阅读说明：本技术 Pcps及其在制备抗肿瘤药物中的应用 (PCPS and application thereof in preparation of antitumor drugs ) 是由 王群 刘芳艳 张付利 张磊 贾爽爽 滕铁山 汤昆 余琦 胡彬 贾航 姜笑梅 芦 于 2020-06-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于化工医药技术领域,涉及1,5-二[N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚]五碳菁溴化盐染料(简称为PCPS)在制备抗肿瘤药物中的应用。MTT结果显示：PCPS能显著抑制结直肠癌细胞系DLD-1和HCT116细胞活力。动物实验结果显示：PCPS显著抑制人结直肠癌细胞系HCT116 BALB/C裸鼠皮下荷瘤生长,可用于制备抗肿瘤药物。本发明的化合物PCPS作为新型抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发,抑制肿瘤效果显著,将为治疗和治愈肿瘤提供新的治疗途径和手段。(The invention belongs to the technical field of chemical medicines, and relates to application of 1, 5-bis [ N- (3, 5-bis (2- (2-methoxyethoxy) ethoxy) benzyl-2, 3, 3-trimethyl-5-sulfo-3H-indole ] pentacycyanine bromide dye (PCPS for short) in preparation of antitumor drugs. MTT results show that: the PCPS can obviously inhibit the activity of the DLD-1 and HCT116 cells of the colorectal cancer cell lines. The results of animal experiments show that: the PCPS can obviously inhibit the growth of subcutaneous tumor-bearing tumors of nude mice with human colorectal cancer cell line HCT116BALB/C, and can be used for preparing antitumor drugs. The compound PCPS is developed as a novel anti-tumor medicament or an auxiliary component thereof, has obvious tumor inhibition effect, and provides a new treatment way and means for treating and curing tumors.)

PCPS及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于化工医药技术领域，具体涉及一种新型五甲川花菁染料PCPS在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

近些年来，国内外恶性肿瘤的发病率和死亡率呈现不断上升的趋势，成为社会广泛关注的重要公共健康问题，而肿瘤的预防与控制成为了全球卫生战略的重点。而导致人类发病死亡的恶性肿瘤中，结直肠癌稳居前列，严重威胁着人类的健康。目前，对于恶性肿瘤治疗，虽然有多种手段，但仍以手术、化疗治疗为主，但也只能维持患者短暂的寿命，而且还给病人带来了极大的痛苦。因此，开发新型的毒副作用小抗肿瘤性能优良的靶向药物是万众所需，也是广大科研人员努力奋斗的目标。

新型五甲川花菁染料PCPS设计合成与其在制备抗肿瘤药物中的应用为本课题组首次研究，并且实验发现此化合物具有治疗结直肠癌的潜能，目前没有关于该化合物相关抗肿瘤活性的研究。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种新型花菁染料作为药物的新用途，具体为PCPS在制备抗肿瘤药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

新型五甲川花菁染料PCPS在制备抗肿瘤药物中的应用，所述PCPS的化学结构如下所示。

其相关性质如下：

化学名称：1,5-二[N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚]五碳菁溴化盐染料(简称为PCPS)

分子式：C₆₇H₉₃N₂O₂₂S₂ ^2-；分子量：1342.59；检测方式：¹H NMR、¹C NMR和ESI-MS；性状：蓝色固体；来源：本实验室合成。药理性质：溶于水。

进一步的，所述PCPS的抗肿瘤作用浓度为6.25-100μM。

本发明提供了一种体外抑制肿瘤细胞活力的方法，将PCPS加入肿瘤细胞的培养液中，加入PCPS的终浓度为6.25-100μM。所述肿瘤细胞是结直肠癌细胞系DLD-1和HCT116。

本发明提供了一种体内抑制肿瘤生长的方法，其将PCPS经瘤旁组织注射到BALB/C裸鼠体内，注射PCPS的剂量为27.8mg/kg。所述体内模型可以是结直肠癌细胞系HCT116BALB/C裸鼠皮下荷瘤模型。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物的活性成分为PCPS。

本发明提供的PCPS通过光热活性发挥抗肿瘤作用，即含有活性成分PCPS的抗肿瘤药物通过光热效应，可以显著抑制结直肠癌肿瘤HCT116和SW480细胞活力。

本发明的有益效果。

本发明提供了PCPS在制备抗肿瘤药物中的应用。MTT结果显示：PCPS能剂量依赖的抑制结直肠癌DLD-1和HCT116细胞的增殖。动物实验结果显示：PCPS显著抑制人结直肠癌细胞系HCT116 BALB/C裸鼠皮下荷瘤生长。本发明的小分子化合物PCPS作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑制肿瘤效果显著，将为治疗和治愈肿瘤提供新的治疗途径和手段。

附图说明

图1.PCPS结构鉴定¹H NMR(A)、¹³C NMR(B)和ESI-MS(C)数据。

图2.PCPS抑制结直肠癌DLD-1和HCT116细胞活力的测定。

图3.PCPS抑制结直肠癌HCT116细胞BALB/C裸鼠皮下荷瘤生长的测定。

图4.PCPS抑制结直肠癌DLD-1和HCT116细胞活力PTT和PDT性能的测定。

具体实施方式

为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实验方法：

应用实例1、PCPS合成。

合成路线如下：

向50mL二口圆底烧瓶中加入丙二醛双苯亚胺盐酸盐(26.5mg，0.093mmol，1.0eq)，化合物5(119.9mg，0.18mmol，2.0eq)，除氧30min，加入除氧的冰乙酸5mL和乙酸酐5mL，搅拌10min，氩气保护下110oC反应3h。TLC监控反应结束，冷却至室温，旋蒸除去溶剂得粗品。粗品经柱层析(200-300目硅胶，流动相：甲醇:二氯甲烷＝1:10)分离得蓝色固体化合物Cy5-peg-SO3：49.0mg，产率：39.2％。1H NMR(400MHZ,DMSO-d6)δ8.40(d,J＝12.8Hz,2H),7.87(s,2H),7.62(d,J＝8.4Hz,2H),7.28(d,J＝8.4Hz,2H),6.51-6.36(m,9H),5.29(s,4H),4.00(m,8H),3.67(m,8H),3.53-3.46(m,24H),3.40-3.38(m,8H),3.20(s,12H),1.74(s,12H)；13C NMR(100MHZ,DMSO-d6)δ173.80,160.06,155.02,145.27,142.24,140.40,137.27,126.51,126.25,120.11,110.46,105.21,104.23,100.03,71.27,69.91,69.78,69.59,68.79,67.27,58.05,49.07,46.65,27.22；MS(ESI):calcd for[M]-1342.59,found1342.56。结构鉴定图谱见图1，结构鉴定1H NMR(A)见图1-A，HRMS(B)数据见图1-B，ESI-MS数据见图1-C。

应用实例2、MTT法测定PCPS对结直肠癌细胞系DLD-1和HCT116细胞活力的抑制作用。

DLD-1细胞按3×10³/孔接种至96孔板，应用含5％CO₂、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基37℃培养24h，加入不同浓度(分别为3.12μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM)的PCPS，每个浓度设定3个复孔，药物作用1h后，给与0.4W近红外光照，每孔照射2min，继续培养24h，弃培养液，MTT试剂测定细胞活力。

测定方法为：15μL/孔加入预先配制好的MTT反应液，继续培养4h，吸弃上清，100μL/孔加入DMSO溶解还原产物，避光反应5min，490nm波长处读取吸光度值，计算细胞活力，以测定PCPS干预孔吸光度值/对照孔吸光度值作为细胞活力。

IC50指细胞生长被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为结直肠癌细胞系DLD-1和HCT116细胞数量分别为对照组一半时PCPS的浓度。

结果：PCPS对结直肠癌DLD-1和HCT116细胞的IC₅₀值分别为7.3μM、10.3μM,见图2，其中A.PCPS抑制结直肠癌HCT116细胞活力的测定。B.PCPS抑制结直肠癌DLD-1细胞活力的测定。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。

应用实例3、PCPS抑制结直肠癌HCT116细胞BALB/C裸鼠皮下荷瘤生长

测定方法为：以皮下注射方式建立结直肠癌HCT116细胞BALB/C裸鼠皮下荷瘤模型，按照27.8mg/kg的剂量，尾静脉注射给予PCPS干预治疗同时给与0.4W近红外光照，裸鼠实施安乐死并切取肿瘤组织，确定PCPS抑制结直肠癌HCT116细胞BALB/C裸鼠皮下荷瘤生长的作用。

结果：PCPS显著抑制结直肠癌细胞系HCT116 BALB/C裸鼠皮下荷瘤生长。见图3，其中A.不同处理下的肿瘤图像；B.从上到下、从左到右依次为不同处理下的裸鼠心脏指数、肝脏指数、脾脏指数、肺脏指数、肾脏指数和肿瘤重量比较；C.不同处理下肿瘤体积的变化曲线；D.不同处理下肿瘤重量的变化曲线。

应用实例4、PCPS通过光热效应抑制结直肠癌细胞系DLD-1和HCT116细胞活力

DLD-1和HCT116细胞按3×10³/孔接种至96孔板，应用5％CO₂、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基37℃培养24h，加入不同浓度(分别为3.12μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM)的PCPS，每个浓度设定3个复孔，药物作用1h后，将96孔板放置冰上并给与0.4W近红外光照，每孔照射2min，继续培养24h，弃培养液，MTT试剂测定细胞活力以初步确定PCPS的光热性能。

DLD-1和HCT116细胞按3×10³/孔接种至96孔板，应用5％CO₂、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基37℃培养24h，加入不同浓度(分别为3.12μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM)的PCPS，同时加入5mM的N-乙酰-半胱氨酸(NAC)，每个浓度设定3个复孔，药物作用1h后，给与0.4W近红外光照，每孔照射2min，继续培养24h，弃培养液，MTT试剂测定细胞活力以确定PCPS的光动力性能。

用分析天平精确称量一定量的样品PCPS，配成1×10^-3M的水溶液作为母液，置于冰箱中保存备用。测试时将母液取出自然升至室温，用移液枪取50μL母液于5mL容量瓶中，补加水至刻度线，振荡摇匀，得1×10^-5M的待测水溶液。取待测样品水溶液2mL于24孔板中，用移液枪加入3μL固定浓度的SOSG探针甲醇溶液，再补加计算量甲醇使SOSG探针最终检测浓度为1.5μM，甲醇在溶液中的体积含量为2％。振荡混匀后用激光器(660nm，0.5w/cm²)照射样品溶液2min。照射后快速转移样品至比色皿中，立即在荧光分光光度计上测定样品在500nm～600nm处的荧光发射光谱，激发波长为494nm，Ex＝5nm，Em＝5nm。SOSG探针的最大发射波长在530nm，以该发射波长处对应的荧光强度来量化单线态氧的生成。

用分析天平精确称量一定量的样品PCPS，配成1×10^-3M的水溶液作为母液，置于冰箱中保存备用。测试时将母液取出自然升至室温，用移液枪取500μL母液于5mL容量瓶中，补加水至刻度，振荡摇匀，得100μM的贮备液溶液。贮备液经梯度稀释配置成不同浓度的待测水溶液。取空白水溶液及待测水溶液2mL于24孔板中，并分别用(660nm，0.5w/cm²)激光器单孔持续照射2min，同时用红外摄像仪分别在0、0.5、1、1.5和2min时记录温度变化。

结果：PCPS通过光热效应显著抑制结直肠癌肿瘤DLD-1和HCT116细胞活力。见图4，其中A.PCPS抑制结直肠癌HCT116细胞活力PTT和PDT性能的测定；B.PCPS抑制结直肠癌DLD-1细胞活力PTT和PDT性能的测定；C.不同浓度的PCPS经激光照射后的单线态氧生成能力比较；D.不同浓度的PCPS在接受近红外激光照射过程中的温度变化曲线。

由上述实验结果可以看出：PCPS通过光热效应显著抑制结直肠癌肿瘤DLD-1和HCT116细胞活力，并显著抑制结直肠癌细胞系HCT116 BALB/C裸鼠皮下荷瘤生长，可用于制备抗肿瘤药物。本发明的小分子化合物PCPS作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑制肿瘤效果显著，将为治疗和治愈肿瘤提供新的治疗途径和手段。