阅读说明：本技术 Cypy及其在制备抗肿瘤药物中的应用 (CYPY and application thereof in preparation of antitumor drugs ) 是由 张磊 王群 陈明亮 常海波 刘徐倩 史霄 汤昆 姜笑梅 节茹 郏若涵 刘文青 于 2020-06-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于化工医药技术领域,涉及1,5-二[N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚]-3-(4-吡啶)五碳菁溴化盐染料(简称为CYPY)在制备抗肿瘤药物中的应用。MTT结果显示：CYPY能显著抑制结直肠癌细胞在DLD-1和SW480细胞活力。动物实验结果显示：CYPY显著抑制人结直肠癌细胞系DLD-1 BALB/C裸鼠皮下荷瘤生长,可用于制备抗肿瘤药物。本发明的化合物CYPY作为新型抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发,抑制肿瘤效果显著,将为治疗和治愈肿瘤提供新的治疗途径和手段。(The invention belongs to the technical field of chemical medicines, and relates to application of 1, 5-bis [ N- (3, 5-bis (2- (2-methoxyethoxy) ethoxy) benzyl-2, 3, 3-trimethyl-3H-indole ] -3- (4-pyridine) pentacycyanine bromide dye (CYPY for short) in preparation of antitumor drugs. MTT results show that: CYPY can obviously inhibit the activity of colorectal cancer cells in DLD-1 and SW480 cells. The results of animal experiments show that: CYPY can obviously inhibit the growth of subcutaneous tumor-bearing tumors of a human colorectal cancer cell line DLD-1BALB/C nude mouse and can be used for preparing antitumor drugs. The compound CYPY is developed as a novel anti-tumor medicament or an auxiliary component thereof, has obvious tumor inhibition effect, and provides a new treatment way and means for treating and curing tumors.)

CYPY及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于化工医药技术领域，具体涉及一种新型五甲川花菁染料CYPY 在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

伴随着全球人口的增加，老龄化、环境污染等因素导致的环境问题越来越突出，恶性肿瘤的检出率及发病率呈逐年上升趋势；肿瘤已经成为现代社会威胁人类最严重的疾病之一，据相关调查显示癌症在发展中国家是首位死因，在发达国家是第二位死因。癌症被称为“老年病”，但近年来，癌症的年轻化趋势也越来越明显。随着诊疗新技术的应用和化疗药物的不断发展，肿瘤患者的预后得到极大的改善，但患者的总生存率没有显著提高。目前，在肿瘤治疗的众多手段中，仍以手术、化疗治疗为主。手术治疗对病人身体有较大程度的损伤，而且肿瘤的进展分期也决定着手术的可行性。目前的化疗药物也存在不同程度的副作用。开发新型抗肿瘤药物仍然是众多相关科研工作者的首要任务。

菁染料具有易于合成、荧光效果好、发射光谱范围可调、便于与生物分子结合等诸多优点,被广泛应用于活体生物细胞标记中。其中花菁染料在医学领域可用于基因探测、蛋白检测、荧光探针等方面。但随着生物技术发展，已合成花菁染料不能满足应用需求。因此，研究开发新型花菁染料对于生物医学领域具有重要意义。新型五甲川花菁染料CYPY设计合成与其在制备抗肿瘤药物中的应用为本课题组首次研究，并且实验发现此化合物具有治疗结直肠癌的潜能，目前没有关于该化合物相关抗肿瘤活性的研究。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种新的材料CYPY及其作为药物的新用途，即CYPY在制备抗结直肠癌药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

CYPY在制备抗肿瘤药物中的应用，所述CYPY的化学结构如下所示：

其相关性质如下：

化学名称：1,5-二[N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚]-3-(4-吡啶)五碳菁溴化盐染料(简称为CYPY)。

分子式：C₇₂H₉₈N₃O₁₆；分子量：1261.56；检测方式：¹H NMR、¹³C NMR和 ESI-MS；性状：本品为蓝色固体颗粒；来源：本实验室合成。药理性质：溶于水。

具体的，所述的CYPY在制备抗结直肠癌药物中的应用，该化合物主要用于抗结直肠癌DLD-1细胞、结直肠癌SW480细胞等。

进一步的，所述CYPY的抗肿瘤作用浓度为0.2—25μM。

本发明提供了一种抑制体外肿瘤细胞增殖活力的方法，将CYPY加入肿瘤细胞培养液中，加入CYPY的浓度为0.2—25μM。所述肿瘤细胞是结直肠癌细胞系DLD-1和结直肠癌细胞系SW480。

本发明提供一种体内抑制肿瘤生长的方法，将CYPY经瘤旁组织注射到 BALB/C裸鼠体内，注射CYPY的剂量为1mg/mL。所述裸鼠体内模型可以是结直肠癌细胞系DLD-1BALB/C裸鼠皮下荷瘤模型。

本发明还提供一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物的活性成分为CYPY。

本发明提供的CYPY通过光热活性和光动力途径发挥抗肿瘤作用。即含有活性成分CYPY的抗肿瘤药物通过光热效应和光动力，可以显著抑制结直肠癌肿瘤DLD-1和SW480细胞活力。

和现有技术相比，本发明的有益效果。

本发明提供了CYPY在制备抗肿瘤药物中的应用。MTT结果显示：CYPY 呈剂量依赖性的抑制结直肠癌细胞系DLD-1和SW480的增殖。动物实验结果显示：CYPY显著抑制人结直肠癌细胞系DLD-1BALB/C裸鼠皮下荷瘤生长。本发明的小分子化合物CYPY作为新的抗肿瘤药物或者辅助成分进行开发，抑制肿瘤效果显著，将为治疗和治愈肿瘤提供新的治疗途径和手段。

附图说明

图1.CYPY结构鉴定¹H NMR(a)、¹³C NMR(b)和ESI-MS(c)数据。

图2.CYPY通过光效应抑制结直肠癌DLD-1和SW480细胞活力。

图3.CYPY通过光热、光动力作用抑制结直肠癌DLD-1和SW480细胞活力

图4.CYPY显著抑制结直肠癌DLD-1BALB/C裸鼠皮下荷瘤生长。

具体实施方式

为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

应用实例1、CYPY合成与结构鉴定。

CYPY按照如下路线合成。

向50mL二口圆底烧瓶中加入2-苯基丙二醛(18.7mg，0.13mmol，1.0eq)，化合物3(144.0mg，0.25mmol，2.0eq)，除氧30min，加入除氧的冰乙酸3mL 和乙酸酐3mL，搅拌10min，氩气保护下110℃反应3h。TLC监控反应结束，冷却至室温，旋蒸除去溶剂得粗品。粗品经柱层析(200-300目硅胶，流动相：甲醇:二氯甲烷＝1:20)分离得蓝色固体化合物CYPY：89.5mg，产率：56.6％。

¹H NMR(400MH_Z,DMSO-d6)δ8.57(d,J＝4.8Hz,2H),8.42(d,J＝14.4Hz, 2H),7.71(d,J＝7.2Hz,2H),7.51(d,J＝8.0Hz,2H),7.42(t,J＝7.6Hz,2H),7.32 (t,J＝7.6Hz,2H),6.85(d,J＝4.8Hz,2H),6.48(s,2H),6.08(s,4H),5.61(d,J＝ 14.4Hz,2H),5.02(s,4H),3.99(m,8H),3.71(m,8H),3.56-3.47(m,24H),3.40-3.37 (m,8H),3.20(s,12H),1.77(s,12H)；¹³C NMR(100MH_Z,DMSO-d6)δ173.71, 160.03,152.36,150.37,142.68,142.32,141.04,137.04,128.66,125.37,124.53, 122.71,111.42,105.01,101.76,99.89,71.24,69.90,69.76,69.57,68.80,67.20, 58.00,49.19,46.83,27.01；MS(ESI):calcd for[M]⁺1261.56,found 1261.10。CYPY 结构鉴定¹H NMR(A)见图1-A，HRMS(B)数据见图1-B，ESI-MS数据见图1-C。

应用实例2、CYPY显著抑制结直肠癌细胞系DLD-1和SW480细胞活力。

DLD-1和SW480细胞分别按3×10³/孔接种至96孔板，应用含5％CO₂、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基37℃培养至细胞完全贴壁，加入不同浓度(分别为25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.56μM、 0.78μM、0.39μM、0.2μM)的CYPY，每个浓度设定5个复孔，药物作用48h 后，弃培养液，MTT法测定细胞活力。

测定方法：15μL/孔加入预先配制好的MTT反应液，继续培养4h，吸弃上清，100μL/孔加入DMSO溶解还原产物，避光反应5min，490nm波长处读取吸光度值，计算细胞存活率，以测定CYPY干预孔吸光度值/对照孔吸光度值作为细胞存活率的数值。

IC₅₀指细胞生长被抑制一半时抑制剂的浓度，这里即为结直肠癌细胞系 DLD-1和SW480细胞数量分别为对照组一半时CYPY的浓度。

结果：CYPY对结直肠癌DLD-1细胞的IC₅₀值为7.58μM，见图2-A；对结直肠癌SW480细胞的IC₅₀值为6.41μM，见图2-B。

DLD-1和SW480细胞按3×10³/孔接种至96孔板，用含5％CO₂、100U/mL 青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基37℃培养至细胞完全贴壁后，加入不同浓度(分别为25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.56μM、 0.78μM、0.39μM、0.2μM)的CYPY，每个浓度设定3个复孔，药物作用24h 后，给予0.5W近红外光照，每孔照射2min，继续培养24h，弃培养液，MTT试剂测定细胞活力。

结果：CYPY在加药24h，0.5W光照后，对结直肠癌细胞的杀伤力明显加强，对结直肠癌DLD-1细胞的IC₅₀值为2.27μM，见图2-C；对结直肠癌SW480 细胞的IC₅₀值为0.75μM，见图2-D。

应用实例3、CYPY通过光热效应和光动力效应抑制结直肠癌细胞系DLD-1 和SW480细胞活力。

DLD-1和SW480细胞按3×10³/孔接种至96孔板，应用5％CO₂、100U/mL 青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基37℃培养至细胞完全贴壁后，加入不同浓度(分别为25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.56μM、 0.78μM、0.39μM、0.2μM)的CYPY，同时加入5mM的N-乙酰-L-半胱氨酸 (NAC)，NAC为抗氧化剂，有效抑制光动力活性产生活性氧对细胞的损伤作用，每个浓度设定3个复孔，药物作用24h，给予0.5W近红外光照，每孔照射2min，继续培养24h，弃培养液，MTT试剂测定细胞活力以确定CYPY的光动力性能。

DLD-1和SW480细胞按3×10³/孔接种至96孔板，应用5％CO₂、100U/mL 青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基37℃培养至细胞完全贴壁后，加入不同浓度(分别为25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.56μM、 0.78μM、0.39μM、0.2μM)的CYPY，每个浓度设定3个复孔，药物作用24h，将96孔板放置冰上给予0.5W近红外光照，每孔照射2min，继续培养24h，弃培养液，MTT试剂测定细胞活力以初步确定CYPY的光热性能。

用分析天平精确称量一定量的样品，配成1×10^-3M的水溶液作为母液，置于冰箱中保存备用。测试时将母液取出自然升至室温，用移液枪取500μL母液于5mL容量瓶中，补加水至刻度，振荡摇匀，得100μM的贮备液溶液。贮备液经梯度稀释配置成不同浓度的待测水溶液。取空白水溶液及待测水溶液2mL 于24孔板中，并分别用(660nm，0.5w/cm²)激光器单孔持续照射2min，同时用近红外成像仪分别在0、0.5、1、1.5和2min时记录温度变化。

结果:CYPY通过光热效应和光动力显著抑制结直肠癌DLD-1和SW480细胞活力，见图3，其中图3-A和3-B分别为CYPY抑制结直肠癌细胞系DLD-1 和SW480细胞活力光动力性能测定；图3-C和3-D分别为CYPY抑制结直肠癌细胞系DLD-1和SW480细胞活力光热性能的测定；图3-E为不同浓度的CYPY 在接受660nm近红外激光照射过程中随照射时长改变的温度变化曲线。

应用实例4.CYPY抑制结直肠癌DLD-1细胞BALB/C裸鼠皮下荷瘤生长。

测定方法为：以皮下注射方式建立结直肠癌DLD-1BALB/C裸鼠下荷瘤模型，按照1mg/mL的剂量，尾静脉给予CYPY干预，干预后的0-72h分别在不同时间点应用小动物活体成像系统检测CYPY在肿瘤组织蓄积水平，确定CYPY 组织靶向性并确定660nm近红外光照射时间。以皮下注射方式建立结直肠癌 DLD-1BALB/C裸鼠下荷瘤模型，按照1mg/mL的剂量，尾静脉给予CYPY干预治疗同时按照小动物活体成像确定的时间给予0.5W近红外光照2min，裸鼠实施安乐死并切取肿瘤组织以及主要器官；确定CYPY抑制结直肠癌DLD-1 BALB/C裸鼠皮下荷瘤生长的作用。

结果：在尾静脉给予CYPY干预后0-48小时内，CYPY显著蓄积到结直肠癌DLD-1BALB/C裸鼠皮下荷瘤组织，并在注射后第四个小时达到峰值。CYPY 显著抑制结直肠癌细胞系DLD-1BALB/C裸鼠皮下荷瘤生长，CYPY对小鼠心、肝、脾、肺、肾无显著影响，见图4，其中A为裸鼠活体成像图，B为瘤体积随治疗时间变化图，C为荷瘤重质量统计图，D为解剖瘤整体图像，E为心脏指数图，F为肝脏指数图，G为脾脏指数图，H为肺脏指数图，I为肾脏指数图，J为裸鼠体重随治疗时间变化图。

由上述实验结果可以看出：CYPY通过光热效应、光动力效应显著抑制结直肠癌肿瘤DLD-1和SW480细胞的活力，并显著抑制结直肠癌细胞系DLD-1 BALB/C裸鼠皮下荷瘤生长，可用于制备抗肿瘤药物。本发明的小分子化合物 CYPY作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑制肿瘤效果显著，将为治疗和治愈肿瘤提供新的治疗途径和手段。