9)，iii)FGF23-C与sp7和白蛋白融合，不含RRHTR基序(构建体体n°11)，以及iv)FGF23-C通过hFIX接头与sp7和白蛋白融合并包含RRHTR基序(构建体n°12，表1和图1A)。AAV8载体以1x10¹² vg/小鼠的剂量产生并注射到六周龄C57BL6/J小鼠中。载体注射后一个月，将小鼠放血以通过蛋白质印迹测量磷酸盐血症和FGF23-C水平。重要的是，仅在注射表达构建体n°12的AAV8载体的小鼠中观察到血液中磷水平增加(图3A)，尽管其他构建体实现了相似的肝脏转导水平(图3B)，并且用构建体n°11在体外实现了更高的表达水平。

对应FGF23-C-白蛋白嵌合蛋白分子量的条带仅在注射AAV8载体的小鼠中显示，该载体在肝脏中特异性表达构建体n°9和n°12。相反，在注射AAV8载体的小鼠中检测不到与FGF23-C相容的条带，即与sp7融合的FGF23-C，证实了FGF23-C在体内的不稳定性(图3C)。重要的是，与构建体n°9(无接头；图3D)相比，注射包含可切割接头(hFIX；SEQ ID NO：10)的构建体n°12的小鼠显示出显著更高的循环FGF-23-C融合蛋白水平，尽管每个细胞的载体基因组拷贝数(图3B)和构建体n°11在体外实现的更高表达水平证明了类似的肝脏转导。这些数据表明FGF23的C-末端部分(FGF23-C)只能以与白蛋白部分的融合形式由肝脏表达。它们还表明，当FGF23-C通过可切割接头(尤其是衍生自人凝血因子IX(SEQ ID NO:10))与白蛋白部分融合时，融合蛋白的组成影响其在循环中的稳定性和功能。

为了验证由FGF23-C组成并通过根据本发明的hFIX衍生接头(构建体n°12，表1和图1A)与sp7和白蛋白融合的嵌合蛋白在体内是否有活性，向一月龄Hypduk小鼠以1x10¹²vg/小鼠(KO，AAV)的剂量注射表达该构建体的AAV8载体。注射PBS的Hypduk(KO,PBS)和野生型同窝小鼠(WT,PBS)用作对照。通过在载体注射后一个月开始每月测量体重和体长和尾长来评估表型校正(图4)。通常，与野生型动物相比，PBS处理的Hypduk小鼠的体重、体长和尾长都较低(图4A-C)。用表达根据本发明的FGF23-C嵌合蛋白的AAV8载体处理的Hypduk小鼠在3个月的时间内表现出体重和体长和尾长的增加高于PBS处理的Hypduk小鼠，并且与在野生型动物中观察到的那些相似(图4A-C)。尽管在AAV处理的动物中观察到体长增加的完全救济(图4B)，但体重和尾长仅部分救济(图4A、C)。处理三个月后，测量血清中磷酸盐的水平。在AAV处理的Hypduk小鼠中，磷酸盐水平与PBS处理的Hypduk小鼠中测量的显著不同，并且与野生型动物的磷酸盐水平无法区分(图5)。骨骼生长受损和肌腱钙化可能导致运动功能和肌肉力量下降。Hypduk小鼠表型的功能性评估通过倒置网格测试进行。我们观察到，与通过AAV基因治疗完全救济的野生型相比，Hypduk小鼠每分钟跌倒次数增加(图6)。