阅读说明：本技术 一种海龙甾醇固体分散体及其在治疗脑卒中的应用 (Syngnathus sterol solid dispersion and application thereof in treating cerebral apoplexy ) 是由 许东晖 梅雪婷 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种海龙甾醇固体分散体及其在治疗脑卒中的应用。所述海龙甾醇固体分散体包括海龙甾醇提取物和聚乙烯吡咯烷酮,其中,所述海龙甾醇提取物为海龙经碱性甲醇水溶液提取后,加入可溶性钙盐溶液沉淀,再丙酮回流、重结晶制得,所得海龙甾醇固体分散体溶解性好,对脑卒中具有显著的治疗作用,可以显著提高脑卒中所引起的外周免疫抑制,同时具有毒性低,安全性高的优点；并且制备方法简单,适用于大规模产业化生产,应用范围广。(The invention belongs to the technical field of biological medicines, and particularly relates to a solid dispersion of Syngnathus sterol and application thereof in treating cerebral apoplexy. The solid dispersion of the syngnathus sterol comprises a syngnathus sterol extract and polyvinylpyrrolidone, wherein the syngnathus sterol extract is prepared by adding a soluble calcium salt solution for precipitation after the syngnathus is extracted by an alkaline methanol aqueous solution, and then carrying out acetone reflux and recrystallization; and the preparation method is simple, is suitable for large-scale industrial production and has wide application range.)

一种海龙甾醇固体分散体及其在治疗脑卒中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种海龙甾醇固体分散体及其在治疗脑卒中的应用。

背景技术

海龙是我国海洋中药材，民间有服用海龙的习惯，用于炖汤用，具有消肿散结的作用，可用于治疗症瘕积聚、瘰疬瘿瘤、跌打损伤、痈肿疔疮等病症。现有研究发现，海龙中含有的活性物质对肿瘤、增生等疾病都具有较好的疗效，如中国专利申请CN1793174A公开了一种海龙抗肿瘤活性蛋白，实验证明，从海龙中提取的活性蛋白单独或与其它药物联合使用均具有抗肿瘤的活性，同时有低毒、增强免疫的特点；中国专利申请CN101019892A公开了一种海龙固体分散体及其制备方法与应用，该固体分散体由经酶解、脱腥等步骤得到的海龙酶解物和聚乙烯吡咯烷酮制成，对***增生和乳腺增生疾病具有良好的疗效，具有毒性低的优点。但是尚未有研究海龙、海龙提取物或制剂在脑卒中类疾病方面的应用，其效果尚不明确。

脑卒中(Stroke)，又称脑血管意外或中风，是因脑血管阻塞和破裂引起的脑血流循环障碍和脑组织功能或结构损害为表现的急性脑血管疾病，近年来已成为全球第二大常见的死因，排在癌症之前。据报道，65岁以上的人脑卒中的风险高达三分之二，排在心脏病之后和癌症之前，其中，南亚人脑卒中的风险特别高，占全球脑卒中死亡的40％。并且，脑卒中不但以高发病率、高死亡率、高致残率危害人民健康，在存活下来的占80％的中风患者中，仅有10％左右能完全恢复正常功能，绝大多数患者都留有偏瘫，失语等后遗症，对社会及家庭都造成了极严重的负担。

目前临床治疗脑卒中的方法主要是服用阿司匹林、氯比格雷、脑活素片、弥可保等，其药效主要为清除脑卒中的局部栓塞。但是，上述药物多为化药，摄入后机体均有不同程度的副作用产生，安全性差，并且，在解除栓塞的同时，也会带来缺血再灌注损伤，造成外周免疫抑制降低。因此，需要开发一种新型治疗脑卒中的药物，在治疗脑卒中的同时，提高外周免疫抑制，达到较好的治疗效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有脑卒中临床治疗药物安全性差，易造成外周免疫抑制降低等问题的缺陷和不足，提供一种新型治疗脑卒中的海龙甾醇固体分散体，在治疗脑卒中的同时，可以提高外周免疫抑制，达到较好的治疗效果，且安全性更高。

本发明的目的是提供一种海龙甾醇固体分散体。

本发明另一目的是提供所述海龙甾醇固体分散体在制备防治脑卒中或脑卒中引起的外周免疫抑制药物中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种海龙甾醇固体分散体，所述海龙甾醇固体分散体包括海龙甾醇提取物和聚乙烯吡咯烷酮，其中，所述海龙甾醇提取物为海龙经碱性甲醇水溶液提取后，加入可溶性钙盐溶液沉淀，再丙酮回流、重结晶制得；

其中，所述碱性甲醇水溶液的制备方法为：将甲醇和水按照体积比(0.125～10)：1混合，加入1～20wt％氢氧化钠或氢氧化钾，即得。

进一步地，所述海龙甾醇提取物和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:(1～40)。实践中发现，将海龙甾醇提取物和聚乙烯吡咯烷酮制成固体分散体后，可以显著提高海龙甾醇在水溶液中的溶解性，显著提高海龙甾醇的吸收和药理功效。

优选地，所述海龙甾醇提取物和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:(2～25)。

优选地，所述海龙甾醇提取物和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:(2～16)。

更优选地，所述海龙甾醇提取物和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:(4～15)。

更进一步地，所述海龙甾醇固体分散体的制备方法具体包括以下步骤：

S1、将海龙干品粉碎，加入碱性甲醇水溶液，加热至回流4～12h，常温过滤，得滤液；

S2、向步骤S2所得滤液中滴加可溶性钙盐，边滴加边搅拌至无沉淀析出，静置、过滤，得沉淀海龙甾醇钙盐；

S3、将沉淀加入丙酮，加热至回流，过滤，滤液浓缩至原体积的10～30％，冷却析晶，用4℃乙醇洗涤结晶，过滤收集结晶、干燥，得海龙甾醇提取物；

S4、将步骤S3所得海龙甾醇提取物溶解于乙醇中，加入聚乙烯吡咯烷酮溶解、混合均匀，喷雾干燥，得海龙甾醇固体分散体。

进一步地，步骤S1中，所述海龙干品与碱性甲醇水溶液的重量体积比为(0.05～0.5)：1g/ml。

更进一步地，步骤S3中，所述沉淀与丙酮的重量体积比为1:(10～20)g/ml。

进一步地，所述海龙甾醇提取物包括如下甾醇组分：24-脱氢胆固醇、胆甾醇、胆固醇、7-烯胆(甾)烷醇、26-降胆-5-胆甾烯3β-OL-25酮、胆甾-5-烯-3-酮、胆甾-4-烯-3-酮、胆甾-3,5-二烯、胆甾-4,6-二烯-3-酮、β-谷甾醇、(3β，5α)胆甾-7-烯-3-羟基。

更进一步地，所述甾醇组分及其重量份数为：24-脱氢胆固醇1～16份、胆甾醇3～14份、胆固醇1～16份、7-烯胆(甾)烷醇2～10份、26-降胆-5-胆甾烯3β-OL-25酮1～15份、胆甾-5-烯-3-酮2～60份、胆甾-4-烯-3-酮5～150份、胆甾-3,5-二烯5～40份、胆甾-4,6-二烯-3-酮5～40份、β-谷甾醇4～60份、(3β，5α)胆甾-7-烯-3-羟基5～60份。

进一步地，甾醇组分还包括药学上可接受的盐、酯、苷或水合物。

更进一步地，所述可溶性钙盐为饱和的可溶性钙盐，包括饱和氯化钙溶液、饱和乙酸钙溶液、饱和葡萄酸钙溶液。

另外的，本发明还提供了所述海龙甾醇固体分散体在制备防治脑卒中或脑卒中引起的外周免疫抑制药物中的应用。

类似的，本发明所述海龙甾醇固体分散体还可以应用在保健食品、食品等领域。

进一步地，所述海龙甾醇固体分散体可根据需求制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、栓剂、口服液等适当的剂型。

更进一步地，每天使用海龙甾醇的剂量一般为1～30000mg，成年人常用量为每天5～10000mg，优选为30～3000mg。

本发明具有以下有益效果：

本发明一种海龙甾醇固体分散体，包括海龙甾醇提取物和聚乙烯吡咯烷酮，其中，所述海龙甾醇提取物为海龙经碱性甲醇水溶液提取后，加入可溶性钙盐溶液沉淀，再丙酮回流、重结晶制得，所得海龙甾醇固体分散体溶解性好，对脑卒中具有显著的治疗作用，可以显著提高脑卒中所引起的外周免疫抑制，同时具有毒性低，安全性高的优点；并且制备方法简单，适用于大规模产业化生产，应用范围广。

附图说明

图1为本发明海龙甾醇纯度测定所得胆固醇标准曲线图。

图2为本发明实验例1海龙甾醇提取物气相质谱图。

图3为本发明实施例2所采用的Morris水迷宫平台示意图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

其中，海龙干品由1kg尖海龙、1kg拟海龙和1kg刁海龙混合而得；

碱性甲醇水溶液的制备方法为：将甲醇和水按照体积比1:0.25混合，加入10wt％氢氧化钠，即得。

海龙甾醇纯度的测定方法(以胆固醇含量计)：

(1)标准曲线制备：精确称量胆甾醇溶于正己烷，配成不同浓度的标准品；准确量取2ml醋酸酐于10ml带塞子的试管中，滴加1滴浓硫酸，并立即加入各浓度标准品溶液1ml，漩涡震荡摇匀后静置10min，在650nm波长下测定各浓度标准溶液的吸光度。以胆甾醇溶液浓度作为横坐标，以胆甾醇溶液相对应的OD值作为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程，结果参见图1。

(2)样品检测：准确称取海龙甾醇提取物65.2mg于50ml容量瓶中，加正己烷溶解、定容，得待测样品溶液；精确吸取2ml醋酐置于10ml带塞子的试管中，滴加1滴浓硫酸，并立即加入稀释后的样品溶液1ml，漩涡震荡混匀后静置10分钟，于650nm波长测光吸收值，并根据胆甾醇标准曲线计算总甾醇的含量。

除非特别说明，以下实施例所用其余试剂和材料均为市购。

实施例1一种海龙甾醇固体分散体

所述海龙甾醇固体分散体的制备具体包括以下步骤：

S1、将1kg海龙干品超微粉碎，加入5L碱性甲醇水溶液，加热回流8h，降温至常温后过滤，得滤液；

S2、向步骤S2所得滤液中滴加饱和氯化钙溶液，边滴加边搅拌至无沉淀析出，静置12h，过滤，得沉淀；

S3、将沉淀加入800ml丙酮，加热至回流4h，过滤，滤液浓缩至原体积的30％，冷却析晶，用300ml 4℃乙醇洗涤结晶，过滤收集结晶、干燥，得23.5g海龙甾醇提取物，测得海龙甾醇纯度为93％；

S4、将步骤S3所得海龙甾醇提取物5g溶解于1000ml无水乙醇中，加入100g聚乙烯吡咯烷酮，加热至溶解，混合均匀，使用小型喷雾干燥机120℃喷雾干燥，得海龙甾醇固体分散体101.2g。

实施例2一种海龙甾醇固体分散体

所述海龙甾醇固体分散体的制备具体包括以下步骤：

S1、将5kg海龙干品超微粉碎，加入35L碱性甲醇水溶液，加热回流8h，降温至常温后过滤，得滤液；

S2、向步骤S2所得滤液中滴加饱和氯化钙溶液，边滴加边搅拌至无沉淀析出，静置12h，过滤，得沉淀；

S3、将沉淀加入2000ml丙酮，加热至回流6h，过滤，滤液浓缩至原体积的10％，冷却析晶，用400ml 4℃乙醇洗涤结晶，过滤收集结晶、干燥，得112.5g海龙甾醇提取物，测得海龙甾醇纯度为92.6％；

S4、将步骤S3所得海龙甾醇提取物10g溶解于1000ml无水乙醇中，加入200g聚乙烯吡咯烷酮，加热至溶解，混合均匀，使用小型喷雾干燥机120℃喷雾干燥，得海龙甾醇固体分散体201.4g。

实施例3一种海龙甾醇固体分散体

所述海龙甾醇固体分散体的制备具体包括以下步骤：

S1、将7kg海龙干品超微粉碎，加入65L碱性甲醇水溶液，加热回流14h，降温至常温后过滤，得滤液；

S2、向步骤S2所得滤液中滴加饱和氯化钙溶液，边滴加边搅拌至无沉淀析出，静置15h，过滤，得沉淀；

S3、将沉淀加入3500ml丙酮，加热至回流8h，过滤，滤液浓缩至原体积的12％，冷却析晶，用600ml 4℃乙醇洗涤结晶，过滤收集结晶、干燥，得174.8g海龙甾醇提取物，测得海龙甾醇纯度为93.5％；

S4、将步骤S3所得海龙甾醇提取物25g溶解于6000ml无水乙醇中，加入900g聚乙烯吡咯烷酮，加热至溶解，混合均匀，使用小型喷雾干燥机120℃喷雾干燥，得海龙甾醇固体分散体892.4g。

实验例1海龙甾醇提取物的检测

1、实验材料：实施例1步骤S3得到的海龙甾醇提取物。

2、实验方法：

准确称量海龙甾醇提取物0.2g加入2ml乙酸酐-吡啶(体积比为2:1)混合溶液，在85℃条件下搅拌酰基化6h，制备成挥发性较好的甾醇乙酸酯，加入3ml蒸馏水，再用正己烷萃取，收集萃取液待测。

气相色谱条件：TG-5SILMS毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm，载气：氦气，流量20ml/min；进样器温度280℃；升温程序，80℃进样，保留3min，第一阶段10℃/min升温至100℃，第二阶段5℃/min升温至180℃，第三阶段2℃/min升温至280℃。质谱条件：电离方式EI，电子能量70eV，离子源温度250℃，扫描速度3.5842s/sec。

3、实验结果：

结果得图2，根据质谱裂解规律并结合谱库检索结果，对各组分进行分析鉴定结果参见表1。

表1海龙甾醇提取物含有的物质

实验例2海龙甾醇固体分散体急性毒性实验

1、实验材料：实施例1制备的海龙甾醇固体分散体。

2、实验对象：NIH系小鼠，体重20±2g，雌雄各半，由广东省医学实验中心提供。

3、实验步骤：

选择健康NIH系小鼠20只，雌雄各半，将实施例1制备的海龙甾醇固体分散体配成150mg/ml受试液，对小鼠一次灌胃受试液0.8ml/20g体重，连续观察七天，小鼠活动敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或异常反应，限于受试物浓度和体积不能再增大，不能测出其LD₅₀，故进行最大耐受量试验。选择健康小鼠20只，雌雄各半，于24小时内分10次灌服海龙甾醇固体分散体受试液(150mg/ml)，每次0.5ml/20g体重，观察7天，此期间让小鼠自由进食和饮水，小鼠活动敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或异常反应。

4、结论：

小鼠每天灌胃给予海龙甾醇固体分散体最大耐受量应不小于0.5×10×0.15×50＝37.5g/kg，即海龙甾醇提取物最大耐受量应不小于5.36g/kg。可见，海龙甾醇提取物属于实际无毒级物质。

实验例3海龙甾醇固体分散体对脑卒中以及脑卒中引起外周免疫抑制的作用

1、实验材料：实施例1制备的海龙甾醇固体分散体；阳性对照组：长春西汀(购自河南润弘制药股份有限公司)。

2、实验对象：雌性昆明鼠，SPF级别，体重约40～45g，购于中山大学实验动物中心，饲养于中山大学实验动物中心屏障设施内。

3、实验步骤：

昆明鼠缺血性脑卒中模型造模(光化学血栓模型)：腹腔注射水合氯醛溶液使小鼠完全麻醉，剔除两眼至颈部的头顶部被毛，碘伏消毒。沿头骨正中纵向剪开头顶皮肤暴露颅骨，清除颅骨表面***膜，并用手术刀休整。以bregma点为基准原点，于矢状缝左侧2.0mm、冠状缝后2.0mm处为手术操作窗口，在解剖镜下用高速颅骨钻打磨暴露的颅骨至50μm左右厚度，保持硬膜完整。用无菌压缩空气吹去打磨的骨粉，用手术刀轻柔修整打磨面，直到滴加PBS可见清晰大脑浅表血管为止。尾静脉注射0.4mL浓度为5％的孟加拉玫瑰红染料溶液，5min后，立即将小鼠置于绿色荧光发射器下，使用绿色激发光定点照射磨薄颅骨处，控制照射面积为1mm²，照射时间15min，激光激发孟加拉玫瑰红染料反应损伤照射部位血管，形成血栓。

手术操作前，用无菌滤纸制作一个中间边长为1mm的正方形漏孔的遮光罩，照射激光时，保护其他颅骨避免激光束照射。缝合头部皮肤，注意保温，将昆明小鼠放回鼠笼。取健康雌性昆明小鼠10只作为正常组，正常组不进行任何处理。另取健康雌性昆明小鼠作为假手术组，对昆明小鼠的手术操作如上，但不注射孟加拉玫瑰红染料，不照射激光。脑卒中模型动物随机分为5组：模型组、阳性对照组(长春西汀)、海龙甾醇固体分散体低剂量给药组、中剂量给药组和高剂量给药组。手术操作后2小时即开始，除长春西汀组通过尾静脉注射给药外，其余各组给予灌胃给药。手术操作后12h，观察实验动物的精神状态，并记录拍照。

至实验结束，分别为假手术对照组、模型组、海龙甾醇固体分散体低、中、高剂量组、阳性药物组，每组10只。同时开始给予受试物，每天通过灌胃方式给药，假手术对照组、模型组小鼠灌胃给予PVP 234mg/Kg体重，海龙甾醇固体分散体低、中、高剂量小鼠灌胃剂量分别为234、468、936mg/Kg体重，阳性药物组腹腔注射长春西汀3.9mg/Kg体重，持续给药30天。实验给药第四周开始，第一天对实验动物进行水迷宫学***台训练，以后记录动物在水迷宫中总行程、目标现象行程、搜寻率、触发平台次数，结果参见表2。其中，Morris水迷宫平台参见图3，由中山大学提供。

实验动物解剖前一天，禁食12h，自由饮水。记录体重，摘眼球取血，EDTA抗凝采血，后脱颈椎法迅速处死实验动物。血液置于4℃冰盒内于摇床上，摇晃，进行血液细胞分类分析，结果参见表3。

4、实验结果：

表2水迷宫行为学考察(Meam±S.D.n＝8)

注：与正常组相比：^△△△P<0.001；与模型组相比：^*P<0.05，^***P<0.001。

由表2可知，模型组与正常组相比，模型组小鼠在水迷宫中的目标现象行程、搜寻率、触发平台次数均明显低于正常组，提示脑卒中模型造成小鼠记忆功能下降。与模型组相比，海龙甾醇低、中、高剂量组小鼠的目标现象行程、搜寻率、触发平台次数均得到显著提高，提示海龙甾醇对脑卒中具有治疗作用，且效果与阳性对照组接近。

表3海龙甾醇对缺血性脑卒中实验动物的血细胞分类的影响(Mean±S.D.n＝8)

注：与正常组相比：^△△P<0.01，^△△△P<0.001；与模型组相比：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

由表3可知，模型组与正常组相比，模型组小鼠血液中的白细胞数、淋巴细胞数、中性细胞数、单核细胞数均明显低于正常组，以淋巴细胞减少最为显著，提示脑卒中模型造成小鼠外周免疫抑制。与模型组相比，海龙甾醇低、中、高剂量组小鼠的白细胞数、淋巴细胞数、中性细胞数、单核细胞数均得到明显的提高，以淋巴细胞增加最为显著，提示海龙甾醇对脑卒中引起的外周免疫抑制具有提高作用，而阳性对照组结果与模型组接近，并没有提高外周免疫抑制的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。