一种带电明胶纳米球胶体凝胶及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 一种带电明胶纳米球胶体凝胶及其制备方法和用途 (Charged gelatin nanosphere colloidal gel and preparation method and application thereof ) 是由 王玉 孔清泉 王华楠 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种带电明胶纳米球胶体凝胶及其制备方法和用途,属于生物医用材料领域。该带电明胶纳米球胶体凝胶由带电明胶纳米球制备而得,带电明胶纳米球是由明胶纳米球悬液经过戊二醛交联后而得；所述明胶纳米球悬液为在明胶水溶液中加入丙酮后而得。本发明带电明胶纳米球胶体凝胶不仅具有良好的可注射性,能够在注射时变为液态,方便注射,注射完毕后变成固态,保持一定的力学强度,抗渗漏；同时,具有良好的可降解性、生物相容性,符合正常髓核的力学特性,具有良好的退变髓核修复作用。填补了当前髓核可替代材料的空白,很好的解决了当前髓核替代材料的不足、性能不佳的问题,具有良好的应用前景。(The invention provides charged gelatin nanosphere colloidal gel and a preparation method and application thereof, belonging to the field of biomedical materials. The charged gelatin nanosphere colloidal gel is prepared from charged gelatin nanospheres, and the charged gelatin nanospheres are obtained by crosslinking gelatin nanosphere suspension through glutaraldehyde; the gelatin nanosphere suspension is obtained by adding acetone into a gelatin water solution. The charged gelatin nanosphere colloidal gel has good injectability, can be changed into liquid when being injected, is convenient to inject, can be changed into solid after being injected, keeps certain mechanical strength and resists leakage; meanwhile, the compound material has good degradability and biocompatibility, conforms to the mechanical characteristics of normal nucleus pulposus, and has good repairing effect on degenerative nucleus pulposus. Fills the blank of the current nucleus pulposus replaceable material, well solves the problems of the current nucleus pulposus replaceable material such as deficiency and poor performance, and has good application prospect.)
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种带电明胶纳米球胶体凝胶及其制备方法和用途。
背景技术
随着社会老龄化的不断加重，脊柱退变性疾病(如腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症等)发病率不断增高，腰腿痛已成为发病率最高的疼痛性疾病之一。据报道，全球腰腿痛患病率高达12％；一项WHO调查显示，37％的青少年每月会至少出现一次腰痛。脊柱的退变是源于椎间盘的退变(变性、失水)，椎间盘由内部的髓核和周围包围的纤维环组成。随着脊柱退变性疾病的不断进展，常规保守治疗仅能部分缓解临床症状，大部分患者不得不最终接受手术治疗。虽然目前针对脊柱退变性疾病的手术方式众多，并且不断趋近微创化，但无论何种手术方式都无法克服如手术损伤、术后复发、邻近节段退变加速、远期疗效不确切等问题，这无疑给个人和社会带来沉重的经济、社会负担。针对椎间盘退变初期的患者，尤其是仅表现为盘源性腰痛的患者，如果能够通过某种方式延缓甚至逆转椎间盘退变进程，将从源头上减少脊柱退变性疾病的发生。随着生物工程技术的飞速发展，通过髓核组织工程技术，实现椎间盘髓核再生、修复已成为可能。
新型椎间盘髓核生物学治疗的目标是促进椎间盘细胞、细胞外基质的再生，从而真正恢复椎间盘的功能和生物力学需求。髓核组织工程包括三部分：种子细胞、细胞因子、支架材料。骨髓间充质干细胞(BMSCs)得益于其获取途径便捷、增殖分化能力强、生长速度快，已被广泛选择作为种子细胞应用。转化生长因子-β1(TGF-β1)已被证实具有独特的促进椎间盘细胞增殖并保持活性、促进细胞外基质合成、减弱分解代谢、增强BMSCs活性并诱导向类髓核细胞分化的作用，已经作为髓核组织工程生物信号因子的不二之选。因此，髓核组织工程的核心便在于髓核替代支架材料的选择和制备。
理想的髓核替代材料应当具有良好的生物安全性、生物相容性、与天然髓核相似的生物力学特性、与自体生物化速度匹配的降解性能，最终实现自动生物化，更重要的是可以通过微创的方式植入椎间盘内部，即具有可注射性。研究者们一直希望通过材料筛选和改性等方面的研究，研制出理想的髓核替代支架材料，但是大量研究结果显示，由于椎间盘内组织结构复杂、血供极差、力学环境复杂，现有材料如天然材料：脱细胞基质、藻酸盐、多肽水凝胶，以及人工合成材料：透明质酸、PLGA等，都不能很好地满足体外功能化髓核的构建要求。在国际上，已有大量科学家通过一些包括纤维蛋白凝胶(GelfoamTM)，透明质酸海绵(HYAFF)以及多肽水凝胶
发明内容
本发明的目的是提供一种带电明胶纳米球胶体凝胶及其制备方法和用途。
本发明提供了一种带电明胶纳米球，它是由明胶纳米球悬液经过戊二醛交联后而得；所述明胶纳米球悬液为在明胶水溶液中加入丙酮后而得。
进一步地，所述明胶纳米球悬液和戊二醛的体积比为1：(1～5)；
和/或，所述明胶为A型明胶；
和/或，所述戊二醛为质量分数为20～30wt％的戊二醛溶液；
优选地，
所述明胶纳米球悬液和戊二醛的体积比为1:1；
所述戊二醛为质量分数为25wt％的戊二醛溶液。
进一步地，所述交联为室温下交联10～20小时；
优选地，所述交联为室温下交联16小时。
进一步地，所述明胶水溶液和丙酮的体积比为1：(1～5)；
优选地，
所述明胶水溶液和丙酮的体积比为1:1.5；
和/或，所述明胶水溶液的质量浓度为1～5w/v％；所述明胶水溶液的pH值为2～3；
和/或，所述在明胶水溶液中加入丙酮时丙酮加入速率为2～5mL/min；
和/或，所述在明胶水溶液中加入丙酮时的拌速度为1000～2000rpm；
更优选地，
所述明胶水溶液的质量浓度为2.5w/v％；所述明胶水溶液的pH值为2.5；
和/或，所述在明胶水溶液中加入丙酮时丙酮加入速率为2mL/min；
和/或，所述在明胶水溶液中加入丙酮时的拌速度为1000rpm。
进一步地，交联后还包括如下步骤：使用甘氨酸溶液去除多余醛基，离心，重悬，干燥；
优选地，
所述甘氨酸溶液的浓度为100～200mM；
和/或，所述甘氨酸溶液和戊二醛的体积比为(1～5)：1；
和/或，所述离心条件为离心转速13000～14000rpm，时间5～10min；
和/或，所述重悬为使用去离子水重悬；
和/或，所述干燥为冷冻干燥；
更优选地，
所述甘氨酸溶液的浓度为100mM；
和/或，所述甘氨酸溶液和戊二醛溶液的体积比为1:1；
和/或，所述离心条件为离心转速13200rpm，时间5min；
和/或，所述重悬为使用去离子水重悬三次；
和/或，所述干燥为冷冻干燥24～48h。
进一步地，所述明胶水溶液的制备方法如下：
(1)将明胶溶于蒸馏水中，得到浓度为1～10w/v％的明胶水溶液；
(2)在明胶水溶液中加入丙酮混匀，静置后去除上清液，用蒸馏水重悬下层沉淀，得到浓度为1～10w/v％的明胶水溶液；
(3)调节明胶水溶液pH至2～3，即得；
优选地，
步骤(1)中，所述明胶水溶液的浓度为5w/v％；
和/或，步骤(2)中，所述明胶水溶液和丙酮的体积比为1：(1～5)；
和/或，步骤(2)中，所述明胶水溶液的浓度为2.5w/v％；
和/或，步骤(3)中，所述调节pH使用10％盐酸；
和/或，步骤(3)中，所述调节明胶水溶液pH至2.5；
更优选地，
和/或，步骤(2)中，所述明胶水溶液和丙酮的体积比为1:1。
本发明还提供了一种制备前述的带电明胶纳米球的方法，它包括如下步骤：
将明胶纳米球悬液加入戊二醛中交联后，然后使用甘氨酸溶液去除多余醛基，将明胶纳米球悬液离心，重悬，干燥即得。
本发明还提供了一种带电明胶纳米球胶体凝胶，它是由前述的带电明胶纳米球与溶剂混合均匀后水化而得；
优选地，所述带电明胶纳米球胶体凝胶中带电明胶纳米球的质量浓度为10～20w/v％；
和/或，所述水化为0～4℃过夜；
更优选地，所述带电明胶纳米球胶体凝胶中带电明胶纳米球的质量浓度为20w/v％。
进一步地，所述溶剂为超纯水或髓间充质干细胞完全培养基。
本发明还提供了一种制备前述的带电明胶纳米球胶体凝胶的方法，它包括如下步骤：将前述的带电明胶纳米球与溶剂混合均匀后水化而得；
优选地，
它包括如下步骤：将前述的带电明胶纳米球与溶剂分别放入注射器中，两个注射器用双腔鲁尔接头连接，然后推动装有超纯水的注射器，将超纯水注入装有带电明胶纳米球的注射器内，再反向注入，循环10～20次，至带电明胶纳米球与溶剂混合均匀，水化，即得；
更优选地，
所述推动速度为每秒2个循环；
和/或，所述水化为0～4℃过夜。
本发明还提供了一种载骨髓间充质干细胞的带电明胶纳米球胶体凝胶，它是在前述的带电明胶纳米球胶体凝胶上接种骨髓间充质干细胞后而得；
优选地，所述接种为将骨髓间充质干细胞悬液滴在带电明胶纳米球胶体凝胶表面，孵育后而得；
更优选地，所述细胞悬液中细胞密度为500～1000万个细胞/mL。
本发明还提供了前述的带电明胶纳米球、前述的带电明胶纳米球胶体凝胶或前述的载骨髓间充质干细胞的带电明胶纳米球胶体凝胶在制备髓核修复和/或替代材料中的用途；
进一步地，所述材料为修复退变椎间盘的材料。
本发明中w/v的单位为g/mL，本发明中室温为25±5℃，本发明中过夜为12±2h。
本发明使用的明胶颗粒为A型明胶颗粒，300冻力，等电点(IEP)≈9。可以提取自猪皮，也可以购买。
本发明可以在带电明胶纳米球胶体凝胶上接种骨髓间充质干细胞，也可以再加入TGF-β1，进一步诱导种子细胞向类髓核细胞分化，提高修复能力。
本发明需要解决的问题是椎间盘替代材料的选择，针对目前脊柱退变性疾患的治疗方式主要有保守治疗和手术治疗，保守治疗是以缓解症状为主要目的，无逆转退变的作用，而手术治疗的方式有很多，但无论哪种方式都无法克服术后复发、邻近节段退变、远期疗效不确切、组织损伤、经济花费大、并发症多、手术失败致残、致死等风险。因此，本发明希望在脊柱退变的初期，通过植入一种特殊的椎间盘可替代材料植入退变的椎间盘中，起到修复甚至逆转退变椎间盘的作用。
现有技术中，没有一种可以满足髓核替代材料要求的材料真正应用于临床，现有技术椎间盘替代材料主要存在的问题有：①大部分材料制备工艺复杂、造价高；②异体植入后，体内免疫排斥反应剧烈；③细胞和组织相容性不佳(细胞无法在材料中良好的生长，组织修复更无从谈起)；④实现以注射的方式植入椎间盘内部较困难(可注射性差，可注射并不是单纯的像液体一样即可，需要在注射的过程中不破坏他的理化性质，并且需要在注射前有一定的弹性模量，注射时弹性模量减小有利于通过细小的注射针，注射至椎间盘内部后又可以再次形成弹性模量较高的形状，从而满足椎间盘的机械强度需要)；⑤植入体内后无法实现自我降解；⑥机械强度不匹配；⑦植入材料椎间盘修复能力差。
本发明带电明胶纳米球胶体凝胶可以很好克服现有技术存在的问题：①明胶为天然提取物，造价低廉，获取方便，明胶纳米球制备工艺简单；②明胶为胶原提取物，胶原广泛存在于生物体中，因此生物相容性好，植入后免疫排斥反应轻微；③天然材料明胶制成明胶纳米球胶体凝胶，通过调整质量浓度改变微观结构，行程多孔、多表面积的微观结构，有利于细胞的生长和物质交换，同时，免疫原性低，也有利于细胞和组织的生长；④该凝胶具有其他胶体凝胶不具备的特征：剪切变稀-自愈(自修复)，即在通过高剪切力的穿刺针前为半固态，通过时收到剪切力作用改变微观静电作用行程弹性模量较低的液态，有利于迅速通过穿刺针，植入椎间盘内部后立即再次形成半固态(自愈)，达到于椎间盘髓核相同的弹性模量，起到髓核替代的作用，并且半固态胶体凝胶具有防止渗漏、机械保护等作用；⑤该材料植入体内后可以实现80％/1月的自我降解速率并且不产生任何毒性副产物；⑥本材料在植入前搭载复合BMSCs，BMSCs植入后在椎间盘内部的环境下可以向类髓核细胞分化，实现退变髓核修复。
总之，本发明带电明胶纳米球胶体凝胶不仅具有良好的可注射性，能够在注射时变为液态，方便注射，注射完毕后变成固态，保持一定的力学强度，抗渗漏；同时，具有良好的可降解性、生物相容性，符合正常髓核的力学特性，具有良好的退变髓核修复作用。填补了当前髓核可替代材料的空白，很好的解决了当前髓核替代材料的不足、性能不佳的问题，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为不同明胶纳米球的Zeta电位：A为不同戊二醛与自由基的比率下两种明胶纳米球的Zeta电位；B为不同pH值下两种明胶纳米球的Zeta电位。
图2为本发明带电明胶纳米球胶体凝胶理化表征结果：A为各组凝胶与正常髓核的频率扫描结果；B为本发明质量浓度为20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶和质量浓度为20w/v％的普通水凝胶经过高剪切力及剪切力撤销后的弹性模量变化；C为本发明质量浓度为10w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶SEM观察结果；D为本发明质量浓度为15w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶SEM观察结果；E为本发明质量浓度为20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶SEM观察结果。
图3为不同直径穿刺针对混入带电明胶纳米球胶体凝胶的细胞的损伤作用及注入离体椎间盘内部加压后抗渗漏效果：A为不同直径穿刺针注入后细胞活性结果；B为各组注入离体椎间盘内部加压后抗渗漏结果。
图4为接种BMSCs于本发明不同质量浓度带电明胶纳米球胶体凝胶块体表面培养第1天和第7天后的Calcein AM/PI、鬼笔环肽/DAPI荧光染色和SEM观察结果：A1-C1、A2-C2为Calcein AM/PI染色结果；D1和D2为SEM扫描下细胞生长结果；E1和E2为质量浓度为鬼笔环肽/DAPI染色结果。
图5为大鼠皮下埋植实验手术过程：A为埋植术中；B为埋植术后。
图6为大鼠皮下埋植实验结果：A为皮下埋植1周的大体观察结果；B为皮下埋植2周的大体观察结果；C为皮下埋植4周的大体观察结果；D为皮下埋植1周的HE染色结果；E为皮下埋植2周的HE染色结果；F为皮下埋植4周的HE染色结果；G为皮下埋植1周的CD68免疫组化结果；H为皮下埋植2周的CD68免疫组化结果；I为皮下埋植4周的CD68免疫组化结果。
图7为兔腰椎间盘退变模型造模过程：A为术前定位；B为穿刺髓核抽吸术中X线拍摄的正位透视结果；C为穿刺髓核抽吸术中X线拍摄的侧位透视结果。
图8为本发明带电明胶纳米球胶体凝胶对退变椎间盘的修复效果。
图9为本发明带电明胶纳米球胶体凝胶对退变椎间盘的修复效果统计。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
本发明使用的明胶颗粒为A型明胶颗粒，提取自猪皮，300冻力，等电点(IEP)≈9。
单纯的明胶是不带电的，本发明是在普通大分子明胶的基础上，通过加入丙酮，调节pH，最终使用戊二醛对制备的纳米球悬浊液进行交联，通过调整交联过程中的戊二醛与自由基的比率，制得不同交联程度的纳米球。在制备过程中，戊二醛与自由基的比率和pH都会影响纳米球的带电性质(正负)和带电量。前期分别制备了A型和B型两种明胶纳米球，其带电量如图1所示，为了使两种为例分别带有正电和负电而且电位差最大，因此选择戊二醛与自由基的比率为1，pH为7。
本发明使用的骨髓间充质干细胞(BMSCs)采用如下方法提取获得：
(1)取重1.5kg左右新西兰家兔一只，仰卧位固定于固定架，消毒双侧大腿，消毒范围超过髋、膝关节，铺手术洞巾，准备手术；
(2)相连的骨髓穿刺针和注射器中注入低分子肝素1.5mL，兔股骨干中段内侧刺入穿刺针，到达骨面后仔细手动旋转穿刺针穿破骨皮质，直至出现落空感，证实穿刺针已进入骨髓腔，拔出穿刺针针芯，连接10mL空针致穿刺针，用力回抽，见鲜红色骨髓缓慢进入注射器，直至骨髓液停止进入，将已吸取的骨髓液小心移植提前备好的15mL离心管，手动震荡；相同方式取另一侧股骨骨髓液；
(3)移液管反复吹打即提骨髓液，大致配平，封口，密度梯度离心机离心(升9降9，1200rpm，10min)；
(4)弃上清液，加入低糖DMEM 7mL，反复吹打，用注射器抽取淋巴细胞分离液7mL至新的15mL离心管，移液管吸取已重悬的骨髓液沿管壁逐滴加入淋巴细胞分离液中，注意移液管尖部尽量靠近淋巴细胞分离液表层，使骨髓液漂浮其上，封口，大致配平，密度梯度离心机离心(升9降3，2000rpm，20min)；
(5)离心结束后可见4层，移液管吸取中间透明层，加入至新离心管反复吹打，加入低糖DMEM至10mL，密度梯度离心机离心(升9降9，1200rpm，10min)；
(6)离心后弃上清液，加入PBS至7mL，封口配平，密度梯度离心机离心(升9降9，1200rpm，10min)；
(7)离心后弃上清液，加入4-6mL完全培养基，反复吹打混匀，将混悬液移至25T(mm2)培养瓶，显微镜下观察细胞，然后置于5％CO2、37℃孵箱中培养，即得。
实施例1、带电明胶纳米球的制备
(1)称取A型明胶颗粒，在明胶颗粒中加入蒸馏水，50℃下持续搅拌，制成质量浓度为5w/v％的明胶溶液。
(2)在25mL明胶溶液中加入25mL丙酮，混匀静置，待溶液分层后，去除上清液，50℃下使用蒸馏水重悬下层沉淀，得到质量浓度为2.5w/v％的明胶溶液。
(3)待明胶溶液冷却至室温后，用10％盐酸调整明胶溶液的pH至2.5。
(4)向50mL pH为2.5的明胶溶液中逐滴加入丙酮75mL(加入速率约为2mL/min)，同时不断搅拌(1000rpm)，制成明胶纳米球悬液。
(5)立即在明胶纳米球悬液中加入质量分数为25wt％的戊二醛溶液进行交联，明胶纳米球悬液和戊二醛溶液的体积比为1:1。
(6)室温下交联16小时后，加入浓度为100mM的甘氨酸溶液去除多余醛基，甘氨酸溶液和戊二醛溶液的体积比为1:1。
(7)交联后的明胶纳米球悬液重复离心、去离子水重悬三次，每次离心的条件为离心转速13200rpm，时间5min，此时明胶纳米球悬液pH约为7。
(8)将明胶纳米球悬液冷冻干燥24小时，即得带电明胶纳米球(冻干明胶纳米球粉末)，4℃储存备用。此时带电明胶纳米球的电动电势为+9.3±0.3mV。
实施例2、带电明胶纳米球胶体凝胶成胶方法
(1)备3mL螺口注射器、双腔鲁尔接头、称量纸、眼科镊、1mL普通注射器、称量勺，高温灭菌以备用。
(2)无菌条件下精确称取经钴60辐照灭菌的冻干明胶纳米球粉末200mg，移入一只3mL螺口注射器内备用。
(3)将装有明胶纳米球粉末的螺口注射器移入无菌操作台，另一只3mL螺口注射器抽取1mL已预热37℃的超纯水。
(4)用无菌双腔鲁尔接头连接两螺口注射器并扭紧，室温下，迅速推动装有超纯水的注射器，将超纯水注入粉末注射器内，后立即反向注入，快速循环上述操作，速度约为2循环/s，共循环10-20次，直至冻干明胶纳米球粉末与超纯水混匀，无块状不溶粉末出现，得到A型明胶水凝胶。
(5)终止后排出一侧空气，将装有混匀的A型明胶水凝胶的注射器拔出鲁尔接头，置于4℃冰箱过夜，使明胶微粒充分水化，即得质量浓度为20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶。
实施例3、带电明胶纳米球胶体凝胶成胶方法
(1)备3mL螺口注射器、双腔鲁尔接头、称量纸、眼科镊、1mL普通注射器、称量勺，高温灭菌以备用。
(2)无菌条件下精确称取经钴60辐照灭菌的冻干明胶纳米球粉末150mg，移入一只3mL螺口注射器内备用。
(3)将装有明胶纳米球粉末的螺口注射器移入无菌操作台，另一只3mL螺口注射器抽取1mL已预热37℃的超纯水。
(4)用无菌双腔鲁尔接头连接两螺口注射器并扭紧，室温下，迅速推动装有超纯水的注射器，将超纯水注入粉末注射器内，后立即反向注入，快速循环上述操作，速度约为2循环/s，共循环10-20次，直至冻干明胶纳米球粉末与超纯水混匀，无块状不溶粉末出现，得到A型明胶水凝胶。
(5)终止后排出一侧空气，将装有混匀的A型明胶水凝胶的注射器拔出鲁尔接头，置于4℃冰箱过夜，使明胶微粒充分水化，即得质量浓度为15w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶。
实施例4、带电明胶纳米球胶体凝胶成胶方法
(1)备3mL螺口注射器、双腔鲁尔接头、称量纸、眼科镊、1mL普通注射器、称量勺，高温灭菌以备用。
(2)无菌条件下精确称取经钴60辐照灭菌的冻干明胶纳米球粉末100mg，移入一只3mL螺口注射器内备用。
(3)将装有明胶纳米球粉末的螺口注射器移入无菌操作台，另一只3mL螺口注射器抽取1mL已预热37℃的超纯水。
(4)用无菌双腔鲁尔接头连接两螺口注射器并扭紧，室温下，迅速推动装有超纯水的注射器，将超纯水注入粉末注射器内，后立即反向注入，快速循环上述操作，速度约为2循环/s，共循环10-20次，直至冻干明胶纳米球粉末与超纯水混匀，无块状不溶粉末出现，得到A型明胶水凝胶。
(5)终止后排出一侧空气，将装有混匀的A型明胶水凝胶的注射器拔出鲁尔接头，置于4℃冰箱过夜，使明胶微粒充分水化，即得质量浓度为10w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶。
实施例5、载骨髓间充质干细胞的带电明胶纳米球胶体凝胶制备方法
(1)于超净工作台中，将按照实施例2～4其中任一方法制备的带电明胶纳米球胶体凝胶制备成直径4mm、高3mm块体，放入24孔板中，圆面朝下，呈圆柱状摆放，加入500-800μL PBS，置于37℃、5％CO2恒温细胞孵育箱中浸泡过夜。
(2)第二天，于超净工作台中，吸弃浸泡后的PBS，并将24孔板置于无菌操作台上风干残存PBS。
(3)将带电明胶纳米球胶体凝胶块体与BMSCs复合培养：取生长状态良好、达70-80％融合率的P2-P4代兔BMSCs细胞，胰蛋白酶消化，待细胞边界边缘、细胞间距增大时3倍量完全培养基终止消化，1200rpm离心5min，弃上清液后，使用少量完全培养基重悬细胞并计数，调整悬液中细胞密度至500万个/mL。吸取100μL细胞悬液，小心滴在带电明胶纳米球胶体凝胶块体上表面，放回孵箱中静置约2-3小时，待细胞沉降、贴壁后，每孔加入1mL完全培养基，培养基需没过材料块高度，置于5％CO2、37℃条件下培养，每三天换液一次，共培养3天，即得载骨髓间充质干细胞的带电明胶纳米球胶体凝胶。
以下通过具体的试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、带电明胶纳米球胶体凝胶的理化性能表征
一、试验方法
(1)按照实施例2～4所述方法，用超纯水混合实施例1制备的带电明胶纳米球，制备得到质量浓度分别为10w/v％、15w/v％和20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶。另称取原料A型明胶颗粒20g，加入已预热的37℃超纯水100mL，充分均匀搅拌，配制质量浓度为20w/v％的普通水凝胶作为对照组。各组凝胶各取0.5mL，4℃过夜。取正常新西兰家兔2只(雌性，每只体重约为2.5kg)，共取正常椎间盘10个，分别解剖并提取椎间盘髓核组织置于EP管中，总体积约500μL。将各组凝胶和提取的椎间盘髓核组织分别于流变仪进行频率扫描，流变仪配制帕帖板控温系统，选择25mm直径夹具，检测温度25℃，夹具截断高度为500μm。
(2)通过流变仪给予质量浓度为20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶和质量浓度为20w/v％的普通水凝胶正常剪切力(I、III期：1％strain,5min,1Hz)和1000％的高剪切力(II期:1000％strain,5min,1HZ)，模拟体外通过注射器注射的过程(I期表示正常剪切力下的流变学表现，II期表示高剪切力下的流变学表现，模拟从针管中注射时穿过针头的过程，III期为正常剪切力下的流变学表现，模拟从注射器中注射完成恢复正常应力时)，检测不同情况下胶体凝胶的流变学表现，判断各组凝胶剪切变稀-自愈性能。
(3)将质量浓度分别为10w/v％、15w/v％和20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶冻干后进行扫描电镜(SEM)检查，观测各组凝胶的微结构。
(4)观察不同直径穿刺针18G、21G、25G对混入细胞的机械损伤作用：按照实施例2所述方法制备质量浓度为20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶，在制备时将37℃超纯水替换为含BMSCs的完全培养基，培养基中细胞密度为500万个/mL。利用直径18G、21G、25G的穿刺针注射胶体凝胶后，对注射后的胶体凝胶进行细胞培养3天，然后进行Calcein AM/PI免疫荧光染色，观察不同组活死细胞情况并计数。
(5)与质量浓度为20w/v％的普通水凝胶相比，观察带电明胶纳米球胶体凝胶的抗渗漏作用：即选取质量浓度为20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶(明胶纳米球胶体凝胶)和质量浓度为20w/v％的普通水凝胶(明胶水凝胶)，通过18G穿刺针注入离体椎间盘内部，另设21G穿刺针注入浓度为20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶(明胶纳米球胶体凝胶)作为对照，每组通过万能拉力机，给予标本200N的垂直压力，持续1min，然后置于Micro-CT下扫描观察材料的分布及渗漏情况。
二、试验结果
图2A为各组凝胶与正常髓核的频率扫描结果。由图2A可知，质量浓度为20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶与正常髓核(图2A中为disc)的频率扫描结果最接近，质量浓度分别为10w/v％、15w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶和质量浓度为20w/v％的普通水凝胶表现出较差的弹性模量。因此，质量浓度为20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶相对于其他浓度的带电明胶纳米球胶体凝胶和普通明胶水凝胶在应用髓核替代材料中，具有更优的流变学特性。
图2B为质量浓度为20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶(图2B中为NS)和质量浓度为20w/v％的普通水凝胶(图2B中为普通明胶)经过高剪切力及剪切力撤销后的弹性模量变化。结果表明，在I期时，本发明带电明胶纳米球胶体凝胶表现为半固态，在高剪切力(II期)时，本发明带电明胶纳米球胶体凝胶表现为液态，而剪切力取消后(III期)再次表现为半固态，恢复率70-80％，说明本发明带电明胶纳米球胶体凝胶具有很好的剪切变稀-自愈特性，这样的特性一方面可以保证注射完成后凝胶具有与注射前相同的较好的机械性能，另一方面可以防止注射后凝胶由穿刺通道渗漏出椎间盘。而普通明胶水凝胶经过高剪切力后，微观结构破坏，不具备自修复特性，弹性模量降至注射前的10％左右，表现为液态，因此极易从注射通道中渗漏出来。
图2C-E分别为质量浓度为10w/v％、15w/v％和20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶的SEM观察结果，由图可知，随着明胶浓度的提高，胶体凝胶微观结构呈层板状，可以为BMSCs提供更大的细胞粘附面积。
图3为不同直径穿刺针对混入带电明胶纳米球胶体凝胶的细胞的损伤作用及注入离体椎间盘内部加压后抗渗漏效果(Micro-CT图像)。由图3A可知随着穿刺针直径不断变小，死细胞数目逐渐增多，活细胞数目逐渐减少，其中25G穿刺针对细胞损伤最大。由图3B可知，相同直径穿刺针18G注射后，明胶水凝胶出现渗漏，而本发明明胶纳米球胶体凝胶可以有效防止渗漏于椎间盘外侧(仅为穿刺路径中的蔓延)。而同样使用本发明明胶纳米球胶体凝胶时，21G穿刺针由于对纤维环损伤更小，没有向穿刺路径中蔓延。说明相对于普通明胶水凝胶，本发明带电明胶纳米球胶体凝胶具有较好的抗渗漏作用，而穿刺针直径越小，渗漏现象越不明显。
试验例2、BMSCs体外接种培养结果
一、试验方法
按照实施例2～4所述方法分别制备质量浓度为10w/v％、15w/v％和20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶，并按照实施例5所述方法在胶体凝胶表面滴加细胞悬液。滴加完毕后放回孵箱中静置约2-3小时，待细胞沉降、贴壁后，每孔加入1mL完全培养基，培养基需没过材料块高度，置于5％CO2、37℃条件下培养，每三天换液一次。培养1天、7天后利用扫描电镜SEM观察胶体凝胶表面细胞生长情况，并通过鬼笔环肽/DAPI、Calcein AM/PI免疫荧光染色，观察胶体凝胶表面细胞生长情况。
二、试验结果
图4中A1、A2、B1、B2、C1和C2为各质量浓度载骨髓间充质干细胞的带电明胶纳米球胶体凝胶的Calcein AM/PI染色结果，Calcein AM/PI染色结果显示随着明胶质量浓度的提高，接种的BMSCs生长速率逐渐增高，说明A型明胶质量浓度越高，约有助于细胞的生长，促进细胞增殖。图4D1和D2为质量浓度为20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶的SEM图片，图4E1和E2为质量浓度为20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶的鬼笔环肽/DAPI染色结果，图中可得知细胞再胶体凝胶表面生长形态良好。结果说明：BMSCs于带电明胶纳米球胶体凝胶块体表面粘附、生长良好，形态正常，增殖活跃，说明本发明带电明胶纳米球胶体凝胶具有良好的细胞相容性。
试验例3、大鼠皮下埋植实验
一、试验方法
试验动物：健康SD成年雌性大鼠9只，每只体重220-250g，购于四川达硕生物公司，动物房饲养一周后待用。
手术方法：用浓度为1g/mL的水合氯醛，按1mL水合氯醛/300g体重将SD大鼠麻醉，用剃毛器将大鼠背部两侧毛剃光以漏出皮肤，俯卧位置于手术板上，固定其四肢，并用碘伏溶液进行消毒。按照实施例2所述方法制备质量浓度为20w/v％的带电明胶纳米球胶体凝胶，分别以21G注射器两侧皮下注入胶体凝胶各500μL(如图5所示)；随后将大鼠置于热毯上1h，待其苏醒后放回笼中饲养。
术后大体观察：观察术后大鼠饮水、饮食及活动情况，以及注射部位有无异常。
取材及观察：术后7d(1周)、14d(2周)、28d(4周)，每次随机选取3只大鼠，注射过量水合氯醛处死大鼠，根据注射所在位置将已注射的带电明胶纳米球胶体凝胶及周围皮肤、皮下组织取出，于多聚甲醛溶液中固定，分别进行各时间点大体观察，HE染色，CD68免疫组织化学染色，观察结果。
二、试验结果
图6A-C分别为皮下埋植术后1周、2周和4周的大体观察结果，结果显示4周后凝胶基本已于体内降解(降解为80％)。
图6D-E分别为术后1周、2周和4周的HE染色结果，结果显示本发明带电明胶纳米球胶体凝胶随着时间推移，不断降解，同时与周围组织不断浸润、细胞长入，最终降解后被纤维***取代。
图6G-I分别为术后1周、2周和4周CD68免疫组化结果，黄染为巨噬细胞，表示炎性浸润，结果提示第2周时局部炎症反应最强烈，第4周时基本已无巨噬细胞，总体炎性反应较轻。
以上结果表明该材料具有较好的组织相容性和可降解性。
试验例4、负载BMSCs的带电明胶纳米球胶体凝胶修复退变椎间盘效果观察
一、椎间盘退变模型的建立
采用局麻下穿刺抽吸法造兔腰椎间盘退变模型：取体重2.5kg左右新西兰大白兔俯卧位固定于手术台，固定四肢，备皮后，以双侧髂棘最高点连线平对腰5-6椎间隙水平(L5/6位)，用马克笔标记，同时使用马克笔标记腰2-3(L2/3)、腰3-4(L3/4)、腰4-5(L4/5)高度(如图7A所示)，消毒、铺巾。配制0.5％利多卡因注射液，以各节段右侧关节突关节右侧1cm为进针点，逐层注入利多卡注射液因共约1mL。以腰4-5右侧关节突关节右侧1cm为进针点，穿刺入18G注射器针头，进针角度为中央右侧倾斜约60°，缓慢进针致触及L5右侧横突，沿横突内移注射器针头，致横突与椎弓结合处，出现落空感，即为腰4-5椎间盘后外侧缘，必要时可通过X线辅助确认穿刺针位置。继续增大穿测针与中线角度致约75°，缓慢进入椎间盘纤维环，当出现明显落空感即针尖已进入椎间盘髓核，适当压低穿刺针防止针尖穿破椎间盘前缘损伤前方血管，总穿刺距离约5mm。覆盖无菌桌单，于X线光下投射正、侧位X线片，确定穿刺节段及穿刺针位置准确无误(如图7B和图7C所示)。用20mL针筒用力回抽，拔出注射器后用力压出抽出髓核，约40μL。相同方法继续完成腰2-3、腰3-4节段椎间盘造模，腰5-6节段作为正常对照。穿刺点碘伏消毒，术毕，即得兔腰椎间盘退变模型。
二、试验方法
于完成局麻穿刺腰椎间盘退变造模术(椎间盘退变模型建造成功)后4周进行，相同家兔不同节段进行不同干预手段，将试验分为4组，即正常新西兰大白兔组(腰5-6，正常组，NC，不造模)、退变组(腰2-3，Sham，采用试验例4的方法造模)、Gel A组(腰3-4，Gels，采用试验例4的方法造模后，采用实施例2制备的胶体凝胶进行修复)、BMSCs/Gel A组(腰4-5，Gels+Cells，采用试验例4的方法造模后，采用按照实施例2所述方法制备带电明胶纳米球胶体凝胶，并按照实施例5所述方法制备的载骨髓间充质干细胞的带电明胶纳米球胶体凝胶进行修复)。各组用5％戊巴比妥钠1.5mL/kg耳缘静脉注射麻醉，备皮、消毒、铺巾。采用腹前外侧切口，切口位置约为腹正中线至背正中线中线，切口长约12cm，仔细分离皮下组织，沿腹外斜肌肌腱结合处前2cm左右切开腹外斜肌，暴露腰大肌前缘。沿腰大肌、横突末端与腹膜外间隙钝性分离椎前软组织，暴露脊柱右前方。髂棘最高点连线通过L5/6间盘来定位，中号腹腔拉钩暴露椎间盘侧前方，用21G穿刺针头分别在各组椎间盘进行穿刺，尖端保留5cm长度，与纤维环前方平行终板方向刺入，深度控制在5mm左右。按照分组，Gel A组注射实施例2制备的凝胶40μL，BMSCs/Gel A组注射载BMSCs的带电明胶纳米球胶体凝胶40μL，退变组不植入凝胶。逐层缝合伤口，消毒，术毕。术后16周对各组进行大体观察(椎间高度测量)、HE染色、番红O染色、II型胶原免疫组化染色及MRI扫描，评价退变椎间盘修复效果。
三、试验结果
图8、9为本发明带电明胶纳米球胶体凝胶修复退变椎间盘16周的效果。试验结果发现，植入本发明未接种BMSCs的带电明胶纳米球胶体凝胶后即可以有效的修复退变椎间盘，而植入接种了BMSCs的带电明胶纳米球胶体凝胶后退变椎间盘修复效果更佳。说明本发明带电明胶纳米球胶体凝胶退变椎间盘修复效果良好。
综上，本发明带电明胶纳米球胶体凝胶不仅具有良好的可注射性，能够在注射时变为液态，方便注射，注射完毕后变成固态，保持一定的力学强度，抗渗漏；同时，具有良好的可降解性、生物相容性，符合正常髓核的力学特性，具有良好的退变髓核修复作用。填补了当前髓核可替代材料的空白，很好的解决了当前髓核替代材料的不足、性能不佳的问题，具有良好的应用前景。
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