一种具有良好可打印性的细胞3d打印生物墨水制备方法
阅读说明：本技术 一种具有良好可打印性的细胞3d打印生物墨水制备方法 (Preparation method of cell 3D printing biological ink with good printability ) 是由 敖英芳 赵逢源 胡晓青 余慧镭 丁国成 李琪 于 2020-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种具有良好可打印性的细胞3D打印生物墨水制备方法,是应用3小时或更短的胃蛋白酶消化时间处理生物组织粉末制作这种生物组织来源的生物墨水,用于细胞3D打印。本技术方案制备的牙膏状的生物墨水,具有更好的可打印性,使用其打印的支架具有更大的空隙结构,有利于细胞与营养及氧气的接触,进而有利于细胞发挥其生物学作用；3D打印出的结构不会发生塌陷,打印30层依然连续,能够用来构建较复杂的立体多层结构。与现技术的生物墨水的消化时间相比,提高了这种纯的组织来源生物墨水的平面打印准确性和多层堆积的能力,有利于制造各种具有生物活性的组织类器官结构,在组织工程、再生医学和器官模型领域有广泛的应用价值。(The invention relates to a preparation method of cell 3D printing biological ink with good printability, which is used for preparing the biological ink from biological tissue by treating biological tissue powder in 3 hours or shorter pepsin digestion time and is used for cell 3D printing. The biological ink in the dental paste shape prepared by the technical scheme has better printability, and a support printed by the biological ink has a larger gap structure, so that the biological ink is beneficial to the contact of cells with nutrition and oxygen and further beneficial to the cells to play the biological effect; the 3D printed structure can not collapse, 30 layers are printed continuously, and the three-dimensional multi-layer structure can be constructed. Compared with the digestion time of the bio-ink in the prior art, the planar printing accuracy and the multilayer stacking capability of the pure tissue source bio-ink are improved, the preparation method is beneficial to manufacturing various tissue organoid structures with biological activity, and the preparation method has wide application value in the fields of tissue engineering, regenerative medicine and organ models.)
技术领域
本发明属于3D打印生物墨水技术领域，特别是指一种生物组织来源具有良好可打印性的细胞3D打印生物墨水制备方法。
背景技术
3D细胞打印技术已被广泛应用于组织工程、再生医模型中，利用这一先进增材制造技术，研究人员可以制备如心脏组织、肺组织、肾组织、肝组织、胰腺组织或肌肉组织等。
制备具有良好生物学活性和可打印性的生物墨水是实现细胞3D打印的关键步骤，一些化学合成材料和天然材料已经广泛应用于生物墨水的制备。例如：海藻酸盐、明胶、胶原蛋白、纤维素、聚乙二醇以及它们的混合。然而这些材料制备的生物墨水都无法完全模拟生物组织中细胞生存的微环境，这不利于细胞发挥其生物学功能，进而限制了生物应用。
使用生物组织或器官为来源制备生物墨水是最近兴起的一种生物墨水制备方案，这种方法使用溶解于酸性溶液中的胃蛋白酶来溶解生物组织，溶解成为均匀溶液后，把溶液的pH值和渗透压调整为生理条件，进而就可以混合细胞进行细胞3D打印。
现有技术一为生物组织来源生物墨水的制备方法，以猪来源的肌腱组织为例，制备步骤如下：
1)使用过量麻醉的方法处死6个月龄雄性小型猪，取下肢，在膝关节处使用外科手术刀取出髌腱组织，分离并去除周围滑膜组织，放置于4℃条件下的生理盐水中。
2)使用外科手术剪刀将猪来源肌腱组织剪成5mm×5mm×1mm大小的组织块，将组织块浸泡于1％十二烷基磺酸钠(SDS)溶液中，摇床下处理48小时。
3)48小时后使用1％的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)溶液摇床下处理30分钟，然后使用PBS溶液冲洗组织直至组织无法被冲洗出泡沫。
4)将这种脱细胞处理后的组织在-80℃冰箱过夜冷冻，然后放置于冻干机中冻干操作48小时。
5)使用球磨仪将冻干处理后的猪来源肌腱组织研磨成粉末，使用100μm 孔径的网筛过滤粉末。
6)使用0.5M乙酸溶液溶解粉末，粉末的浓度为30mg/ml，并加入胃蛋白酶 (3mg/ml)，放入磁子后在室温条件下使用磁力搅拌器进行搅拌72小时。
7)消化72小时后使用10M氢氧化钠溶液把溶液的pH值调整为7.4，加入一定量的10×PBS溶液把溶解了组织的溶液调整为含有1×PBS，整个操作过程在冰上进行。
8)把细胞悬液与墨水在冰上进行混合均匀，细胞浓度为3×106/L。
9)将混合有细胞的生物墨水放置于3D打印针管中，使用200μm直径的圆柱形直针头进行打印，打印区域放置6cm细胞培养皿，打印条件如下：针管温度：16℃；打印平台温度：37℃；室温：20℃；挤出压力：10kPa；枪头移动速度：25mm/s；打印层间距为160μm；线条间距为：1.2mm。
这种组织来源生物墨水成胶的原理是利用胶原蛋白分子在37℃下发生自组装，形成胶原纤维网格状结构，发生了成胶。然而这种温度控制的温度自主装发生速度较慢，使得打印出来的线条在打印过程中会发生变宽和塌陷，严重影响打印的准确性，如图1所示，使用现有技术一制作的组织来源生物墨水进行3D打印线条增宽塌陷，堵塞了孔隙结构，不利于细胞接触营养物质和氧气；如图2所示，使用技术一制作的组织来源生物墨水进行3D打印，由于胶原蛋白自组装发生较慢，在完全成胶前就发生了塌陷，无法制作复杂结构的生物模型；如何提高这种组织来源生物墨水的可打印性是一个技术难点。
现有技术提出，通过混合其他种类墨水可以提高这种组织来源生物墨水的可打印性，然而这样会改变墨水的微环境结构和生化构成，不利于模拟组织微环境，如何在不改变其构成的基础上提高这种生物墨水的可打印性是一个难点。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有良好可打印性的细胞3D打印生物墨水制备方法，提高生物组织来源的生物墨水可打印性，不改变其成分构成，使其能够用于细胞3D打印并制备较复杂的生物结构。
一种具有良好可打印性的细胞3D打印生物墨水制备方法，包括以下步骤：
1)取刚死亡的猪下肢，在膝关节处取出肌腱组织，放置于4℃条件下的生理盐水中；
2)将步骤1)肌腱组织使用PBS冲洗后浸泡于甲醇和三氯甲烷的混合溶液中3小时，随后使用甲醇溶液浸泡1小时，再使用PBS溶液冲洗3～5遍，以将肌腱组织上的有机溶液洗干净；
3)将步骤2)洗干净的肌腱组织放到0.25％的EDTA胰酶溶液中，4℃下过夜处理12小时后使用PBS溶液冲洗2-3次；
4)将步骤3)经过处理后的肌腱组织置于2％的十二烷基碘酸钠溶液中后在摇床上处理96小时，然后使用PBS溶液冲洗所述肌腱组织直至所述肌腱组织无泡沫被冲洗出来；
5)将步骤4)脱细胞处理后的肌腱组织在-80℃冰箱过夜冷冻，再放入冻干机中冻干48小时；
6)使用球磨仪将步骤5)冻干的肌腱组织研磨成粉末；
7)使用0.1M盐酸溶液溶解步骤6)的粉末，加入胃蛋白酶，在室温条件下磁力搅拌3小时；
8)72小时后使用10M氢氧化钠溶液调pH值为7.4，加入一定量的10×PBS 溶液反溶解了肌腱组织的溶液调整为含有0.33×PBS，本步骤的整个操作过程均在冰上进行；
9)将细胞悬液与墨水在冰上进行混合均匀，制得生物墨水，使得生物墨水最终细胞浓度为3×106个/L；
10)将步骤9)制备的生物墨水放置于3D打印针管中进行打印。
进一步的，刚死亡的猪为使用过量麻醉致死的6个月龄雄性小型猪，在取出肌腱组织后，还要分离并去除周围滑膜组织。
进一步的，步骤2)中肌腱组织为5mm×5mm×1mm大小的组织块；所述甲醇和三氯甲烷的体积比为50：50。
进一步的，在步骤6)中，还包括使用100μm孔径的网筛过滤粉末。
进一步的，在步骤7)中，还包括使用盐酸溶解粉末后的溶液中，粉末的浓度为30mg/ml，加入的胃蛋白酶的浓度为3mg/ml，并在溶液中加入磁子。
进一步的，步骤10)还包括使用直径200μm的圆锥形针头进行打印，打印区域放置6cm细胞培养皿。
具体的打印条件如下：针管温度：16℃；打印平台温度：37℃；室温： 20℃；挤出压力：40kPa；枪头移动速度：15mm/s；打印层间距为160μm；线条间距为：1.2mm。
进一步的，所述生物墨水为牙膏状。
本发明的有益效果是：
本技术方案制备的牙膏状的生物墨水，比现有技术的溶液状墨水有更好的可打印性，使用其进行3D打印能够制备出具有更大的孔隙结构的支架，有利于细胞与营养及氧气的接触，进而有利于细胞发挥其生物学作用。
牙膏状生物墨水3D打印出的支架结构不会发生塌陷，打印30层依然连续，能够用来构建较复杂的立体多层结构。
附图说明
本技术方案的以下附图均是用于表明本申请技术方案的实施情况，并不用于限制本申请技术方案的范围，因此，附图中的数字等均不用于对本申请技术方案的限制。
图1为使用技术一制作的组织来源生物墨水进行3D打印线条增宽塌陷的照片，堵塞了孔隙结构，不利于细胞接触营养物质和氧气。
图2为使用技术一制作的组织来源生物墨水进行3D打印的照片，由于胶原蛋白自组装发生较慢，在完全成胶前就发生了塌陷，无法制作复杂结构的生物模型。
图3为生物墨水消化过程示意图；
图4为生物墨水消化过程大体图像；
图5a-图5c为三种状态生物墨水随温度变化的粘弹性变化趋势图，其中图 5a为牙膏状生物墨水，图5b为蜂蜜状生物墨水，图5c为溶液状墨水，此三图中，区间1的温度为从4℃到15℃，区间2的温度为在15℃停留，区间3的温度为从15℃上升到37℃，区间4为温度在37℃停留；三个图中的上方曲线均为储存模量曲线，下方曲线均为消散模量曲线；
图6为牙膏状生物墨水和溶液状生物墨水在3D打印多层结构能力的对比图。
具体实施方式
以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。
现常规技术制备纯的生物组织来源生物墨水的方法为背景技术中技术一所示的技术，为使用酸性溶液溶解的胃蛋白酶把脱细胞处理后的生物组织粉末消化成溶液，然后在3D打印过程中利用胶原蛋白分子的自组装特性实现成胶，技术一的消化过程时间长达48～72小时。为了缩短消化时间，通过实验验证了溶解于酸性溶液中的胃蛋白酶消化脱细胞处理过的生物组织粉末的过程，如图 3和图4所示，刚开始的几分钟粉末悬浮于酸性溶液中，然后粉末逐渐溶解，形成了一种牙膏状的物质，这种状态一直持续了3个小时，随着胃蛋白酶的消化牙膏状物逐渐变得更加稀薄，在消化12小时的时候变为了蜂蜜状物；进一步消化，变得更加稀薄，到第24小时的时候已经成了溶液状物。
使用牙膏状生物墨水、蜂蜜状的生物墨水及溶液状生物墨水进行3D打印，因为牙膏状生物墨水和蜂蜜状生物墨水的粘度更高，为确定是否具有良好的打印性能，首先检测这三种墨水随温度变化流变学特征，如图5所示。根据三种消化状态生物墨水的粘弹性测试结果，牙膏状生物墨水始终处于胶体状态，从而避免了需要通过温度来调节成胶的步骤，有利于提高生物组织来源生物墨水的可打印性。
本申请的技术方案提供一种具有良好可打印性的细胞3D打印生物墨水制备方法，包括以下步骤：
使用过量麻醉的方法使6个月龄雄性小型猪死亡，在本申请的技术方案中，对小型猪的品种没有特别的要求，只要是小型猪，均符合本申请技术方案的要求。取下死亡小型猪的下肢，在膝关节处使用外科手术刀、组织剪或组织钳取出肌腱组织，分离并去除周围滑膜组织，放置于4℃条件下的生理盐水中。
使用外科手术剪刀将猪来源的肌腱组织剪成5mm×5mm×1mm大小的组织块，将剪好的肌腱组织的组织块使用PBS冲洗后浸泡于甲醇和三氯甲烷的混合溶液中3小时，其中甲醇与三氯甲烷的体积比为50：50，然后使用甲醇溶液浸泡1 小时，最后使用PBS溶液冲洗3～5遍，将肌腱组织上的有机溶液洗干净。
将洗干净的肌腱组织放到0.25％EDTA胰酶溶液中，4℃下过夜处理12小时，然后使用PBS溶液冲洗肌腱组织2～3次；然后使用体积百分比为2％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液摇床上处理96小时，再使用PBS溶液冲洗肌腱组织直到肌腱组织无法被冲洗出泡沫。
将上述脱细胞处理后的肌腱组织在-80℃冰箱过夜冷冻，然后放置于冻干机中冻干操作48小时；使用球磨仪将冻干处理后的猪来源肌腱组织研磨成粉末，使用100μm孔径的网筛过滤粉末。
使用0.1M盐酸溶液溶解粉末，使得溶液中粉末的浓度为30mg/ml，并加入胃蛋白酶，加入量按溶液量的3mg/ml，并在溶液中放入磁子后在室温条件下使用磁力搅拌器进行搅拌3小时。
将上述搅拌后的溶液消化72小时后使用10M氢氧化钠溶液调整pH值为7.4，加入10×PBS溶液把溶解了组织的溶液调整为含有0.33×PBS，本步骤的整个操作过程均在冰上进行。
将上述的细胞悬液与墨水在冰上进行混合均匀，混合后制得牙膏状的生物墨水，生物墨水的最终细胞浓度为3×106个/L。
将制得的生物墨水放置于3D打印针管中，使用200μm直径的圆锥形针头进行打印，打印区域放置6cm细胞培养皿，打印条件如下：针管温度：16℃；打印平台温度：37℃；室温：20℃；挤出压力：40kPa；枪头移动速度：15mm/s；打印层间距为160μm；线条间距为：1.2mm。
为了评估制备的牙膏状生物墨水的平面3D可打印性，通过形状准确度这一数值进行评估，并与传统方法制备的溶液状墨水进行对比，具体见表1和表2 所示：
表1溶液状生物墨水的形状准确度
表2牙膏状生物墨水的形状准确度
进一步对牙膏状生物墨水和溶液状墨水在打印多层结构体的不同进行比较，结果如图6所示，使用传统的溶液状生物墨水由于交联发生较慢，在打印过程中结构会发生塌陷，会出现打印不连续的现象，无法制作复杂的多层结构。而本申请制备的牙膏状生物墨水3D打印出的结构不会发生塌陷，打印30层依然连续，能够用来构建较复杂的立体多层结构。
本技术的关键点是应用更短(3小时)的胃蛋白酶消化时间处理生物组织粉末制作这种生物组织来源的生物墨水，用于细胞3D打印。现技术的生物墨水的消化时间为24～72小时，提高了这种纯的组织来源生物墨水的平面打印准确性和多层堆积的能力，有利于制造各种具有生物活性的组织类器官结构，在组织工程、再生医学和器官模型领域有广泛的应用价值。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权利要求极其等同限定。