阅读说明：本技术 一种藜科植物的遗传转化方法 (Genetic transformation method of Chenopodiaceae plant ) 是由 李峰 谢洪涛 于 2019-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种藜科植物的遗传转化方法,具体地,本发明提供了一种对藜科植物进行遗传转化的方法,包括步骤：(i)提供待遗传转化的藜科植物和外源DNA；(ii)将所述外源DNA转染所述待遗传转化的藜科植物的植物细胞,使得所述DNA与所述植物细胞中的染色体发生重组,从而获得经遗传转化的植物细胞；其中,所述植物细胞为生殖细胞；(iii)用步骤(ii)获得的植物细胞进行授精(授粉),并获得合子；(iv)获得由所述合子形成的种子；和(v)任选地,对所述种子发育形成的植株进行遗传转化情况的检测。本发明的方法可显著提高藜科植物的遗传转化效率。(The invention provides a genetic transformation method of a Chenopodiaceae plant, in particular to a genetic transformation method of a Chenopodiaceae plant, which comprises the following steps: (i) providing a Chenopodiaceae plant to be genetically transformed and exogenous DNA; (ii) transfecting the exogenous DNA into a plant cell of the chenopodiaceae plant to be genetically transformed, such that recombination of the DNA with a chromosome in the plant cell occurs, thereby obtaining a genetically transformed plant cell; wherein the plant cell is a germ cell; (iii) (iii) inseminating (pollinating) the plant cells obtained in step (ii) and obtaining zygotes; (iv) obtaining seeds formed from said zygotes; and (v) optionally, detecting the genetic transformation of the plant resulting from the development of said seed. The method of the invention can obviously improve the genetic transformation efficiency of Chenopodiaceae plants.)

一种藜科植物的遗传转化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种藜科植物的遗传转化方法。

背景技术

藜麦(Chenopodium quinoa Willd)是一种营养价值极高的类全谷物，不仅富含蛋白质及钙、铁、锌、维生素等微量营养素和全部的必需氨基酸，还具有提高人群营养水平和预防多种疾病的功能成分。藜麦具有高蛋白、高纤维、高维生素和低脂肪、低糖等特性，而且总多酚、皂甙、黄酮和多糖等含量丰富，在功能食品、化妆品、医药和生物农药研发中发挥了重要作用。藜麦是以减少人类慢性病为目的的“功能食品”的优秀代表，被美国宇航局定位为太空食品，其功能成分以矿物质、维生素、脂肪酸、植物激素和抗氧化剂为主，尤其具有保护脑神经元细胞膜的功效。但是，在我国藜麦的种植依然受海拔、温度等气候因素的制约，使其大规模推广种植具有相当大的困难。

藜麦被***粮食与农业组织(FAO)列为全球10大健康营养食品之一，但因无法通过组织培养等方式实现藜麦转基因，这严重阻碍了科学家们对藜麦基因功能的研究和现代基因工程育种技术在藜麦育种上的应用。

因此，本领域迫切需要开发一种能够提高藜麦遗传转化效率的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够提高藜麦遗传转化效率的方法。

本发明第一方面提供了一种对藜科植物进行遗传转化的方法，包括步骤：

(i)提供待遗传转化的藜科植物和外源DNA；

(ii)将所述外源DNA转染所述待遗传转化的藜科植物的植物细胞，使得所述DNA与所述植物细胞中的染色体发生重组，从而获得经遗传转化的植物细胞；

(iii)用步骤(ii)获得的植物细胞进行授精(授粉)，并获得合子；

(iv)获得由所述合子形成的种子；和

(v)任选地，对所述种子发育形成的植株进行遗传转化情况的检测。

在另一优选例中，所述植物细胞为生殖细胞。

在另一优选例中，所述的植物细胞来自繁殖器官，所述繁殖器官包括花。

在另一优选例中，所述的植物细胞来自雌蕊和雄蕊。

在另一优选例中，所述的植物细胞来自子房、胚珠和/或花药。

在另一优选例中，所述的植物细胞为花粉细胞和/或雄配子体和/或雌配子体。

在另一优选例中，所述植物细胞为***和/或***和/或受精卵。

在另一优选例中，所述植物细胞来自花苞、子房、或胚珠。

在另一优选例中，所述的花粉细胞包括花粉***和/或花粉营养细胞。

在另一优选例中，步骤(iii)中还包括对所述植物细胞在20-35℃(更佳地，24-26℃)暗培养1-5，较佳地，1-3天，更佳地，1-2天，然后光照条件下培养1-10天，较佳地，2-8天，更佳地，3-5天，对植物进行授粉的步骤。

在另一优选例中，所述步骤(ii)之前，还包括步骤(i’)：对所述植物细胞进行前置处理。

在另一优选例中，所述前置处理包括人工去除植物表面疏水的物质。

在另一优选例中，所述藜科植物选自下组：藜麦、甜菜、菠菜、灰菜、灰绿藜、碱蓬、猪毛菜、地肤、或其组合。

在另一优选例中，所述的转染采用农杆菌侵染法或基因枪轰击法。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，通过含有外源DNA的农杆菌侵染液将外源DNA转入所述植物细胞中。

在另一优选例中，所述农杆菌侵染液包括农杆菌菌液和侵染液。

在另一优选例中，所述农杆菌菌液的OD₆₀₀为0.4-2.5，较佳地，0.6-2，更佳地，1-2。

在另一优选例中，所述侵染液包括B5干粉、蔗糖、2-吗啉乙磺酸(MES)、乙酰丁香酮(AS)、赤霉素(GA3)、细胞***素(6-BA)。

在另一优选例中，所述侵染液中，B5干粉的浓度为0.05－5g/L，较佳地，0.1-1g/L，更佳地，0.2-0.5g/L。

在另一优选例中，所述侵染液中，蔗糖的浓度为2-80g/L，较佳地，10-60g/L，更佳地，20-40g/L。

在另一优选例中，所述侵染液中，MES的浓度为0.3-30mg/L，较佳地，1-10mg/L，更佳地，2-6mg/L。

在另一优选例中，所述侵染液中，AS的浓度为5-80mg/L，较佳地，10-60mg/L，更佳地，20-50mg/L。

在另一优选例中，所述侵染液中，GA3的浓度为0.01-5mg/L，较佳地，0.05-2mg/L，更佳地，0.1-1mg/L。

在另一优选例中，所述侵染液中，6-BA的浓度为0.1-10mg/L，较佳地，0.5-6mg/L，更佳地，0.8-3mg/L。

在另一优选例中，所述侵染液还包括表面活性剂。

在另一优选例中，所述表面活性剂选自下组：silwet、MES(脂肪醇聚氧乙烯醚磺基琥珀酸单酯二钠)、DLS(月桂基磺化琥珀酸单酯二钠)、或其组合。

在另一优选例中，侵染液中，所述表面活性剂的浓度为20-800μg/L，较佳地，50-600μg/L，更佳地，100-500μg/L，更佳地，250-350μg/L。

在另一优选例中，所述农杆菌菌株包括根癌农杆菌、发根农杆菌。

在另一优选例中，所述农杆菌菌株选自下组：EHA105、GV3101、AgL1、LBA4404、或其组合。

在另一优选例中，所述转染在初始开花阶段进行。

在另一优选例中，所述转染在初始开花2-10天，较佳地，3-5天进行。

在另一优选例中，所述方法在真空条件下进行。

在另一优选例中，所述的真空条件为：-0.3MPa—-0.01MPa，较佳地，-0.1—-0.01Mpa，更佳地，-0.1—-0.05Mpa。

在另一优选例中，保持真空条件的时间为：1-15min，较佳地，2-10min，更佳地，3-10min，更佳地，4-6min。

在另一优选例中，所述步骤(v)中，将收集的成熟种子阳光条件下暴晒3-5天(或烘干箱中烘2-6天)以去除水分，去壳，浸种(浸液为水)，使其保持相同的萌发效率。

在另一优选例中，步骤(v)中，在萌发4-5天后对遗传转化情况进行鉴定和筛选。

在另一优选例中，用选自下组的方法对遗传转化情况进行鉴定和筛选：PCR、测序、标记基因筛选。

在另一优选例中，所述外源DNA来源于目标载体。

在另一优选例中，所述目标载体选自下组：双元表达载体中的过表达质粒、基因编辑质粒、基因沉默质粒、或其组合。

在另一优选例中，所述目标载体中还含有筛选标记基因。

在另一优选例中，所述外源DNA整合于选自下组的一种或多种质粒：质粒PC3301、pBSE401。

在另一优选例中，所述的筛选标记基因选自下组：抗除草剂基因、抗生素基因(如抗潮霉素基因)、荧光蛋白基因、或其组合。

本发明第二方面提供了一种制备遗传转化植物细胞的方法，包括步骤：

(i)提供待遗传转化的藜科植物和外源DNA；

(ii)将所述外源DNA转染所述待遗传转化的藜科植物的植物细胞，使得所述DNA与所述植物细胞中的染色体发生重组，从而获得经遗传转化的植物细胞。

在另一优选例中，所述植物细胞为生殖细胞。

在另一优选例中，所述的植物细胞来自繁殖器官，所述繁殖器官包括花。

在另一优选例中，所述的植物细胞来自雌蕊和雄蕊。

在另一优选例中，所述的植物细胞来自子房、胚珠和/或花药。

在另一优选例中，所述的植物细胞为花粉细胞和/或雄配子体和/或雌配子体。

在另一优选例中，所述植物细胞为***和/或***和/或受精卵。

在另一优选例中，所述植物细胞来自花苞、子房、或胚珠。

在另一优选例中，所述的花粉细胞包括花粉***和/或花粉营养细胞。

在另一优选例中，所述步骤(ii)之前，还包括步骤(i’)：对所述植物细胞进行前置处理。

在另一优选例中，所述前置处理包括人工去除植物表面疏水的物质。

在另一优选例中，所述藜科植物选自下组：藜麦、甜菜、菠菜、灰菜、灰绿藜、碱蓬、猪毛菜、地肤、或其组合。

在另一优选例中，所述的转染采用农杆菌侵染法或基因枪轰击法。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，通过含有外源DNA的农杆菌侵染液将外源DNA转入所述植物细胞中。

在另一优选例中，所述农杆菌侵染液包括农杆菌菌液和侵染液。

在另一优选例中，所述农杆菌菌液的OD₆₀₀为0.4-2.5，较佳地，0.6-2，更佳地，1-2。

在另一优选例中，所述侵染液包括B5干粉、蔗糖、2-吗啉乙磺酸(MES)、乙酰丁香酮(AS)、赤霉素(GA3)、细胞***素(6-BA)。

在另一优选例中，所述侵染液中，B5干粉的浓度为0.05－5g/L，较佳地，0.1-1g/L，更佳地，0.2-0.5g/L。

在另一优选例中，所述侵染液中，蔗糖的浓度为2-80g/L，较佳地，10-60g/L，更佳地，20-40g/L。

在另一优选例中，所述侵染液中，MES的浓度为0.3-30mg/L，较佳地，1-10mg/L，更佳地，2-6mg/L。

在另一优选例中，所述侵染液中，AS的浓度为5-80mg/L，较佳地，10-60mg/L，更佳地，20-50mg/L。

在另一优选例中，所述侵染液中，GA3的浓度为0.01-5mg/L，较佳地，0.05-2mg/L，更佳地，0.1-1mg/L。

在另一优选例中，所述侵染液中，6-BA的浓度为0.1-10mg/L，较佳地，0.5-6mg/L，更佳地，0.8-3mg/L。

在另一优选例中，所述侵染液还包括表面活性剂。

在另一优选例中，所述表面活性剂选自下组：silwet、MES(脂肪醇聚氧乙烯醚磺基琥珀酸单酯二钠)、DLS(月桂基磺化琥珀酸单酯二钠)、或其组合。

在另一优选例中，侵染液中，所述表面活性剂的浓度为20-800μg/L，较佳地，50-600μg/L，更佳地，100-500μg/L，更佳地，250-350μg/L。

在另一优选例中，所述农杆菌菌株包括根癌农杆菌、发根农杆菌。

在另一优选例中，所述农杆菌菌株选自下组：EHA105、GV3101、AgL1、LBA4404、或其组合。

在另一优选例中，所述转染在初始开花阶段进行。

在另一优选例中，所述转染在初始开花2-10天，较佳地，3-5天进行。

在另一优选例中，所述方法在真空条件下进行。

在另一优选例中，所述的真空条件为：-0.3MPa—-0.01MPa，较佳地，-0.1—-0.01Mpa，更佳地，-0.1—-0.05Mpa。

在另一优选例中，保持真空条件的时间为：1-15min，较佳地，2-10min，更佳地，3-10min，更佳地，4-6min。

在另一优选例中，所述外源DNA来源于目标载体。

在另一优选例中，所述目标载体选自下组：双元表达载体中的过表达质粒、基因编辑质粒、基因沉默质粒、或其组合。

在另一优选例中，所述目标载体中还含有筛选标记基因。

在另一优选例中，所述外源DNA整合于选自下组的一种或多种质粒：质粒PC3301、pBSE401。

在另一优选例中，所述的筛选标记基因选自下组：抗除草剂基因、抗生素基因(如抗潮霉素基因)、荧光蛋白基因、或其组合。

本发明第三方面提供了一种制备经遗传转化的植物的方法，包括步骤：

(a)用本发明第二方面所述方法制备一经遗传转化的植物细胞；和

(b)将所述的经遗传转化的植物细胞再生为植物体，从而获得所述经遗传转化的植物。

本发明第四方面提供了一种经遗传转化的植物，所述的植物是用本发明第三方面所述的方法制备的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种可提高藜麦遗传转化效率的方法，具体地，本发明直接用根癌农杆菌对藜麦的花序进行浸染，将外源基因直接导入到藜麦的生殖细胞中，待收获种子播种后经鉴定、筛选获得藜麦转基因阳性植株。本发明具有极大的应用价值，并能产生巨大的经济效益和社会效益。在此基础上，本发明人完成了本发明。

外源DNA

本文所用的术语“外源DNA”指天然和合成脱氧核糖核酸(DNA)序列，其可任选包括合成核酸类似物。本发明所述核酸可任选是优化的密码子。密码子优化指DNA的密码子使用适合感兴趣细胞或生物体以提高所述重组核酸在感兴趣细胞或生物体中的转录率。技术人员深深了解，核酸由于密码子简并能在一个位置被修饰，而此修饰在翻译后的该位置仍产生同一氨基酸序列，因此可以通过密码子优化以考虑靶细胞或生物体的物种特异性，实现核酸的高效表达。本申请所述的DNA序列可以是特异密码子优化的，用于以下非限制性生物体：藜科植物或藜科植物的任何变种或亚种(如藜麦)。

目标载体

本文所用的术语“目标载体”指整合有外源DNA，并将其递送到靶细胞的转运工具。载体因而包括核酸序列，任选包括调控序列或定位序列以用于直接或间接递送到感兴趣靶细胞或植物所需细胞区室中的植物靶结构。载体也能用于引入氨基酸序列到靶细胞或靶结构。通常，本文所用的载体可以是质粒载体。本发明所述“转染”或“转化”指将本发明所述含有外源DNA的目标载体导入所述植物靶细胞或靶结构，并与靶细胞或靶结构中的基因组发生整合，其中用载体递送的材料会在转染或转化过程中发挥其作用。具体的可以包括农杆菌侵染、基因枪轰击法及其他本领域技术人员所公知的技术。所述“农杆菌侵染”是指在目标载体一定条件下通过主动或被动的方式导入农杆菌细胞内，，再通过农杆菌侵染所述植物靶细胞，并将其目标载体导入植物靶细胞或细胞结构中，所携带的外源DNA与植物基因组发生重组或整合，而使植物基因型或表型发生变化。

在本发明中，目标载体选自下组：双元表达载体中的过表达质粒、基因编辑质粒、基因沉默质粒、或其组合。

在本发明中，合适载体可以是细菌载体，例如农杆菌，如根癌农杆菌(Ag ro bacterium tumefaciens)。

前置处理

在本发明中，所述前置处理包括人工去除植物表面疏水的物质和侵染部位周围的叶片，比如去除花序表面的灰尘和颗粒状分泌物，剪去花序周边的叶片以使侵染部位充分裸露，便于与侵染也充分接触。

本发明的方法

本发明提供了一种对藜科植物进行遗传转化的方法，包括步骤：

(i)提供待遗传转化的藜科植物和外源DNA；

(ii)将所述外源DNA转染所述待遗传转化的藜科植物的植物细胞，使得所述DNA与所述植物细胞中的染色体发生重组，从而获得经遗传转化的植物细胞；

其中，所述植物细胞为生殖细胞；

(iii)用步骤(ii)获得的植物细胞进行授精(授粉)，并获得合子；

(iv)获得由所述合子形成的种子；和

(v)任选地，对所述种子发育形成的植株进行遗传转化情况的检测。

应用

本发明可以用于植物基因工程领域，用于植物研究和育种，尤其是具有经济价值的农作物、林业作物或园艺植物的遗传改良。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次实现了通过农杆菌花序侵染法实现对藜科植物(比如藜麦)的遗传转化，攻克了藜科植物(比如藜麦)转基因技术瓶颈，能够极大促进科学家对藜科植物(比如藜麦)的基因功能研究，并加速藜科植物(比如藜麦)的现代化育种进程，有望使藜科植物(比如藜麦)早日实现推广化种植。

(2)本发明的方法简单易操作，不需要繁琐的无菌操作和组织培养过程，极大的节约了劳动成本和经济成本。

(3)本发明首次对藜科植物(比如藜麦)的植物细胞(比如生殖细胞)进行遗传转化，并可将藜麦的遗传转化效率从0提高到0.5％。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料和试剂如无特殊说明均可从市售渠道获得。

实施例

1.藜麦材料的获取

(1)种植藜麦材料，将材料种植于顶置光气候室。

气候室光照强度为：600-800uM

(2)选取和处理藜麦材料

挑选正在开花的植株，初始开花3-5天，选取高度合适的植株，确保植株在穗不被损坏的情况下能完整置于干燥器中。挑选好的植株要提前一天浇水，侵染前用毛刷刷掉藜麦花序表面的颗粒状疏水物质，并剪掉藜麦花序附近的叶片。

注意：

(1)植物高度如果过高将无法将整个植株放入抽真空的密闭器皿中；

(2)藜麦花序表面有大量的颗粒状疏水物质，如果去除不干净会导致农杆菌浸染液不能有效侵入藜麦花苞中。

2.制备农杆菌侵染液，根癌农杆菌菌株选取EHA105，质粒选取PC3301和pBSE401-gRNA。

具体步骤如下：

(1)取出-80℃保存的已经导入质粒PC3301或PBSE401的根癌农杆菌，在YEP平板上活化24-48小时。

(2挑取菌斑接种到2ml YEP液体培养基中(kan 50mg/L，rif 20mg/L)28℃

过夜摇菌，取200μl菌液接种到200ml YEP培养基(含kan50mg/L,rif

20mg/L)28℃过夜摇菌，直至菌液OD₆₀₀＝1.5。

(3)制备含有如下成分的侵染液：

侵染藜麦花序时侵染液中加入300μg/L表面活性剂(如silwet)。

(4)农杆菌侵染液的制备

将摇好的菌液4000rpm/min离心10min，弃上清，并加入配制好的如上所述的侵染液，重悬细菌。在去上清后的沉淀中加少量侵染液，用枪头吹打混匀后加入与YEB等体积的侵染液。

3.侵染

将植株的花序浸入侵染液中，一并放入连接着真空泵的干燥器中，打开真空泵抽真空5min左右，使得干燥器内气压达到-0.08MPa，关掉真空泵，并将真空泵与干燥器断绝空气流通，保持5min。之后将真空泵与干燥器通气阀打开，缓慢放气。

4.暗培养

将被侵染过的藜麦取出，用聚乙烯朔料袋套住侵染过的花序，置于25℃下暗培养一天，之后去掉聚乙烯朔料袋置于顶置光培养室中培养，浸染后的第3-5天对植物进行授粉。

5.筛选

待种子成熟，收取种子，阳光下暴晒3-5天，并去壳。播种之前先浸种，确保萌发一致。播于营养土中，待萌发4-5天过后，喷洒筛选剂进行筛选。经过筛选压测试basta对于藜麦的致死筛选浓度为50mg/L，basta共喷三次，隔三天喷一次，对50mg/Lbasta有抗性的小苗会存活下来。

6.鉴定

经筛选存活下来的小苗，取叶片进行PCR鉴定和sanger测序鉴定。

7.移栽

经分子鉴定为阳性植株的材料移栽到气候室中，准备收种检测下一代转基因是否可以遗传。

8、结论

农杆菌侵染藜麦花序可以获得稳定的藜麦转基因植株，该方法的遗传转化效率在0.1％-0.5％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。