一种重组人成纤维细胞生长因子-21包涵体的纯化工艺
阅读说明：本技术 一种重组人成纤维细胞生长因子-21包涵体的纯化工艺 (Purification process of recombinant human fibroblast growth factor-21 inclusion body ) 是由 郑诗雨 马金航 张铭浩 惠琦 何鑫 于 2020-03-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组人成纤维细胞生长因子-21包涵体的纯化工艺,包括以下步骤：(1)将菌体悬浮于粗提工作液中,加入溶菌酶进行搅拌和超声破碎,然后进行离心、洗涤沉淀得到包涵体；(2)将步骤(1)得到的包涵体溶解于变性溶液中得到包涵体溶液,然后将复性溶液加入包涵体溶液,搅拌均匀,得到复性后的包涵体溶液；(3)步骤(2)得到包涵体溶液采用Q柱进行分离,得到蛋白溶液；(4)步骤(3)得到的蛋白溶液采用Q柱进行浓缩,得到重组人成纤维细胞生长因子-21蛋白。该纯化工艺可以获得重组人成纤维细胞生长因子-21蛋白,并且该蛋白具有较高的纯度和活性。(The invention discloses a purification process of a recombinant human fibroblast growth factor-21 inclusion body, which comprises the following steps: (1) suspending the thallus in the crude extraction working solution, adding lysozyme, stirring and ultrasonically crushing, and then centrifuging, washing and precipitating to obtain an inclusion body; (2) dissolving the inclusion body obtained in the step (1) in a denaturing solution to obtain an inclusion body solution, then adding the renaturation solution into the inclusion body solution, and uniformly stirring to obtain the renatured inclusion body solution; (3) separating the inclusion body solution obtained in the step (2) by adopting a Q column to obtain a protein solution; (4) and (4) concentrating the protein solution obtained in the step (3) by adopting a Q column to obtain the recombinant human fibroblast growth factor-21 protein. The purification process can obtain recombinant human fibroblast growth factor-21 protein with high purity and activity.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种重组人成纤维细胞生长因子-21包涵体的纯化工艺。
背景技术
rhFGF-21是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员，其前体由209个氨基酸组成，N端有特殊的信号肽序列，成熟蛋白181个氨基酸。相对分子质量约为19.4kD。研究还发现该蛋白等电点为5.0-6.0，为酸性蛋白。重组人成纤维细胞生长因子-21(rhFGF-21)是FGFs家族中目前发现的唯一没有促有丝***的基因，作为一个内分泌因子与糖脂代谢有着密切的关系。rhFGF-21在脂代谢方面的作用机制主要体现为：1)FGF-21能改善胰岛β细胞的功能。它通过激活ERK1/2和Akt信号通路提高胰岛β细胞的存活率，降低胰岛素抵抗，提高胰岛敏感性。2)FGF21对脂代谢的调控主要表现为降低脂毒性，降低脂质新生，提高脂肪β氧化，提高脂联素含量，促进白色脂肪棕色化，降低血清中甘油三酯及磷脂含量。3)FGF21降低氧化应激反应，抑制炎症因子的释放。因此FGF21在治疗非酒精性脂肪肝炎方面更优势。
如果想要获得大量的FGF-21蛋白，需要以基因工程技术实现其在工程菌内的表达。前期我们构建的FGF-21表达菌株在大肠杆菌中是以包涵体形式表达的，包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40％～95％，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以在制备包涵体时添加表面活性剂可以进行初步纯化，分离包涵体后，还要采用适当的方法(如色谱法)进行重组蛋白质的纯化，因此关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解变性、复性以及纯化，而蛋白层析纯化一般包括三个阶段即捕获、中间纯化及精细纯化。捕获阶段的目标是分离、浓缩并稳定目的蛋白，以保持蛋白活性。
发明内容
本发明提供了一种重组人成纤维细胞生长因子-21包涵体的纯化工艺，该纯化工艺可以获得重组人成纤维细胞生长因子-21蛋白，并且该蛋白具有较高的纯度和活性。
一种重组人成纤维细胞生长因子-21包涵体的纯化工艺，包括以下步骤：
(1)将菌体悬浮于粗提工作液中，加入溶菌酶进行搅拌和超声破碎，然后进行离心、洗涤沉淀得到包涵体；
(2)将步骤(1)得到的包涵体溶解于变性溶液中得到包涵体溶液，然后将复性溶液加入包涵体溶液，搅拌均匀，得到复性后的包涵体溶液；
(3)步骤(2)得到包涵体溶液采用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱进行分离，得到蛋白溶液；
分离时，以25mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、1.0mol/L尿素作为缓冲液，以25mmol/LTris-HCl(pH7.8)、1.0mol/L尿素、0.05mol/L NaCl作为洗杂液，以25mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、1.0mol/L尿素、0.1mol/L NaCl作为洗脱液，以25mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、1mol/L NaCl作为再生液；
(4)步骤(3)得到的蛋白溶液采用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱进行浓缩，得到重组人成纤维细胞生长因子-21蛋白；
浓缩时，以25mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、1.0mol/L尿素作为层析的上样缓冲液，25mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、1.0mol/L NaCl作为洗脱液。
作为优选，步骤(1)中，所述的粗提工作液为25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲溶液，并含有150mmol/L NaCl、2mmol/L EDTA-2Na和0.5％triton。在粗提工作液中，Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)可以提供足够的缓冲能力，保证原液的pH环境，EDTA-2Na作为金属离子螯合剂，可减少金属离子对释放的目标蛋白的氧化作用，同时EDTA还能起到破坏细胞内膜的作用，Triton作为表面活性剂，可以促进细胞的破碎。
作为优选，步骤(1)中，洗涤时分别采用1％的脱氧胆酸钠和1％Triton X-100溶液。
作为优选，步骤(2)中，所述的变性溶液为8mol/L尿素，包涵体与变性溶液的用量比为1:10(W:V)。
作为优选，步骤(2)中，所述的复性溶液为25mmol/L Tris(pH7.8)溶液，包涵体与复性溶液的用量比为1:70(W:V)。
作为优选，步骤(3)中，采用经过两次柱层析进行分离，第一次柱层析完成后，经过透析除盐后再进行第二次柱层析。
进一步的，该方法的具体步骤如下：
(1)菌体以1:5(W:V)比例悬浮于25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲溶液中，内含150mmol/L NaCl、2mmol/L EDTA-2Na，按每克菌体加入0.8mg溶菌酶搅拌，37℃保温30min，期间不断搅拌，37℃保温后采用超声破碎至溶液不粘稠。将破菌后的液体进离心获取的沉淀分别用1％的脱氧胆酸钠，1％Triton X-100进行洗涤，最终获取的沉淀即为包涵体。
(2)包涵体溶解于8mol/L尿素中，低流速泵入复性液至尿素终浓度为1mol/L，所得液体即为复性后的包涵体溶液。
(3)第一步层析选用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析：以25mmol/LTris-HCl(pH7.8)、1.0mol/L尿素作为第一步层析的上样缓冲液，25mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、1.0mol/L尿素、0.05mol/L NaCl作为洗杂液，25mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、1.0mol/L尿素、0.1mol/L NaCl作为洗脱液，收集蛋白峰。25mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、1mol/L NaCl作为再生液。
(4)所得洗脱液经透析除盐后，重复再过一遍Q柱，所得洗脱液体即为较纯目的蛋白溶液，但是目的蛋白浓度较低，因此需要重新过一遍Q柱进行样品浓缩。
(5)浓缩层析选用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析：以25mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、1.0mol/L尿素作为层析的上样缓冲液，25mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、1.0mol/LNaCl作为洗脱液，收集蛋白峰。
附图说明
图1为实施例1中rhFGF-21蛋白过Q柱吸附试验电泳图；
图2为实施例1中rhFGF-21蛋白过DEAE柱吸附试验电泳图；
图3为实施例2中rhFGF-21包涵体1％Triton洗涤2次电泳图；
图4为实施例2中rhFGF-21包涵体1％Triton脱氧胆酸钠洗涤电泳图；
图5为实施例2中rhFGF-21包涵体尿素脱氧胆酸钠Triton洗涤电泳图；
图6为实施例3中rhFGF-21包涵体复性过DEAE柱吸附试验电泳图；
图7为实施例3中rhFGF-21包涵体复性过Q柱吸附试验电泳图。
具体实施方式
本发明所用的仪器和试剂如下：
所需仪器设备：离心机、高压均质机、层析柱。
所需试剂：纯化工作溶液
A液：25mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、1.0mol/L尿素
B液：25mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、1.0mol/L尿素50mmol/L NaCl C液：25mmol/LTris-HCl(pH7.8)、1.0mol/L尿素100mmol/L NaCl D液：25mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、1.0mol/L尿素300mmol/L NaCl E液：25mmol/L Tris-HCl(pH7.8)、1.0mol/L NaCl
层析条件:
阴离子交换柱层析：在吸附试验的基础上选择Q柱作为层析填料，进行层析试验。
再生：用E液冲洗再生层析柱。
水洗：用纯化水将柱中盐冲洗干净。
平衡：用A液平衡柱子，平衡1.5～3个柱体积至检测器基线平稳。
上样：将样品泵入色谱柱中，收集穿出峰，留样检测。
平衡：用A液平衡柱子，平衡至检测器基线平稳。
洗杂：用B液泵入色谱柱，收集洗杂峰，留样检测。
洗脱：用C液泵入色谱柱，收集洗脱峰，留样检测。
洗杂：用D液泵入色谱柱，收集洗脱峰，留样检测。
再生：用E液洗脱1～2个柱体积，收集穿出峰，留样检测。
将收集到的洗脱液经透析后重复以上过程一次所得洗脱液即为较纯目的蛋白原液，由于样品浓度较稀需经过一次浓缩。
浓缩层析条件(Q柱)：
再生：用E液冲洗再生层析柱。
水洗：用纯化水将柱中盐冲洗干净。
平衡：用A液平衡柱子，平衡1.5～3个柱体积至检测器基线平稳。
上样：将样品泵入色谱柱中，收集穿出峰，留样检测。
平衡：用A液平衡柱子，平衡至检测器基线平稳。
洗脱：用E液泵入色谱柱，收集洗脱峰，即为所需目的蛋白原液。
实施例1发酵菌体处理研究
由于表达的rhFGF-21目的蛋白存在于胞间质，需要破菌，试验中采用了超声裂解方法。将菌体以1:10(W:V)比例重悬于粗提工作液(25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲溶液，并含有150mmol/L NaCl、2mmol/L EDTA-2Na和0.5％triton)中，充分搅匀，在低温水浴下超声破碎，然后将将破菌后的液体进行高速冷冻离心，分别收取上清、沉淀，上清液进行以下吸附试验：
(1)Q Sepharose FF吸附试验：Q柱再生并重新平衡好后将表达体系试验所得上清泵入层析柱中，分步收集穿透样品，结果见图1。根据电泳结果显示目的蛋白与填料能够结合，但是大部分目的蛋白存在于破菌沉淀中。
(2)DEAE Sepharose FF：DEAE柱再生并重新平衡好后将表达体系试验所得上清泵入层析柱中，分步收集穿透样品，结果见图2。根据电泳结果显示目的蛋白与填料能够结合，但是大部分目的蛋白存在于破菌沉淀中。
根据Q柱与DEAE柱电泳结果显示，目的蛋白能够与Q、DEAE阴离子填料结合，上清中仅含有少量目的蛋白而沉淀中所含目的蛋白较多，因此该菌体表达的目的蛋白主要以包涵体方式存在。
实施例2包涵体制备工艺研究
(1)裂解液与洗涤液的选择：
选择25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)含150mmol/L NaCl、2mmol/L EDTA-2Na菌体破碎用缓冲溶液。
选择纯化水+1％脱氧胆酸钠(W:V)作为包涵体洗涤用溶液Ⅰ。
选择25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)含150mmol/L NaCl、2mmol/L EDTA-2Na、1％Triton X-100(V:V)作为包涵体洗涤用溶液Ⅱ。
选择25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)作为包涵体洗涤用溶液Ⅲ。
其中各种成分作用：
a：Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)：提供足够的缓冲能力，保证工作液的pH环境；
b：EDTA-Na：金属离子螯合剂，可减少金属离子对释放的目标蛋白的氧化作用，同时EDTA还能起到破坏细胞内膜的作用；
c：NaCl：可调节溶液渗透压，促进细胞的破碎，同时增加溶液离子强度，增强脱氧胆酸钠、Triton X-100的去污能力。
d:脱氧胆酸钠：一种离子型表面活性剂，主要用于溶解去除沉淀中的杂蛋白，同时促进细胞的裂解。
e:Triton X-100：一种非离子型表面活性剂，主要用于溶解去除沉淀中的膜蛋白。
(2)破菌：发酵菌体与裂解液以1：5(W/V)重悬，使菌体充分混悬，按每克菌体加入0.8mg溶菌酶搅拌，37℃保温30min，期间不断搅拌，37℃保温后采用超声破碎至溶液不粘稠。
(3)脱氧胆酸钠洗涤：破菌后经离心获得沉淀，将沉淀投入洗涤液按1:10(W/V，菌体：洗涤液)比例进行充分搅拌混悬，充分混悬后离心收取沉淀备用。
(4)Triton X-100洗涤：将上一步制备的沉淀投入洗涤液按1:10(W/V，菌体：洗涤液)比例进行充分搅拌混悬，充分混悬后离心收取沉淀备用。
(5)Tris洗涤：将上一步制备的沉淀投入洗涤液按1:10(W/V，菌体：洗涤液)比例进行充分搅拌混悬，充分混悬后离心收取沉淀即为所需包涵体。
(6)摸索过程采用两种方式进行洗涤，第一法采用1％Triton X-100进行洗涤步骤如(4)结果如图3，第二法采用1％Triton X-100加上脱氧胆酸钠洗涤，方法如(3)+(4)结果如图4
将上述洗涤液进行电泳测试，结果显示1％的脱氧胆酸钠对杂蛋白的洗涤效果较好，1％的Triton X-100对目的蛋白下面有一条条带的洗涤效果明显且黄色即能够有效洗涤部分色素，有利于后续阴离子交换层析，因此选择脱氧胆酸钠与Triton X-100作为包涵体洗涤剂。
实施例3包涵体变性与复性
(1)变性复性：选择25mmol/L Tris(pH 7.8)含8mol/L尿素作为变性溶液，25mmol/L Tris(pH7.8)作为复性溶液，将包涵体按1:10(W:V)溶解于变性溶液中离心后即为包涵体变性溶液。将复性溶液按70:1(V:W)低速泵入包涵体溶液中，搅拌混匀，使得尿素终浓度为1mol/L，所得溶液进离心收集上清即为复性后的包涵体溶液。
(2)包涵体复性液吸附试验
包涵体溶解：将破菌沉淀溶解于含有8M尿素的缓冲液中。
包涵体复性：用10倍体积的缓冲液进行透析复性。
DEAE柱层析：将DEAE柱再生并重新平衡好后将包涵体复性上清泵入层析柱中分步收集穿透样品，上样完成后进行再平衡，最后分别用含0.05M、0.1M、0.3M、0.5M NaCl的缓冲液进行洗涤，电泳结果如图5所示，结果显示：0.05M NaCl目的蛋白几乎没有洗脱下来，但是杂蛋白被洗脱下来，0.1M NaCl洗脱出大量目的蛋白，0.3M NaCl洗脱下大量蛋白，且杂蛋白较多。
Q柱层析：将Q柱再生并重新平衡好后将包涵体复性上清泵入层析柱中分步收集穿透样品，上样完成后进行再平衡，最后分别用含0.05M、0.1M、0.2M、0.3M、0.5M NaCl的缓冲液进行洗涤，电泳结果如图6所示，结果显示：0.1M、0.2M NaCl缓冲液能够将目的蛋白洗脱下来，且0.1M洗脱大量较纯目的蛋白，0.2M洗脱目的蛋白量较少，纯度较杂。
疏水柱层析：将过Q柱后洗脱的样品加NaCl使得终浓度为4mol/L，疏水柱用4mol/LNaCl平衡后上样，再用4mol/L NaCl平衡，再分别用含3mol/L NaCl、2mol/L NaCl、1mol/LNaCl、25mmol/L Tris、纯化水进行洗脱，电泳结果如图7所示，结果显示：目的蛋白能够与疏水填料结合，而且用1M NaCl未能洗下目的蛋白，25mmol/L Tris和纯化水中能够洗下目的蛋白。
根据DEAE柱与Q柱电泳结果显示，包涵体复性后纯度较好，目的蛋白能够与阴离子填料结合，在0.05M洗脱下能够去除部分杂蛋白，0.1M洗脱出大部分目的蛋白，0.3M洗脱中有部分目的蛋白但杂质较多，因此阴离子交换适合用于目的蛋白复性后进行目的蛋白的捕获，且目的蛋白能够与疏水填料结合，低盐洗脱目的蛋白，因此疏水层析适合作为DEAE层析的后续纯化步骤。
实施例4
1.破菌：发酵菌体以1:10(W/V)重悬，混悬好菌体后按0.1％添加溶菌酶，按0.001％添加DNA酶，室温搅拌裂解过夜，直至镜检在可见视野范围内无完整大肠杆菌为破碎完全。
2.包涵体洗涤：将破菌后的液体用高速冷冻离心机在转速为9000r/min、温度为4℃时离心30min，收取沉淀备用。25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、150mmol/L NaCl、10mmol/LEDTA-2Na、0.2％脱氧胆酸钠作为洗涤液Ⅰ，上步离心沉淀与洗涤液Ⅰ以菌体比洗涤液Ⅰ1:15(W/V)重悬，使溶液混匀，将重悬后的液体用高速冷冻离心机在转速为9000r/min、温度为4℃离心15min。25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、150mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA-2Na、0.2％Triton X-100作为洗涤液Ⅱ，上步离心沉淀与洗涤液Ⅱ以菌体比洗涤液Ⅱ1:20(W/V)重悬，使溶液混匀，将重悬后的液体用高速冷冻离心机在转速为9000r/min、温度为4℃离心10min，沉淀即为rhFGF-21包涵体。
3.包涵体变性和复性：25mmol/L Tris-HCl(pH8.9)，2mmol/L EDTA-2Na，8mol/L尿素作为变性液，包涵体与变性液以1:14～15(W/V)混合，低温搅拌至包涵体沉淀溶解。将重悬后的液体用高速冷冻离心机在转速为9000r/min、温度为4℃离心30min，离心上清装入截留分子量为3500Da的处理干净的透析袋中。25mmol/L Tris-HCl(pH8.9)，2mmol/L EDTA-2Na作为复性液，复性液用量为包涵体比复性液1:200(W/V)。将含变性蛋白的透析袋放入复性液中，搅拌过夜，将复性好的蛋白液用高速冷冻离心机在转速为9000r/min、温度为4℃离心30min，上清放4℃保存待过柱
4.柱层析：将Q柱再生并重新平衡好后将包涵体复性上清泵入层析柱中分步收集穿透样品，上样完成后进行再平衡，最后分别用含0.05M、0.1M、0.2M、0.3M、0.5M NaCl的缓冲液进行洗涤。将过Q柱后洗脱的样品加NaCl使得终浓度为4mol/L，疏水柱用4mol/L NaCl平衡后上样，再用4mol/L NaCl平衡，再分别用含3mol/L NaCl、2mol/L NaCl、1mol/L NaCl、25mmol/L Tris、纯化水进行洗脱。
表1连续三批rhFGF-21原液检定结果
结果表明，采用本发明的方法得到的重组人成纤维细胞生长因子-21蛋白纯度和活性较高，符合规定。