阅读说明：本技术 可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白及制备方法 (CgTIMP recombinant protein capable of inhibiting toxicity of extracellular products of vibrio splendidus and preparation method thereof ) 是由 王玲玲 王伟林 刘兆群 孔宁 宋林生 于 2019-12-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的<I>Cg</I>TIMP重组蛋白,蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该重组蛋白具有抑制灿烂弧菌胞外产物酶活性的作用,在制备灿烂弧菌胞外产物毒性抑制药物等方面具有应用价值。(The invention discloses a method for inhibiting toxicity of extracellular products of vibrio splendidus Cg The protein amino acid sequence of the TIMP recombinant protein is shown as SEQ ID NO. 1. The recombinant protein has the function of inhibiting the enzymatic activity of extracellular products of vibrio splendidus, and has application value in the aspects of preparing toxicity inhibiting medicines of the extracellular products of vibrio splendidus and the like.)

可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白及制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白及制备方法。

背景技术

长牡蛎(Crassostrea gigas，Cg)是国际上重要的海水养殖经济贝类之一。近年来由细菌和病毒引起的疾病造成了长牡蛎大规模死亡，带来了巨大经济损失。研究发现，灿烂弧菌是主要致病菌之一，其胞外产物（Extracellular products, ECP）及其中的金属蛋白酶对长牡蛎稚贝具有较强毒性，能显著抑制长牡蛎免疫细胞的粘附及吞噬活性。在哺乳动物中，组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）蛋白能抑制机体自身组织金属蛋白酶活性进而抑制细胞迁移，并在抑制肿瘤迁移过程中发挥关键作用。迄今为止，尚未关于长牡蛎TIMP可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白。

一种可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白，其特征在于：蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种上述可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 用特定引物P1和P2对长牡蛎TIMP628基因编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

所述PCR反应条件为：94 ℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94 ℃变性30秒，55 ℃退火30秒，72 ℃延伸45秒，共进行35个循环，最后72 ℃延伸10分钟；

b. 将扩增片段纯化回收并与pMD19-T载体连接，转化后筛选阳性克隆，提取质粒；使用NdeI和BamH I酶切质粒，对酶切质粒产生的目的片段纯化回收；

c. 将所回收的目的片段与经NdeI和BamH I酶切的表达载体pET-30a连接并转入大肠杆菌Transetta(DE3)中培养；

d. 挑取单克隆，接种于200 mL的LB液体培养基中，220 rpm，在37 ℃下培养至OD ₆₀₀ =0.4~0.8，加入终浓度1 mmol L^-1的诱导剂IPTG后继续培养4小时，于4 ℃，5000 rpm，离心10分钟，收集菌体；

e. 将所得到的菌体纯化、复性，即得到可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白。

所述e步骤依次如下：

（1）镍琼脂糖凝胶 FF装柱，1.6×20 cm，柱床体积为10 mL；

（2）用缓冲液I平衡2~5个床体积，流速为2 mL min^-1；所述缓冲液I组成如下：50 mmolL^-1 Tris-Hcl缓冲液，pH 7.4；50 mmol L^-1 NaCl；8 mol L^-1 尿素；

（3）将d步骤所收集的菌体用缓冲液I重悬，150 W超声破碎30分钟，12000 rmp，4 ℃离心30分钟，取上清液并将上清液用0.45 μm 滤膜过滤后过柱，流速为1 mL min^-1；

（4）用缓冲液I洗2~5个床体积，流速为2 mL min^-1；

（5）用缓冲液Ⅱ再洗2~5个柱床体积，流速为2 mLmin^-1；所述缓冲液Ⅱ是在缓冲液I中加入50 mmol L^-1咪唑；

（6）用缓冲液Ⅲ洗脱目的蛋白，收集；所述缓冲液Ⅲ是在缓冲液I中加入400 mmol L^-1咪唑；

（7）将所收集的蛋白透析复性。

一种上述可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白在制备抑制灿烂弧菌胞外产物毒性药物中的应用。

本发明在分析病原菌胁迫的长牡蛎免疫细胞转录组基础上，筛选出一个能抑制病原菌灿烂弧菌胞外产物毒性的基质金属蛋白酶抑制剂（CgTIMP），获得了该基质金属蛋白酶抑制剂基因重组蛋白（rCgTIMP628），该重组蛋白具有抑制灿烂弧菌胞外产物酶活性的作用，在制备灿烂弧菌胞外产物毒性抑制药物等方面具有应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例重组蛋白rCgTIMP628诱导前后及纯化效果图。

图2是本发明实时例重组蛋白rCgTIMP628对灿烂弧菌胞外产物ECP毒性抑制效果图。

具体实施方式

本发明的可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白，蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 用特定引物P1和P2对长牡蛎TIMP628基因编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

所述PCR反应条件为：94 ℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94 ℃变性30秒，55 ℃退火30秒，72 ℃延伸45秒，共进行35个循环，最后72 ℃延伸10分钟；

b. 将扩增片段纯化回收并与pMD19-T载体连接，转化后筛选阳性克隆，提取质粒；使用NdeI和BamH I酶切质粒，用胶回收纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司）对酶切质粒产生的目的片段纯化回收；

c. 将所回收的目的片段与经NdeI和BamH I酶切的表达载体pET-30a连接并转入大肠杆菌Transetta(DE3)中培养；

d. 挑取单克隆，接种于200 mL的LB液体培养基中，220 rpm，在37 ℃下培养至OD ₆₀₀ =0.6，加入终浓度1 mmol L^-1的诱导剂IPTG后继续培养4小时，于4 ℃，5000 rpm，离心10分钟，收集菌体；

e. 将所得到的菌体纯化、复性，即得到可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白，具体步骤依次如下：

（1）镍琼脂糖凝胶 FF装柱，1.6×20 cm，柱床体积为10 mL；

（2）用缓冲液I平衡2~5个床体积，流速为2 mL min^-1；所述缓冲液I组成如下：50 mmolL^-1 Tris-Hcl缓冲液，pH 7.4；50 mmol L^-1 NaCl；8 mol L^-1 尿素；

（3）将d步骤所收集的菌体用缓冲液I重悬，150W超声破碎30分钟，12000 rmp，4 ℃离心30分钟，取上清液并将上清液用0.45 μm 滤膜过滤后过柱，流速为1 mL min^-1；

（4）用缓冲液I洗2~5个床体积，流速为2 mL min^-1；

（5）用缓冲液Ⅱ再洗2~5个柱床体积，流速为2 mLmin^-1；所述缓冲液Ⅱ是在缓冲液I中加入50 mmol L^-1咪唑；

（6）用缓冲液Ⅲ洗脱目的蛋白，收集；所述缓冲液Ⅲ是在缓冲液I中加入400 mmol L^-1咪唑；

（7）将所收集的蛋白透析复性：将所收集的变性纯化产物经2 mM的还原谷胱甘肽、0.4mM氧化谷胱甘肽、1 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始的6 M逐渐替换到4 M、3 M、2 M、1M、0 M。当最后一次透析（尿素0 M）的透析液时不加甘油，每次在4 ℃透析12小时。即得到可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白rCgTIMP628，经测定氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

长度：208个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

特性：分子量为23.95 kDa，等电点为6.18，具有一个保守的TIMP结构域。

本发明可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白（rCgTIMP628）诱导前后及纯化效果如图1所示。图1中M：maker；1：诱导前菌体蛋白；2：诱导后菌体蛋白；3：纯化后rCgTIMP628。可以看出，本发明实施例单克隆培养物经诱导纯化后可得到清晰条带。

实验：本发明的可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白（rCgTIMP628）对灿烂弧菌胞外产物毒性抑制的检测

具体步骤如下：

1. 灿烂弧菌的培养及其胞外产物ECP的制备

灿烂弧菌（Vibrio splendidus，中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC编号：CGMCC1.6380），用2216E液体培养基于16 ℃，220 rpm培养到对数生长期。然后用0.85% NaCl生理盐水稀释菌体到约1×10⁷ CFU，取100 μL菌液均匀涂布在铺有灭菌玻璃纸的2216E固体培养基平板上，于16 ℃培养48小时。取下长满菌的玻璃纸，刮下菌体并用生理盐水充分重悬，12,000 g离心10分钟后取上清即灿烂弧菌胞外产物ECP。用生理盐水调整浓度至0.1 mgmL^-1备用。

2. 本发明实施例重组蛋白rCgTIMP628对灿烂弧菌胞外产物ECP毒性抑制的测定

取4管150 μL ECP溶液，分别加入100 μL体积的PBS溶液、EDTA溶液（50 mM）、纯化Trx标签蛋白（0.1 mg mL^-1，重组蛋白对照蛋白）或本发明实施例重组蛋白rCgTIMP628（0.1 mgmL^-1），于16 ℃孵育1小时。然后分别加入250 μL偶氮酪蛋白底物（5 mg mL^-1溶于50 mMTris-HCl缓冲液， pH 8.0），25 ℃反应20分钟，然后加入1750 μL 5% (v/w)三氯乙酸TCA沉淀未降解底物，于4 ℃，3000 g 离心5分钟取上清。取100 μL上清加入等体积0.5 M NaOH终止反应，用酶标仪测OD₄₄₀吸光值大小，并根据吸光值大小计算酶活，吸光值越大酶活性越强。每个样品设三个重复，根据3次测定结果取平均值作图，研究数据采用SPSS6.0软件进行统计学分析，显著差异（P < 0.05）用*标记。结果见图2。

图2中：PBS：缓冲液；EDTA：金属离子螯合剂；Trx：纯化Trx标签蛋白rCgTIMP628：本发明实施例重组蛋白。

实验结果表明本发明的长牡蛎组织金属蛋白酶抑制剂基因重组蛋白rCgTIMP628能够抑制灿烂弧菌胞外产物ECP的蛋白酶活性（毒性），可作为抑制灿烂弧菌胞外产物毒性药物。

序列表

<110> 大连海洋大学

<120> 可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 208

<212> PRT

<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

<400> 1

Met Cys Met Cys Asp Phe Thr His Pro Gln Asn Asn Phe Cys Ser Ala

1 5 10 15

Asp Phe Val Ile Lys Ala Thr Ile Val Lys Glu Glu Leu Lys Phe Gly

20 25 30

Asp Glu Ser Met Gly Ile Pro Phe Pro Leu Gln Lys Asn Tyr Thr Val

35 40 45

Gln Phe Lys Lys Arg Asp Ile Phe Lys Gly Ser Ser Leu Leu Gly Ser

50 55 60

Ser Asp Thr Leu Val Ile Lys Thr Ser Gly Thr Pro Trp Asn Cys Gly

65 70 75 80

Glu Thr Phe Thr Leu Asn Lys Glu Tyr Val Ile Ser Gly Phe Val Ser

85 90 95

Asp Gly Glu Phe Phe Thr Asn Asn Cys Gln Trp Asn Pro Glu Tyr Leu

100 105 110

Thr Leu Glu Pro His Gln Arg Arg Gly Ile Arg Tyr Met Tyr Glu Gln

115 120 125

Gly Cys Asn Cys Thr Ile His His Cys Arg Gly Glu Asn Cys Asp Phe

130 135 140

Pro Gln Ser Leu Asn Leu Asp Gln Thr Cys Ile Trp Pro Gly Ser Tyr

145 150 155 160

Asn Thr Asn Asp Cys Tyr Ala Lys Tyr Gly Phe Cys Leu Pro Asp Ile

165 170 175

Phe Gly Val Cys Tyr Trp Lys Gln Asn Arg Met Leu Gly Gly Cys Leu

180 185 190

Gln Arg Glu Gly Gly Val Leu Pro Leu Glu His His His His His His

195 200 205

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> exon

<222> (1 )..(31)

<223> 引物

<400> 2

cccatatgtg tatgtgtgat ttcacccacc c 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> exon

<222> (1 )..(31)

<223> 引物

<400> 3

cgggatcctg tatgtgtgat ttcacccacc c 31