阅读说明：本技术 一种具有缩醛结构的木脂素类化合物、制备方法及应用 (Lignanoid compound with acetal structure, preparation method and application ) 是由 任冬梅 张华然 王姝麒 王小宁 沈涛 于 2020-06-19 设计创作，主要内容包括：本发明具体涉及一种具有缩醛结构的木脂素类化合物、制备方法及应用。本发明针对香青兰乙醇提取物进行筛选,通过大孔树脂分离及硅胶柱色谱分离的方式获取了式(X)所示化合物,结构如下：<Image he="230" wi="700" file="DDA0002547991230000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>经验证,该结构的化合物具有良好的抗氧化应激活性,对于H<Sub>2</Sub>O<Sub>2</Sub>引发的细胞损伤具有良好的修复效果,并能够调诱导Nrf2及下游基因NQO1和GCLM基因的表达,有望作为一种抗氧化应激成分应用于抗肿瘤及心血管疾病药物的添加。(The invention particularly relates to a lignan compound with an acetal structure, and a preparation method and application thereof. The invention screens the ethanol extract of moldavica dragonhead, and obtains a compound shown in a formula (X) by means of macroporous resin separation and silica gel column chromatographic separation, wherein the structure is as follows: proved by verification, the compound of the structure hasHas good antioxidant stress activity against H 2 O 2 The induced cell damage has good repairing effect, can regulate and induce the expression of Nrf2 and downstream genes NQO1 and GCLM gene, and is expected to be used as an antioxidant stress component to be applied to the addition of anti-tumor and cardiovascular disease medicines.)

一种具有缩醛结构的木脂素类化合物、制备方法及应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有缩醛结构的木脂素类化合物、 其制备方法及所述化合物作为抗氧化活性成分的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而 不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员 所公知的现有技术。

氧化应激(Oxidative Stress，OS)是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状 态，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中 间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老 和疾病的一个重要因素。

现代医学研究证实，氧化应激与细胞死亡、组织损伤、心血管疾病、肿瘤 及神经元退行性病变相关。Nrf2是调节细胞抗氧应激的重要转录因子，可以通 过调节Ⅱ相解毒酶(SOD、MDA、NOS、CAT、GSH-PX等)、抗氧化酶的基因 (HO-1、Nrf2、γ--GCS、SOD、NQO1等)，下游抗氧化基因GR,GCLM等的 表达，增加细胞对氧化应激的抵抗性从而发挥保护作用。

香青兰(学名：Dracocephalum moldavica L.)是唇形科青兰属植物，具有疏 风清热、利咽止咳、凉肝止血之功效。在发明人研究团队以往的研究中，从香青 兰乙醇提取物中筛选获取了一种庚烯二酸二甲酯类化合物，具有良好的抗氧化效 果。天然药物中活性实体化合物的筛选是本领域重要的研究思路，进一步开发其 中的活性物质，具有良好的药物开发意义。

发明内容

基于上述背景技术的记载，本发明针对香青兰乙醇提取物中的活性成分进行 进一步的筛选，通过不断的尝试和探索，获取了结构新颖的化合物，同样具有良 好的抗氧化活性。

基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种具有缩醛结构的木脂素化合物，所述化合物选自 式(X)所示化合物、其药用盐、溶剂化物、立体异构体、多晶型物、代谢产物 及前药；

本发明通过进一步筛分所述化合物，所述具有缩醛结构的木脂素化合物为立 体异构体，选自以下结构：

本发明调整制备方法后，从香青兰的乙醇提取物中获取上述结构的化合物， 所述结构的化合物与以往研究中得到化合物结构差异明显，但仍然显示出良好的 抗氧化活性，作为一种抗氧化活性成分添加至相应药物的开发。

本发明第二方面，提供第一方面所述具有缩醛结构的木脂素类化合物的制备 方法，所述制备方法包括依次采用大孔树脂及硅胶柱色谱分离香青兰乙醇提取物 进行制备。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种组合物或药物制剂，组合物或 药物制剂包含本发明上述第一方面中所述的具有缩醛结构的木脂素类化合物 或其药学上可接受的盐，或者包含本发明上述第一方面中所述的具有缩醛结 构的木脂素类化合物的香青兰提取物或浓缩液，以及可以包括至少一种药学 上可接受的辅料或载体。

在本发明的第四方面，本发明还提供了上述第一方面中所述的具有缩醛 结构的木脂素类化合物或其药学上可接受的盐，或者包含上述具有缩醛结构 的木脂素类化合物的香青兰提取物或浓缩液，或者上述第三方面中所述的组 合物或药物制剂在制备抗氧化的药物中的应用。

依据本领域常规研究思路，本发明所提供的化合物由于具有抗氧化活性， 可以被添加至抗氧化应激相关疾病的治疗药物中，如抗肿瘤药物、抗心血管 疾病药物、抗神经退行性疾病药物等。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

本发明提供了一种具有结构新颖的化合物，所述化合物具有过氧化氢酶样 活性，能够修复H₂O₂引起的细胞损伤，还具有诱导Nrf2及下游通路基因的效果。 该化合物作为抗氧化活性物质有望添加于相关药物的开发；另外，本发明研究结 果对于天然药物的筛选和开发具有借鉴意义。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明 的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1所述化合物的手性拆分及CD特征图。

图2为实施例2中所述化合物I-IV诱导Nrf2及下游基因NQO1和GCLM 的条带图。

图3为实施例3中所述化合物I-IV对H₂O₂引起的PC12细胞损伤的保护 作用。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。 除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普 通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限 制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出， 否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使 用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或 它们的组合。

正如背景技术所介绍的，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种具有 缩醛结构的木脂素类化合物作为抗氧化活性成分的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结 合具体的实施例详细说明本发明的技术方案，以下实施例中所述试剂均为市售产 品。

本发明第一方面，提供一种具有缩醛结构的木脂素化合物，所述化合物选自 式(X)所示化合物、其药用盐、溶剂化物、立体异构体、多晶型物、代谢产物 及前药；

优选的，所述具有缩醛结构的木脂素化合物选自以下结构：

本发明第二方面，提供第一方面所述具有缩醛结构的木脂素类化合物的制备 方法，所述制备方法包括依次采用大孔树脂及硅胶柱色谱分离香青兰乙醇提取物 进行制备。

优选的，香青兰乙醇提取物制备方法如下：以20-95％乙醇回流提取香青兰 至少一次，合并回流液去除溶剂部分得到所述香青兰乙醇提取物。

进一步优选的，所述香青兰采用地上部分全草；更进一步的，所述乙醇的用 量为香青兰地上全草部分质量的3-8倍。

进一步优选的，为了兼顾效率与提取率，所述提取次数以2-6次为宜。

进一步优选的，所述每次回流提取时间为0.5-1.5小时。

在上述优选技术方案的一些具体实施方式中，所述香青兰乙醇提取物制备方 法如下：取粉碎的香青兰地上全草，用60％的乙醇回流提取3次，每次乙醇的用 量均为待提取的香青兰地上全草质量的5倍，每次提取时间为1小时，合并提取液 后浓缩至干，得香青兰提取物。

优选的，所述采用大孔树脂分离的操作如下：将所述香青兰乙醇提取物采用 0.5～1.5倍的水进行混悬得到混悬液，经大孔树脂分离，以水洗脱5-10个柱体积， 后依次使用20％、40％、60％和95％乙醇洗脱，每次洗脱2-6个柱体积，合并40％ 乙醇洗脱液和60％乙醇洗脱液。

进一步优选的，所述大孔树脂为DM130大孔树脂。

优选的，所述采用硅胶柱色谱分离方法如下：将大孔树脂洗脱液浓缩后通过 硅胶柱色谱进行分离，用二氯甲烷/甲醇以体积比100:0-0:100依次洗脱，并获取 二氯甲烷/甲醇以100:20体积比洗脱的部分通过凝胶色谱进行洗脱分离。

进一步优选的，所述凝胶色谱柱Sephadex LH-20柱，采用100％甲醇洗脱。

进一步优选的，所述凝胶色谱洗脱液通过薄层色谱进行跟踪，合并相同物质 的洗脱液。

优选的，所述制备方法还包括通过HPLC从硅胶柱色谱的洗脱液中分离得到 所述木脂素化合物I-IV的混合物的步骤；进一步的，经手性拆分得到化合物I-IV。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种组合物或药物制剂，组合物或药物 制剂包含本发明上述第一方面中所述的具有缩醛结构的木脂素类化合物或其药 学上可接受的盐，或者包含本发明上述第一方面中所述的具有缩醛结构的木脂素 类化合物的香青兰提取物或浓缩液，以及可以包括至少一种药学上可接受的辅料 或载体。

在本发明的实施方式中，所述含有本发明上述第一方面中所述的具有缩 醛结构的木脂素类化合物的香青兰提取物或浓缩液可在本发明上述第二方面 中所述的制备方法中获取，此处所述的提取液或浓缩液可以是分离了具体化 合物的、也可以是同时含有本发明上述第一方面中所述的所有化合物的，即 所述含有本发明上述第一方面中所述的具有缩醛结构的木脂素类化合物的香 青兰提取物或浓缩液可以同时含有本发明的化合物I-Ⅳ中的一种或多种(比如 二种、三种或四种)。

本发明所述的药物组合物通常安全、无毒且为生物学上所需要的，因此， 本发明中所述药学上可接受的载体或赋形剂是无毒且安全的，而且其与本发 明所述化合物的组合也是无毒且安全的。本发明所述的药学上可接受的载体 和赋形剂通常为本领域人员所熟知的，或者可由本领域技术人员根据实际情 况能够确定的。

本发明化合物的药物组合物或药物制剂，本领域技术人员可根据实际情 况有选择的以以下任意方式施与：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、 ***给药、局部给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心 室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选口 服、肌注、腹膜内或静脉内用药方式。

本发明化合物或含有这些化合物的药物组合物或药物制剂可以单位剂量 形式给药。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。液体剂型可以是真溶液类、 胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、 气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、 包合物、填埋剂、贴剂、擦剂等。

本发明的药物组合或药物制剂中还可以含有常用的载体，这里所述可药 用载体包括但不局限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋 白如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酯，山梨酸钾，饱和植物 脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠， 磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维 素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛酯等。载体 在药物组合物中的含量可以是1重量％-98重量％，通常大约占到80重量％。 为方便起见，局部麻醉剂，防腐剂，缓冲剂等可直接溶于载体中。

口服片剂和胶囊可以含有赋形剂如粘合剂，如糖浆，***胶，山梨醇， 黄芪胶，或聚乙烯吡咯烷酮，填充剂，如乳糖，蔗糖，玉米淀粉，磷酸钙， 山梨醇，氨基乙酸，润滑剂，如硬脂酸镁，滑石，聚乙二醇，硅土，崩解剂， 如马铃薯淀粉，或可接受的增润剂，如月桂醇钠硫酸盐。片剂可以用制药学 上公知的方法包衣。

口服液可以制成水和油的悬浮液，溶液，乳浊液，糖浆，也可以制成干 品，用前补充水或其它合适的媒质。这种液体制剂可以包含常规的添加剂， 如悬浮剂，山梨醇，纤维素甲醚，葡萄糖糖浆，凝胶，羟乙基纤维素，羧甲 基纤维素，硬脂酸铝凝胶，氢化的食用油脂，乳化剂，如卵磷脂，山梨聚糖 单油酸盐，***树胶；或非水载体(可能包含可食用油)，如杏仁油，油脂如 甘油，乙二醇，或乙醇；防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，山梨酸。如 需要可添加调味剂或着色剂。

栓剂可包含常规的栓剂基质，如可可黄油或其它甘油酯。

对于胃肠外投药，液态剂型通常由化合物和一种消毒的载体制成。载体 首选水。依照所选载体和药物浓度的不同，化合物既可溶于载体中也可制成 悬浮溶液，在制成注射用溶液时先将化合物溶于水中，过滤消毒后装入封口 瓶或安瓿中。

必须认识到，本发明化合物的最佳给药剂量和间隔是由化合物性质和诸 如给药的形式、路径和不为以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的， 而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程， 即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。

在本发明的第四方面，本发明还提供了上述第一方面中所述的具有缩醛 结构的木脂素类化合物或其药学上可接受的盐，或者包含上述具有缩醛结构 的木脂素类化合物的香青兰提取物或浓缩液，或者上述第三方面中所述的组 合物或药物制剂在制备抗氧化的药物中的应用。

以及，本发明还提供了上述第一方面中所述的具有缩醛结构的木脂素类 化合物或其药学上可接受的盐，或者包含上述具有缩醛结构的木脂素类化合 物的香青兰提取物或浓缩液，或者上述第三方面中所述的组合物或药物制剂 在制备用于防护H₂O₂诱导的细胞氧化损伤的药物中应用；优选地，所述细胞 为PC12细胞。

以及，本发明还提供了上述第一方面中所述的具有缩醛结构的木脂素类 化合物或其药学上可接受的盐，或者包含上述具有缩醛结构的木脂素类化合 物的香青兰提取物或浓缩液，或者上述第三方面中所述的组合物或药物制剂 在制备诱导Nrf2和/或其下游基因表达的药物或生化试剂中的应用；优选地， 所述Nrf2下游基因选自NQO1和GCLM。

以及，本发明还提供了上述第一方面中所述的具有缩醛结构的木脂素类 化合物或其药学上可接受的盐，或者包含上述具有缩醛结构的木脂素类化合 物的香青兰提取物或浓缩液，或者上述第三方面中所述的组合物或药物制剂 在制备Nrf2信号通路激动剂药物或生化试剂中的应用。

在本发明的实施方式中，本发明所述的化合物I、II、III、IV能够诱导 Nrf2及下游基因NQO1和GCLM的表达。在本发明的一些实施方式中，本发 明化合物I-IV诱导Nrf2及下游基因NQO1和GCLM表达的作用在0-50μM的 浓度下呈浓度依赖性，随着化合物浓度的升高，Nrf2及下游基因NQO1和 GCLM的表达量逐渐升高，尤其在12.5-50μM的浓度下，这种诱导表达作用 对浓度的依赖性最为明显，Nrf2及下游基因NQO1和GCLM的表达量的提升 显著，在25-50μM的浓度下，Nrf2及下游基因NQO1和GCLM的表达量仍有 提升，但在该浓度范围下，随浓度的增长，表达量对浓度的依赖性趋缓，表 达量的增长速度减慢。

在本发明的实施方式中，本发明的化合物I、II、III、IV表现出对H₂O₂引起的细胞损伤的保护作用。在一些实施方式中，本发明的化合物I-IV在不低 于25μM的浓度下对200μMH₂O₂引起的细胞损伤表现出保护作用，化合物I-IV 的保护作用相差不大，说明手性碳的构型对于化合物的氧化损伤保护作用影响不 大。

实施例1具有缩醛结构的木脂素类化合物Ⅰ-IV的制备

称取粉碎的香青兰地上全草1000g，用60％的乙醇回流提取3次，每次乙醇 的用量均为5000g，每次提取时间为1小时，合并提取液后浓缩至干，得香青兰 提取物200g，然后加水200g混悬，经DM130大孔树脂分离，用水洗脱8个柱 体积，后续依次用20％、40％、60％和95％乙醇洗脱，均洗脱4个柱体积，将40％ 和60％洗脱液合并，减压浓缩，浓缩物用硅胶柱色谱进一步分离，用体积比 100:0-0:100的二氯甲烷：甲醇依次洗脱，硅胶薄层跟踪各洗脱部分，二氯甲烷： 甲醇为100:20洗脱部分合并，浓缩至干，上样至Sephadex LH-20柱，用100％ 甲醇洗脱，硅胶薄层跟踪各洗脱部分，相同洗脱液合并，进一步经HPLC制备及 手性拆分，分别得到化合物I、II、III、IV。化合物I-IV为立体异构体，仅仅是 手性碳构型不同，¹H NMR和¹³C NMR数据一致，如表1所示。

表1化合物I-IV的¹H NMR(600MHz)和¹³C NMR(150MHz)数据

position	<sub>H</sub>,mult(J in Hz)	<sub>C</sub>,type
			1		128.8,C
2	7.04,s	105.7,CH
			3		147.4,C
4		149.4,C
			5	6.79,d(8.0)	107.8,CH
6	7.03,d(8.0)	124.5,CH
			7	7.56,d(15.2)	144.5,CH
8	6.36,d(15.2)	115.4,CH
			9		167.9,C
1′		124.0,C
			2′	6.90,s	115.7,CH
3′		144.8,C
			4′		145.7,C
5′	6.68,d(8.1)	114.4,CH
			6′	6.76,d(8.1)	120.8,CH
7′	4.76,s	82.8,CH
			8′		112.6,C
9′		166.5,C
			OMe-9	3.77,s	50.7,CH<sub>3</sub>
OMe-7′	3.29,s	56.4,CH<sub>3</sub>
			OMe-9′	3.83,s	52.2,CH<sub>3</sub>

化合物Ⅰ-IⅤ的波谱数据如下：

化合物Ⅰ-IⅤ：灰黄色无定形粉末；UV(MeOH)λ_max(log ε)320(4.60),280(3.80)nm；IR(KBr)ν_max 3315,2925,1631,1447,1101cm^–1；¹H and ¹³C NMR数据见表1；HRESIMS m/z 439.0996[M+Na]⁺(calcd.for C₂₁H₂₀NaO₉, 439.1005).

化合物Ⅰ(7'S,8'R):灰黄色无定形粉末；

CD(MeOH) λ(Δε)322(+5.19),252(+2.69)nm。

化合物II(7'R,8'S):灰黄色无定形粉末；CD(MeOH)λ(Δε)323(–5.27),253(–2.56)nm。

化合物III(7'S,8'S):灰黄色无定形粉末；CD(MeOH)λ(Δε)324(–4.48),249(–1.82)nm。

化合物IV(7'R,8'R):灰黄色无定形粉末；

CD(MeOH) λ(Δε)325(+4.73),247(+2.37)nm。

实施例1制得的化合物Ⅰ-IV用作实施例2和3的样品。

实施例2：本发明的化合物诱导Nrf2及其下游基因的表达

实验材料：大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤PC12细胞株购自美国ATCC；Nrf2、 NQO1、GCLM和β-actin抗体购自Santa Cruz公司；

实验方法：(1)细胞处理：细胞以1×10⁶个细胞每孔的密度接种于6孔板， 加化合物Ⅰ-IV的DMSO溶液处理16小时。(2)细胞裂解：细胞处理完成后， 以预冷的PBS洗两次除去残留药物，加入SDS细胞裂解液100μl/孔，细胞刮刀 收集细胞裂解液，煮沸3分钟，超声。(3)Western blot：采用聚丙烯酰胺凝胶电 泳，转膜至硝酸纤维素薄膜，5％脱脂牛奶封闭1小时，1：1000加入一抗室温 孵育2小时，洗3次，每次20分钟，加二抗1：5000室温孵育2小时，洗3次， 每次20分钟，化学发光检测蛋白条带。

实验结果：当化合物I-IV的浓度大于0时，细胞株Nrf2及下游基因NQO1 和GCLM表达水平开始增加，本发明的化合物I-IV表现出对Nrf2及下游基因 NQO1和GCLM表达的诱导作用。并且本实施例的结果还发现，在0-50μM的浓 度下，化合物I-IV对于所述细胞株Nrf2及下游基因NQO1和GCLM表达水平 均呈剂量依赖性诱导作用，特别是在12.5-50μM的浓度下，表达量的提升尤为 显著，当化合物浓度在25-50μM时，这种表达水平的提升趋缓，如图2所示。

实施例3：本发明的化合物对H₂O₂引起的细胞损伤的保护作用

PC12细胞以每孔10000的密度接种于96孔板，生长过夜后，将细胞分为6个 处理组，对照组、H₂O₂处理组、H₂O₂加化合物Ⅰ处理组、H₂O₂加化合物Ⅱ处理 组、H₂O₂加化合物Ⅲ和H₂O₂加化合物IV处理组，H₂O₂的浓度采用200μM，化合 物I-IV均采用30μM。细胞加化合物I-IV预处理4小时后，加入200μM H₂O₂共培 养24小时，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照，然后每孔加入5mg/ml MTT溶液10μl，继续孵育4小时，之后，细胞用DMSO溶液裂解，在570nm读取吸光度。 每个处理组均设3个重复孔，实验进行3次重复。

实验结果：化合物I-IV对H₂O₂引起的细胞损伤均表现出保护作用，细胞形态 的变化如图3所示。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域 的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。