一种马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因、编码的蛋白质和应用
阅读说明：本技术 一种马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因、编码的蛋白质和应用 (Pinctada martensii Kunitz type serine protease inhibitor gene, encoded protein and application ) 是由 梁海鹰 何军军 申铖皓 房晓宸 卢金昭 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因、编码的蛋白质和应用,属于蛋白用途技术领域,所述马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明提供的基因编码的蛋白对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌具有抑制作用。(The invention provides a Pinctada martensii Kunitz type serine protease inhibitor gene, a coded protein and application, and belongs to the technical field of protein application, wherein the nucleotide sequence of the Pinctada martensii Kunitz type serine protease inhibitor gene is shown as SEQ ID No.1, and the amino acid sequence of the coded protein is shown as SEQ ID No. 2. The gene coded protein provided by the invention has an inhibiting effect on escherichia coli, pseudomonas aeruginosa, aeromonas hydrophila, vibrio parahaemolyticus and vibrio harveyi.)
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因、编码的蛋白质和应用。
背景技术
近年来由于高密度养殖、养殖水域富营养化、生态环境恶化等原因使得贝类养殖品种频发各种由细菌或病毒等引起的感染性疾病。而防治过程大量地使用抗生素等传统药物，破坏了水环境的微生态平衡，使某些病原体对药物产生了耐药性，无法有效地控制疾病的发生，导致马氏珠母贝因病害发生大量死亡，对我国珍珠产业造成了巨大的经济损失。因此，了解马氏珠母贝免疫机制并在此基础上提高马氏珠母贝抗胁迫能力是目前亟需解决的问题。抗菌肽是贝类生物免疫机制中最重要的一个环节，也是贝类在对抗病原体入侵的最重要防线，了解珠母贝体内各种抗菌肽分子的组成及特点对于开发珠母贝抗菌肽来源的新型生物抗生素具有重要意义，但目前对马氏珠母贝抗菌肽的报道甚少，数据库中尚无马氏珠母贝的抗菌肽序列报道。
海洋是世界上物种最为丰富的聚集地，从海洋无脊椎动物中探索出具有抗菌活性的物质，具有极大的潜力。为了解决抗生素滥用和耐药性问题，从水产养殖动物自身出发，探究接近天然的生物抗生素，提高抗菌广谱性和耐药性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因、编码的蛋白质和应用，本发明提供的基因编码的蛋白对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌具有抑制作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，所述马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的蛋白在制备抑制微生物的药物中的应用。
优选的，所述微生物包括革兰氏阴性菌。
优选的，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌。
本发明提供了一种马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，所述马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明提供的基因编码的蛋白对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌具有抑制作用。
附图说明
图1为pMD19-T Vector克隆位点示意图；
图2为马氏珠母贝PmKuPI的跨膜结构域预测；
图3为PmKuPI结构域预测；
图4为PmKuPI同源性比对；
图5为系统进化树构建(Neighbor-joining法)；
图6为PmKuPI基因在马氏珠母贝各组织的表达分布，M：外套膜，B：血细胞，Gi：鳃，Go：性腺，A：闭壳肌，He：肝胰；
图7为PmKuPI原核表达重组质粒验证；
图8为rPmKuPI的诱导表达(SDS-PAGE)，PC1：BSA(1μg)；PC2：BSA(2μg)；M1：Marker；NC：无诱导全菌；1：15℃诱导全菌；2：37℃诱导全菌；NC1：无诱导上清；3：15℃诱导上清；4：37℃诱导上清；NC2：无诱导沉淀；5：15℃诱导沉淀；6：37℃诱导沉淀；
图9为rPmKuPI的诱导表达注(Western Blot)，M2：Marker；NC：无诱导全菌；1：15℃诱导全菌；2：37℃诱导全菌；NC1：无诱导上清；3：15℃诱导上清；4：37℃诱导上清；NC2：无诱导沉淀；5：15℃诱导沉淀；6：37℃诱导沉淀；
图10为rPmKuPI纯化分析注，A：1：BSA(2μg)；M1：Marker；2：复性后的目的蛋白(2μg)；B：M2：Marker；3：复性后的目的蛋白；
图11为rPmKuPI的抗菌活性测定(大肠杆菌)；
图12为rPmKuPI的抗菌活性测定(铜绿假单胞菌)；
图13为rPmKuPI的抗菌活性测定(嗜水气单胞菌)；
图14为rPmKuPI的抗菌活性测定(副溶血弧菌)；
图15为rPmKuPI的抗菌活性测定(哈维氏弧菌)；
图16为rPmKuPI作用于细菌的形态学变化：A和E分别为铜绿假单胞菌和副溶血弧菌的PBS对照组，B、C、D为rPmKuPI作用铜绿假单胞菌的实验组，F、G、H为rPmKuPI作用副溶血弧菌的实验组。
具体实施方式
本发明提供了一种马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，所述马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGGGTGTCAATACTCTATTTAGATATTTACGTTATGATGA GCGTGGTTTGTTACTTTACGTTTATTTTAGGTGCCTTTTTGTTCCTGTGTGATCATGGTATTGCACAGTCACCTTT ATCAATATTACCAGTCCCACCCCCTTTCCCAGACAGGGGCCCTTGCTCAGATAGACCGGCTGTAGTAGGGCCATGC AGAGCACGTCTACGCCGTTATACATACAGAAATGGAAGATGCGAAGAATTTTACTATGGAGGTTGTCTTGGTAACA GAAATAATTTCAGAAGTAGGAGAGAGTGTCAAAGGCAATGTGGCGGGGGAGGTGGAGGCGGAGGAGATATTTGCCA GTTGCCTCATGCACAGCCAGGACCGTGTTTAGCGTACATGCCACGTTATACATTCAACTCTAACACAGGCCGGTGT GAGGAGTTTATTTACGGTGGTTGTCAAGGAAATGCAAACAGATTCGAGACCCTGCAGGAGTGTAGGAGGCGCTGTG GAGGAGGGGGGCCACCAAGGGACCGTTGCTTTGAAAGACCAAAAGTCCAAGGACCATGTGAAGCTGCTATACCTAG CTTTTCATACAACCCGAGAACGAGGAGGTGTGAGGAGTTTACATACGGCGGATGTGGAGGAACCCGAAACAGGTTC TCTACGCTCAGAGAATGCCGGGATCGGTGTCAAAGAGGGGGAGGTGGAGGGGGAGGTGTGGACATTTGCGAACTCC CACCCAGGGCCAGTGGACTGTGTTTGGCCTATATCCCTAGCTATTCATACGACTCGGCAAGAGGAGAATGTGTAAG GTTCATTTACGGTGGATGCGGTGGAAATGAAAACAGATTTGGTTCCCTACAGGAGTGTCAGCGACGATGTGGTGGG GGAGGTGGTGGTGGGGGCGGAGACGGAGATGTGAACGATTTATCTATGGTGGATGTCTGGGAACAAACAATAGGTT TCCTTCTCGAAGAGAATGTGAAAGAAGATGTGGAGACGGCGGTCGACCAAGAAGATGCTTACTGCCCAGAGAGACT GGTCCATGTAGAGCTGCCTTTCCAAGATACTACTTTAATAGAGAATCTGGACGTTGTGAGAGATTCATATACGGAG GTTGTCAAGGAAACCAAAATAACTTTAGATCAGCAAATGAGTGTAGACGTGTGTGTAGAAGGCGACGAGGGTAAAA ATGTCTTCGTCTAAAATTGTAAATATGTACTTTAAGATTTTAGTTGCAATTAAGGTGAATTAAAGCACTAATTAATTCGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。下划线为马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的开放阅读框。
本发明还提供了上述技术方案所述的马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
MGVSILYLDIYVMMSVVCYFTFILGAFLFLCDHGIAQSPLSILPVPPPFPDRGPCSDRPAVVGPCRARLRRYTYRNGRCEEFYYGGCLGNRNNFRSRRECQRQCGGGGGGGGDICQLPHAQPGPCLAYMPRYTFNSNTGRCEEFIYGGCQGNANRFETLQECRRRCGGGGPPRDRCFERPKVQGPCEAAIPSFSYNPRTRRCEEFTYGGCGGTRNRFSTLRECRDRCQRGGGGGGGVDICELPPRASGLCLAYIPSYSYDSARGECVRFIYGGCGGNENRFGSLQECQRRCGGGGGGGGGDGDVNDLSMVDVWEQTIGFLLEENVKEDVETAVDQEDAYCPERLVHVELPFQDTTLIENLDVVRDSYTEVVKETKITLDQQMSVDVCVEGDEGKNVFV。
本发明还提供了上述技术方案所述的蛋白在制备抑制微生物的药物中的应用。在本发明中，所述微生物优选包括革兰氏阴性菌，所述革兰氏阴性菌优选包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1马氏珠母贝免疫效应分子筛选
从在线抗菌肽数据库(APD3，http://aps.unmc.edu/AP/main.php)，PubMed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)和国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取所有具有先前验证的抗微生物活性的氨基酸序列，随后，构建了一个本地参考AMP数据库，根据马氏珠母贝基因组数据进行比对搜索。收集比对率最高的基因序列，再运用NCBI数据库中的在线Blast进行分析，预测所收集的免疫效应分子PmKuPI基因的类型。
2 PmKuPI基因相关引物设计
PmKuPI基因的特异性引物使用Primer Premier5.0设计。5'端和3'端特异性引物依据RACE扩增原理设计，经过比对拼接获得基因的cDNA全长。引物序列如下。
表1引物
引物
序号
序列(5'-3')
用途
PmKuPI-3'-inner
SEQ ID No.3
CTATTCATACGACTCGGCAAGA
3'-RACE
PmKuPI-3'-outer
SEQ ID No.4
CCCGAAACAGGTTCTCTACGCT
3'-RACE
PmKuPI-5'-inner
SEQ ID No.5
TGTTTTCATTTCCACCGCATCC
5'-RACE
PmKuPI-5'-outer
SEQ ID No.6
CAGTCTCTCTGGGCAGTAAGCATC
5'-RACE
M13-F
SEQ ID No.7
CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
菌落PCR检测
M13-R
SEQ ID No.8
GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
菌落PCR检测
PmKuPI-RT-F
SEQ ID No.9
TTCATACAACCCGAGAACGAGG
荧光定量
PmKuPI-RT-R
SEQ ID No.10
GTTTTCATTTCCACCGCATCC
荧光定量
GAPDH-F
SEQ ID No.11
GCAGATGGTGCCGAGTATGT
内参基因
GAPDH-R
SEQ ID No.12
CGTTGATTATCTTGGCGAGTG
内参基因
3总RNA提取
(1)获取马氏珠母贝全组织样品，加Trizol并研磨各组织，依照Trizol法原理提取总RNA。
(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性和质量。
(3)微量核酸定量仪测定总RNA的浓度与纯度。
(4)所获总RNA于-80℃超低温冰箱保存备用。
4cDNA第一链的合成
依照Reverse TranscriptaseM-MLV试剂盒操作制备所需模板。具体程序如下：
(1)RNA与引物结合，PCR程序为70℃，10min，冰上放置2～3min。加样体系如下：
表2加样体系
试剂
剂量
总RNA
1ng～1μg
Oligo(dT)(50uM)
1μL
RNase-free water
补加至8μL
(2)向上述RNA体系中加入以下试剂：
表3试剂
试剂
剂量
5×M-MLV Buffer
2.0μL
dNTP Mixture(10mM)
0.5μL
RNase Inhibitor
0.25μL
RTase M-MLV(RNaseH-)
0.25～1μL
RNase-free water
补至12μL
(3)离心混匀数秒，进行PCR，程序为：42℃，60min；70℃，15min。
5中间片段克隆
(1)PrimeSTARHS高保真酶扩增获得目的片段。PCR反应体系如下：
表4反应体系
试剂
体积
PrimeSTARHS
5μL
模板
0.4μL
上游引物
0.4μL
下游引物
0.4μL
ddH<sub>2</sub>O
3.8μL
Total
10μL
采用3步法扩增。PCR反应程序如下：
(2)凝胶检测及目的片段回收
吸1μLPCR产物用1％琼脂糖电泳检测，扩大目的片段体系，参照PCR产物回收试剂盒(GeneJETGelExtractionKit)说明书回收PCR产物。
(3)目的片段连接
将纯化后的PCR产物连接到pMD-19TVector载体上(图1)。体系如下：
表5体系
试剂
剂量
SolutionI
5μL
目的片段
4.5μL
pMD19-TVector
0.5μL
Total
10μL
连接程序为：16℃连接约16h。
(4)转化
将DH5α感受态细胞从超低温冰箱取出，放冰上至微溶，再将连接产物加入含100μLDH5α感受态细胞的管子中，轻轻吹打均匀；冰上放置30min，42℃热激60～90s，冰上放置2～3min；接着加入890μL提前37℃预热好的LB液体培养基，37℃200rpm振荡培养1h；然后4000rpm2min，弃上清，留下约100μL，轻轻吹散悬浮细胞，并涂于LA(Amp+)固体平板上；最后，37℃先正置培养半小时后，再倒置培养过夜。
(5)菌落PCR检测
挑取单菌落接种于LA(含Amp+)液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养6h左右。M13通用引物鉴定阳性克隆，经1％琼脂糖凝胶电泳检测的阳性菌落送到广州生工测序。具体体系与程序如下：
表6体系 表7程序
63′和5′端RACE扩增
参照SMARTTMRACEcDNAAmptificationkit说明书制备3′和5′RACE的cDNA模板。巢式PCR以3′、5′特异性引物结合通用引物(NUP和UPM)扩增。
(1)第一轮RACE反应
表8体系
PCR反应程序：
(2)第二轮RACE反应
表9体系
试剂
体积
PremixTaq
5μL
3′/5′cDNA模板
0.4μL
NUP引物
0.4μL
Inner特异性引物
0.4μL
ddH<sub>2</sub>O
3.8μL
Total
10μL
PCR反应程序：
(3)PCR切胶回收/产物纯化，连接、转化以及菌落PCR检测参考5(2)～(5)。
7生物信息学分析
利用NCBIblastx进行序列同源性和相似性分析；DNAMAN6.0软件序列查找、拼接和比对；ExPASy在线预测其理论分子量(MW)和等电点(pI)；采用SignalP4.0Server进行信号肽序列预测；TMHMMServerv.2.0分析序列的跨膜结构域；MEGA6软件以NJ法构建系统进化树；SoftBerry Psite对其推导的氨基酸序列功能位点的预测；SOPMA预测蛋白质二级结构。
8组织表达及PAMPs刺激后时序表达分析
8.1贝的处理及样品采集
(1)组织定量：取10只规格一致、活力较好的贝，采集组织为性腺、鳃、外套膜、血淋巴、闭壳肌和肝胰腺。
(2)PAMPs刺激：取暂养1周健康的马氏珠母贝320只，随机分成4组：LPS刺激组(实验组)、PGN刺激组(实验组)、PolyI:C刺激组(实验组)、PBS组(对照组)，各80只贝。采用闭壳肌注射的方法，实验组每只注射100μL的LPS、PGN、PolyI:C(10μg/mL)，注射100μL PBS作为对照组。注射后的0、3、6、12、24、48、72、96h，各组分别随机抽取10只贝取全组织备用，其中血淋巴于4℃，800×g，离心15min后，舍弃上清，加1mLTrizol，轻轻摇荡使悬浮均匀，提取总RNA反转录成cDNA，用于后面的定量分析(注：PBS进行了灭菌处理，LPS、PGN、PolyI:C由灭菌的PBS配制；实验过程中，不喂饵料，且未出现死亡现象)。
8.2引物设计
荧光定量PCR反应中所用引物见表1。
8.3总RNA的提取
总RNA的提取方法同3中的步骤(1)～(4)。
8.4荧光定量cDNA模板的制备
依照Reverse Transcriptase M-MLV(RNaseH)说明书操作。
(1)RNA与引物结合，PCR程序为70℃，10min，冰上放置2～3min。加样体系如下：
表10加样体系
试剂
体积
总RNA
1ng～1μg
Random Primers(25uM)
1μL
RNase-free water
补加至8μL
(2)向上述RNA体系中加入以下试剂：
表11试剂
试剂
剂量
5×M-MLV Buffer
2.0μL
dNTP Mixture(10mM)
0.5μL
RNase Inhibitor
0.25μL
RTase M-MLV(RNaseH-)
0.25～1μL
RNase-free water
补至12μL
(3)离心混匀数秒，进行PC，程序为：42℃，60min；70℃，15min，所得的cDNA第一链于-20℃保存。
8.5荧光定量PCR
以8.4的反转录cDNA为模板，内参基因选择GAPDH。按3个实验重复设置加样孔。按照以下反应体系和反应条件实时荧光定量PCR：
表12体系
反应程序：
8.6数据统计与分析
荧光定量的数据采用2-△△ct法进行分析。试验结果均采用平均值±标准差表示，用SPSS17.0软件进行单因素方差分析(one-wayANOVA)，并用Duncan’s多重比较对均值进行差异显著性检验。
9重组蛋白制备
9.1基因合成
根据已有的目的基因序列进行基因合成，以此作为后续亚克隆的模板，引入酶切位点为NcoI和HindIII。
9.2原核表达载体构建
(1)重组PmKuPIORF扩增，PCR体系为：10μL的PremixExTaq，0.5μL合成模板，ForwardPrimer和ReversePrimer各0.4μL，ddH2O补足体系至20μL。程序为：94℃变性5min；98℃10s，55℃30s，72℃60s，30个循环。凝胶电泳检测反应产物。
(2)PmKuPI的克隆与测序见步骤5。
(3)质粒抽提参照EasyPurePlasmidMiniPrepKit硅胶膜离心柱质粒DNA小量抽提试剂盒说明书提取。
(4)用MluⅠ、XhoI和HindIII内切酶对空质粒pET-28a(+)和抽提的重组质粒进行双酶切。体系为5.0μL的10×FDBuffer，MluⅠ内切酶3.0μL，20μL的质粒，ddH2O补足体系至50μL。轻微混匀，37℃保温2h。
(5)切胶纯化参照5中的步骤(2)。
(6)酶切纯化的回收产物通过T4连接酶的作用与pET-28a(+)载体连接构建重组表达质粒pET28a-PmKuPI。连接体系为：回收的酶切纯化产物6μL，2μL的pET-28a(+)，10×T4buffer为1μL，1μLT4连接酶，总体系为10μL。轻微混匀，16℃过夜。
(7)连接产物的转化入、阳性克隆筛选及测序参照5中的步骤(4)～(5)。
(8)质粒提取参照9.2中的步骤(3)，即获得pET28a-PmKuPI重组质粒，-20℃保存备用。
9.3重组融合蛋白的诱导表达
(1)转化、筛选阳性克隆
从超低温冰箱取出感受态细胞BL21(DE3)，先冰解；将100ng质粒DNA加入BL21(DE3)菌株并轻轻混合，试管在冰上孵育30min，震动管在42℃加热90s，不要摇晃，将试管放在冰上放置3min，加入100μL室温LB培养基。摇动并在37℃下于200rpm孵育管60min，在含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上铺展，将板倒置在37℃下孵育过夜。筛选阳性克隆并测序。
(2)小试培养选择最佳的诱导条件
挑选三个分离良好的单个菌落，分别接种到含有50μg/mL卡那霉素的4mLLB培养基中，将细胞在37℃的摇床上以200rpm摇动孵育，当OD600值达到0.6～0.8时，在三根管中的两根加入IPTG，最后浓度为0.5mM的IPTG分别在15℃诱导16h和37℃诱导4h，第三根试管作为阴性对照；
(3)重组蛋白制备与检测
①从450μL培养物中收获细胞沉淀，用超声仪裂解1min。
②全细胞裂解液：将50μL5×上样缓冲液与100μL细胞裂解液混合，作为全细胞裂解液的样品，在100℃下加热样品10min，然后以15,000rpm离心5min。
③细胞裂解液的上清液和碎片：将剩余的200μL细胞裂解液以15,000rpm离心10min，收集细胞裂解液的上清液和细胞碎片，分别将90μL5×上样缓冲液与180μL上清液混合作为样品。细胞裂解液的上清液。用150μL5×上样缓冲液重悬所有沉淀，作为细胞裂解液碎片的样品。将样品在100℃下加热10min，并在上样之前以15,000rpm离心5min。
④使用SDS-PAGE和Westernblot检测蛋白的表达和溶解度，最后大量诱导表达融合蛋白。
9.4融合蛋白的分离纯化
(1)超声破碎菌体
①将收集的细菌菌体用Buffer(50mMTris，150mMNaCl，5％甘油pH8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率350W，30min(超声4s，暂停6s为一个循环)。
②超声完毕，12,000rpm，4℃，离心20min，弃上清，沉淀用破碎Buffer溶解，冰浴中超声破碎，功率350W，30min(超声4s，暂停6s为一个循环)。
③超声完毕，12,000rpm，4℃，离心20min，收集上清进行下一步纯化。
(2)镍琼脂糖亲和层析
①取5mLNi-NTA，用5倍柱床体积的Bindingbuffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。
②填料和样品孵育1h后上柱，收集穿透液。
③5倍柱床体积的Bindingbuffer清洗柱子，流速5mL/min。
④Washbuffer洗杂，流速5mL/min，收集洗脱液。
⑤Elutionbuffer洗脱，流速2mL/min，收集洗脱液。
⑥收集样品SDS-PAGE检测
(3)纯化蛋白SDS-PAGE检测
准备12％的SDS-PAGE，Tris-Gly电泳缓冲液，浓缩胶80V，20min，分离胶120V，60min，凝胶电泳结束后进行考马斯亮蓝染色20min，脱色过夜。
(4)Westernblot检测
①制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶：浓缩胶5％，分离胶12％
②制样：上样。
③电泳：浓缩胶80V，30min；分离胶120V，60min。
④转膜：湿转，250mA，90min。
⑤封闭：5％的脱脂奶粉，37℃缓慢振荡2h。
⑥孵育一抗：一抗为兔抗his标签，抗体公司：SangonBiotech，编号：D110002，1:500稀释，37℃缓慢振荡60min。
⑦孵育二抗：二抗为羊抗兔，抗体公司：SangonBiotech，编号：D110058，1:8000稀释，37℃缓慢振荡60min。
⑧显色：TMB显色。
(5)包涵体蛋白复性
①将纯化后的目的蛋白进行透析复性，并最终置换至可溶性的缓冲液中(PBS，10％甘油，1ML-精氨酸,pH7.4)，并运用SDS-PAGE和Westernblot检测对比纯化蛋白复性前(沉淀)和复性后(溶解)的纯度。
10纯化蛋白抗菌活性检测
纯化的蛋白对大肠杆菌，藤黄微球菌，嗜水气单胞菌，铜绿假单胞菌，副溶血弧菌，哈维氏弧菌，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。首先，将每种细菌分别在2216E液体培养基中培养至对数生长期。然后将细菌离心(3,000×g，10min)，用磷酸盐缓冲盐水(1×PBS)洗涤3次，然后重悬于PBS中。接下来，用96孔酶标板将50μL的纯化蛋白(200μg/mL)与10μL的每种细菌悬液分别混合，并在室温下孵育2h。PBS用作阴性对照。然后在每个混合孔中加入140μL培养基，在37℃恒温培养箱孵育培养，同时使用酶标仪(EnSpire，PerkinElmer)测定在添加纯化蛋白和PBS后的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12h测量OD600值。每个样品平行进行三个实验。
11透射电镜观察纯化蛋白作用细菌后的形态变化
在37℃下用200μL的纯化蛋白处理200μL的处于指数生长期的细菌2h。PBS代替作为对照。之后在室温下先将纯化蛋白与细菌混合物以3000rpm离心10min进行沉淀，再用PBS洗涤3次去除杂质，然后将细菌沉淀用200μL3％戊二醛中固定过夜。处理后，将200μL2％磷钨酸钠水溶液添加到细菌悬浮液中，然后将其滴在铜网上。使用滤纸除去残留的水，5min后，将样品风干。在标准操作条件下用JEM-1400(日本电子公司)显微镜进行观察。
12结果与分析
12.1PmKuPI的基因克隆
通过RACE技术克隆得到PmKuPI基因(SEQ ID No.1)全长为1318bp，其中包含25bp的5′UTR，96bp的3′UTR，1197bp的ORF框，共编码398个氨基酸(SEQ ID No.2)。
12.2PmKuPI理化性质分析
PmKuPI的分子量为43.82KDa，理论等电点为5.32，预测其亲水性，发现在第26位出现连续的最高疏水性，其指数为2.856，在第99位出现最高亲水性，其指数为-2.978，总的平均亲水性系数为-0.441，为亲水性蛋白。带负电荷的残基总数(Asp+Glu)为51，带正电荷的残基总数(Arg+Lys)为44，因此，PmKuPI总体带负电荷。TMHMMserver2.0预测发现，在第7-29位形成一个跨膜结构域(图2)。SOPMA软件预测二级结构显示，无规则卷曲占整体的49.50％，α-螺旋结构27.39％，延伸链19.85％，β-转角3.27％。SMART分析结果表明，PmKuPI氨基酸序列形成了四个串联的Kunitz域，分别在第53-105位，第113-167位，第174-228位和第238-292位(图3)。
12.3PmKuPI同源性分析
通过DNAMAN将PmKuPI氨基酸序列与其它无脊椎动物的相应氨基酸进行多序列比对，分析发现PmKuPI与长牡蛎相似性最高，为30.14％，而与其他物种相似性都较低，物种间一致相似性为23.43％(图4)。
使用MEGA6构建系统进化树，在PmKuPI的进化树分类中发现软体类单独聚为一小支，其中马氏珠母贝与长牡蛎和美洲牡蛎(Crassostrea virginica)的亲缘关系都很近(图5)。
12.4PmKuPI基因mRNA的组织定量分析
利用Real-timePCR检测PmKuPI蛋白酶抑制剂基因mRNA在马氏珠母贝血细胞等6个组织中的表达模式情况。结果发现：PmKuPI蛋白酶抑制剂基因在外套膜中的表达水平最高(p<0.01)，而在其它组织中，几乎无表达(图6)。
12.5PmKuPI重组蛋白的表达
(1)PmKuPI原核表达载体的构建
根据已有的PmKuPI基因全长cDNA序列，预测开放阅读框ORF并进行分析，获得需要重组的ORF序列，在重组ORF序列中设计添加组氨酸基因序列，然后进行基因合成，再设计原核表达引物。PCR扩增后得到PmKuPI基因片段约1139bp；随后将PmKuPI基因与pMD19-T载体进行连接、转化并挑取单菌落，通过菌落PCR鉴定出阳性克隆的菌落，利用生工质粒抽提试剂盒进行质粒的抽提，然后MluI内切酶消化，并将PmKuPI与pET-28a(+)载体相连接、转化并通过菌落PCR鉴定阳性克隆菌落，MluI消化后的PmKuPI基因片段约为1750bp。随后对有阳性克隆结果的进行质粒抽提，抽提获得的质粒即为pET28-PmKuPI的重组质粒，重组蛋白预计分子量分别为41.32KDa。菌落PCR鉴定、MluI消化鉴定(图7)及测序的结果都验证表明pET28-PmKuPI载体构建成功。
(2)PmKuPI重组蛋白(rPmKuPI)的诱导表达
将重组表达载体pET28-PmKuPI转化至大肠杆菌，类似于pET28-PmTLS菌株的培养方法。从图8可知，阴性对照组泳道NC(全菌)、NC1(上清)和NC2(沉淀)未出现目的条带；同时15℃和37℃的上清泳道3和4中也未见目的条带；在15℃的泳道1(全菌)和5(沉淀)中出现目的条带，而37℃的泳道2(全菌)和6(沉淀)中也出现的目的条带，但两者中出现的目的条带都不太明显(图8)。用Westernblot进一步验证，结果显示，在15℃和37℃诱导的泳道1、2(全菌)和5、6(沉淀)中约42KDa处出现清晰单一染色条带，与理论值41.52KDa一致，表明成功获得了的重组蛋白(图9)。最终rPmKuPI诱导的最佳温度选择了15℃，并且主要以包涵体形式表达。
为了获得大量融合蛋白，以1L的表达量培养pET28-PmKuPI的表达菌，在0.5mMIPTG，15℃下诱导16h。结果显示，在约42KDa处出现一条清晰单一的条带，表明成功获得了纯度较高的rPmKuPI(图10)。通过Bradford蛋白测定法测定rPmKuPI浓度，其浓度为1.00mg/mL，共获得rPmKuPI11.27mg。
12.6rPmKuPI的抗菌活性测定
在细菌液体生长曲线抑制实验中，总共测定了8种细菌，其中3种为革兰氏阳性菌，5种为革兰氏阴性菌，rPmKuPI显著抑制了5种革兰氏阴性菌种的生长(P<0.05)，分别是大肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌(图11-15)，但对革兰氏阳性菌的生长几乎没有影响。
12.7rPmKuPI抗菌作用机制
为了了解马氏珠母贝的TLS的抗菌作用机制，将rPmKuPI溶液分别与铜绿假单胞菌和副溶血弧菌一起反应2h，滴网，在透射电子显微镜下镜检。结果如图16所示，从图中可以看出，铜绿假单胞菌的对照组(图16中的A)边缘清晰完整，菌体细长，内含物质致密状且均匀；而实验组(图16中的B)可观察到铜绿假单胞菌的菌体略微膨胀，内含物质缺失，内部结构和对照组相比也发生明显改变，菌体一端也有内含物质释放出来。同时，将实验组两端放大再观察，发现靠近细胞壁两边的内含物质大部分缺失，菌体趋向于空壳状态(图16中的C,D)。图16中的E为副溶血弧菌的对照组，菌体为短杆状，均质饱满；而实验组(图16中的F)内含物收缩，出现折叠现象；进一步放大再观察，发现内含物质与细胞壁基本脱离，并且有明显的折皱和缺失(图16中的G,H)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东海洋大学
<120> 一种马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因、编码的蛋白质和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Val Cys Tyr Phe Thr Phe Ile Leu Gly Ala Phe Leu Phe Leu Cys Asp
20 25 30
His Gly Ile Ala Gln Ser Pro Leu Ser Ile Leu Pro Val Pro Pro Pro
35 40 45
Phe Pro Asp Arg Gly Pro Cys Ser Asp Arg Pro Ala Val Val Gly Pro
50 55 60
Cys Arg Ala Arg Leu Arg Arg Tyr Thr Tyr Arg Asn Gly Arg Cys Glu
65 70 75 80
Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Arg Asn Asn Phe Arg Ser
85 90 95
Arg Arg Glu Cys Gln Arg Gln Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
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115 120 125
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Tyr Ser Tyr Asp Ser Ala Arg Gly Glu Cys Val Arg Phe Ile Tyr Gly
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Arg Arg Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Gly Asp Val
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Asn Asp Leu Ser Met Val Asp Val Trp Glu Gln Thr Ile Gly Phe Leu
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Leu Glu Glu Asn Val Lys Glu Asp Val Glu Thr Ala Val Asp Gln Glu
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