阅读说明：本技术 抗非洲猪瘟病毒和cd多克隆小分子抗体及制备方法和应用 (anti-African swine fever virus and CD polyclonal small molecule antibody, preparation method and application ) 是由 包晟 杨荣鉴 王长安 廖列扬 曹天福 龚芹 于 2019-03-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种抗非洲猪瘟病毒IgY抗体、抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体、抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体以及复合抗体优化组合应用,针对非洲猪瘟病毒以猪免疫细胞为靶细胞,破坏宿主的免疫组织,使疫苗失效的难题；把导致“免疫抑制”和“免疫逃逸”的抗原蛋白以及在病毒扩散中起重要作用的抗原蛋白作为靶抗原,采用复合抗体通过体液免疫和细胞免疫以及ADCC作用抑灭这些抗原蛋白；既突破“免疫抑制”和“免疫逃逸”两大瓶颈,又保护并激活免疫细胞,清除非洲猪瘟病毒和受感染细胞。这种复合抗体可制成生物药或消毒剂用于预防和治疗非洲猪瘟,也可作为饲料或饲料添加剂或口服剂成份,阻断非洲猪瘟病毒经由口腔和消化道的传播。(The invention provides an anti-African swine fever virus IgY antibody, an anti-African swine fever virus and CD composite IgY antibody, an anti-African swine fever virus and CD polyclonal small molecule antibody and composite antibody optimized combination application, aiming at the problem that the African swine fever virus takes a swine immune cell as a target cell, destroys the immune tissue of a host and makes a vaccine ineffective; antigen proteins causing "immunosuppression" and "immune escape" and antigen proteins playing an important role in virus spreading are used as target antigens, and the antigen proteins are suppressed by humoral immunity, cellular immunity and ADCC action by using a composite antibody; not only breaks through two bottlenecks of 'immunosuppression' and 'immune escape', but also protects and activates immune cells and eliminates African swine fever virus and infected cells. The compound antibody can be prepared into a biological medicine or a disinfectant for preventing and treating African swine fever, and also can be used as a feed or a feed additive or an oral agent component for blocking the transmission of the African swine fever virus through the oral cavity and the digestive tract.)

抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗体工程和基因工程的技术领域，更具体地说，涉及一种抗非洲猪瘟病毒IgY抗体、抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体、抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体及其制备方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的一种高传染性、高发病率高、高死亡率的一类动物疫病，对我国和全球的养猪业危害极大。

非洲猪瘟病毒在组织和环境中的抵抗能力强，迄今为止没有治疗措施。更重要的是，非洲猪瘟病毒是一个具有非常独特的DNA的虫媒病毒，主要以猪的单核吞噬细胞为感染靶细胞，直接和间接破坏宿主的免疫组织，会造成严重的免疫抑制，使疫苗失效；同时，非洲猪瘟病毒还具备特殊的“免疫逃逸”机制。因此，使非洲猪瘟的防控技术成为世界大难题。

现在，非洲猪瘟已传入我国，而且疫情迅速蔓延到全国各地。由于非洲猪瘟病毒可以在肉制食品中如冰冻肉、腌制火腿、半熟肉以及泔水中存活数月至数年；因此，除了对防控这种疫病带来极大的难度外，还会通过食物链扩散引起重大社会经济问题。

因此，研究开发一种可有效预防和治疗非洲猪瘟的药物，阻止非洲猪瘟疫情扩散和蔓延，尽最大可能减少这种烈性传染病的祸害，是对全球医药科学界最严重的挑战，也是摆在世界各国科学家面前的最紧迫任务。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗非洲猪瘟病毒IgY抗体、抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体、抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体及其制备方法和应用，以解决现有技术无法对抗非洲猪瘟的侵染和扩散的难题。

本发明解决上述技术问题的方案为，提供一种抗非洲猪瘟病毒抗体的制备方法，所述抗非洲猪瘟病毒抗体为抗非洲猪瘟病毒IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体，包括以下步骤：

S1、制备抗原：将非洲猪瘟病毒抗原重组蛋白、表达非洲猪瘟病毒抗原蛋白的重组病毒和猪CD重组蛋白中的一种或多种加入弗氏佐剂，并置于高速匀浆器中高速匀化，得到免疫用的重组蛋白单价抗原、重组蛋白双价抗原、重组蛋白复合双价抗原和重组病毒单价抗原、重组病毒双价抗原、重组病毒复合双价抗原以及重组蛋白多价抗原以及重组病毒多价抗原；

S2、制备免疫蛋：利用步骤S1获得的重组蛋白单价抗原、重组蛋白双价抗原、重组蛋白复合双价抗原和重组病毒单价抗原、重组病毒双价抗原、重组病毒复合双价抗原以及重组蛋白多价抗原以及重组病毒多价抗原分别免疫产蛋鸡，每隔两周对产蛋鸡注射一次，注射2-5次，最后一次注射后的至少第12天后取产蛋鸡所产免疫蛋，并进行编码标记，得到抗非洲猪瘟病毒IgY免疫蛋和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY免疫蛋；

S3、制备抗非洲猪瘟病毒IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体粗提物；

S4、制备抗非洲猪瘟病毒IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体纯品溶液；

S5、制备抗非洲猪瘟病毒IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体纯品干粉；

S6、制备抗非洲猪瘟病毒IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体纳米粉；

S7、制备抗非洲猪瘟病毒IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体脂质体液晶微囊。

在本发明的抗非洲猪瘟病毒抗体的制备方法中，所述非洲猪瘟病毒抗原重组蛋白为真核细胞或原核细胞表达并纯化的非洲猪瘟病毒代表性抗原蛋白；将非洲猪瘟病毒代表性抗原蛋白的基因***病毒载体的基因组中，获得所述表达非洲猪瘟病毒抗原蛋白的重组病毒；所述非洲猪瘟病毒代表性抗原蛋白包括VP73、P54、P72、P30、A238L、CD2V中的至少一种；所述猪CD重组蛋白为真核细胞或原核细胞表达并纯化的代表性猪CD蛋白，所述代表性猪CD蛋白包括猪CD3蛋白、猪CD2蛋白、猪CD8蛋白中的至少一种。

在本发明的抗非洲猪瘟病毒抗体的制备方法中，利用非洲猪瘟病毒抗原重组蛋白制备重组蛋白单价抗原和重组蛋白复合双价抗原，利用表达非洲猪瘟病毒抗原蛋白的重组病毒制备重组病毒单价抗原和重组病毒复合双价抗原，利用非洲猪瘟病毒抗原重组蛋白和猪CD重组蛋白制备重组蛋白双价抗原，利用表达非洲猪瘟病毒抗原蛋白的重组病毒和猪CD重组蛋白制备重组病毒双价抗原，利用非洲猪瘟病毒抗原重组蛋白、表达非洲猪瘟病毒抗原蛋白的重组病毒和猪CD重组蛋白制备重组蛋白多价抗原以及重组病毒多价抗原。

在本发明的抗非洲猪瘟病毒抗体的制备方法中，步骤S3中采用纯水提取法、氯仿萃取法、冷乙醇沉淀法或硫酸铵沉淀法制备抗非洲猪瘟病毒IgY 抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体粗提物。

本发明还提供一种抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S8、将根据权利要求1-4所述的方法得到的抗非洲猪瘟病毒和CD复合 IgY抗体纯品溶液调节pH至3.0-5.0，加入催化蛋白质酶；充分搅拌溶解，产生酶促反应，然后低温高速旋转离心，弃去沉淀得上清液，对上清液进行超滤，得到浓缩液；再将超滤后所获浓缩液进行凝胶层析，将层析收集物透析浓缩，得到抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体。

在本发明提供的抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体的制备方法中，还包括：

利用聚乙二醇、右旋糖苷或聚氨基酸长效化修饰步骤S7制备得到的抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体，得到长效化的抗非洲猪瘟病毒和CD 多克隆小分子抗体。

在本发明提供的抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体的制备方法中，还包括：

采用天然来源的CPPs或人工合成的CPPs偶联抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体，得到渗透细胞膜能力强的偶联的抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体。

本发明还提供一种抗非洲猪瘟病毒抗体，所述抗非洲猪瘟病毒抗体为抗非洲猪瘟病毒IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体，使用上述抗非洲猪瘟病毒抗体的制备方法制得。

本发明还提供一种抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体，使用上述抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体制备方法制得。

本发明还提供一种组合物，包括使用上述抗非洲猪瘟病毒抗体的制备方法制得的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体中的一种，使用上述抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体制备方法制得的抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体以及至少一种其它药学上可接受的组分。

在本发明提供的组合物中，所述抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体添加辅料或基料制成口服液、凝胶、洗液、喷雾剂、鼻喷剂、滴鼻剂、丸剂、片剂、泡腾片、胶囊剂、软胶囊、消毒剂、水针剂和粉针剂中的至少一种，可制备用于消除非洲猪瘟病毒感染以及预防和治疗非洲猪瘟病的生物药和消毒产品。

在本发明提供的组合物中，所述抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体制成注射用水针剂和粉针剂中的至少一种，可用于受非洲猪瘟病毒严重感染猪只的紧急救治。

本发明还提供一种抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体在制备用于阻止和清除非洲猪瘟病毒对猪的侵染、和/或用于预防和治疗非洲猪瘟的药物、消毒产品中的应用，使用上述抗非洲猪瘟病毒抗体的制备方法制得的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体，使用上述抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体制备方法制得的抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体。

本发明还提供一种抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体预防非洲猪瘟在制备饲料和饲料添加剂中的应用，其特征在于，将如上权利要求制得的单价或复合单价的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体干粉或粗提物干粉或者抗体纯化液或粗提液作为干粉状或液体状的饲料成份或饲料添加剂添加到干粉状或液体状的猪饲料中。

应用本发明的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合 IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体或纳米脂质体化的抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体将带来以下四方面的有益效果：

1、改变疫苗预防的传统方式，解决目前全球试验的疫苗都无效的难题：目前世界各国主要都是在研究如何采用疫苗预防非洲猪瘟，但是，第一，非洲猪瘟病毒是少有的遗传多变性DNA病毒，基因类型多，数量庞大，疫苗只能针对几种型号，对大部分型号无效；第二，非洲猪瘟病毒易变异，疫苗研制的速度跟不上病毒变异速度，加上非洲猪瘟病毒在感染及传代过程中病毒抗原的易变性，使疫苗的作用大打折扣；第三，疫苗只有预防作用，没有治疗作用，猪一旦发病注射疫苗只能雪上加霜。本发明改变了注射疫苗刺激猪体内产生抗体的传统方式，而采用直接向猪体内输入高活性抗体的被动免疫方式。本发明的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体或纳米脂质体化的抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体既能通过“体液免疫”杀灭进入体内的非洲猪瘟病毒，又可阻隔非洲猪瘟病毒粘附细胞，保护细胞不受病毒侵染，直接起封闭作用，这是阻断感染的关键。抗非洲猪瘟病毒IgY 抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD复合 Fab小分子抗体还可对被侵染细胞局部新释放的病毒进行中和，使其丧失扩散的能力。另外，本发明的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体的效价比注射疫苗在体内产生的抗体的效价普遍高200 倍以上(注：注射疫苗在体内产生抗体的效价﹥1:40即合格，抗非洲猪瘟病毒IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体效价1:1万以上)；从而，可从另一个角度解决疫苗诱导产生的抗体不具备中和非洲猪瘟病毒的能力的难题。更重要的是，科学试验和研究已证明非洲猪瘟是粪口途径传播的烈性传染病，只有切断粪口途径才能阻断疫情的发生和蔓延；对于预防和阻隔粪口途径传播的烈性传染病来说，经由口腔和消化道直接输入高活性抗体就变得更直接和有效。鉴于非洲猪瘟病毒在世界范围内迅速扩张的速度，科学家们判断饲料原料是非洲猪瘟病毒的主要载体之一，猪饲料也就成为非洲猪瘟从传染源到易感动物的重要传播途径；为了切断这个造成疫情迅速扩散蔓延的源头，解决这个全球养猪业最头痛的问题，本发明将抗非洲猪瘟病毒IgY抗体粗提物作为饲料添加剂加入猪饲料中，对于疫区和附近的猪场最好将抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体粗提物作为饲料添加剂，采用抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或优化组合的IgY抗体抑灭混在饲料中的非洲猪瘟病毒；从而，消除了非洲猪瘟病毒经由口腔和消化道的侵染。另外，最新的研究证明空气也是非洲猪瘟病毒扩散的渠道之一，因此，本发明将抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或优化组合的IgY及多克隆小分子抗体制成鼻喷剂或滴鼻剂，阻止非洲猪瘟病毒经鼻腔由呼吸道进入体内，达到最直接切断空气传播途径之目的。对于这两个方面，疫苗都是很难达到这个效果的。因此，本发明提供的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体、抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体或纳米脂质体化的抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体对于预防和阻断非洲猪瘟疫情是超越疫苗的更佳选择，是对传统预防方式的创新。

2、抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体激活受损免疫系统：非洲猪瘟病毒是一种特殊病毒，主要以猪的单核吞噬细胞为感染靶细胞，直接和间接破坏宿主的免疫组织，并造成严重的免疫抑制，导致疫苗不起作用，其所含凋亡蛋白可使靶细胞(巨噬细胞和其它免疫细胞)凋亡，无论是自然感染或人工感染，非洲猪瘟病毒均不产生典型的中和抗体，最近世界各国科学家研究改进的疫苗虽然能诱导产生一定水平的抗体，但并不具备中和非洲猪瘟病毒的能力，无法达到有效防控非洲猪瘟的目的，这是疫苗研制的最大障碍；另外，非洲猪瘟病毒免疫逃逸机制复杂多样，会干扰免疫调节基因的表达，逃避宿主免疫细胞的清除，这也是影响疫苗实际效果的重要因素。本发明的抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体具有多种功能，第一个功能是把引致“免疫抑制”和“免疫逃逸”的抗原蛋白作为靶抗原，(1) 攻击并抑灭参与病毒吸附和侵入细胞的P72蛋白，阻止非洲猪瘟病毒吸附和侵入猪体内细胞，(2)攻击并抑灭作为免疫抑制剂且具有促细胞凋亡作用的A238L，消除免疫抑制，恢复免疫功能，(3)攻击和抑灭在免疫逃逸中起关键作用的P54蛋白，消除免疫逃逸，(4)攻击并抑灭在病毒扩散及损伤淋巴细胞过程中起重要作用的CD2V蛋白，阻断非洲猪瘟病毒扩散侵染其它健康细胞，保护淋巴细胞不受非洲猪瘟病毒攻击，健全免疫系统；第二个功能是把T细胞表面的CD3抗原蛋白作为靶抗原，激活T细胞裂解受感染细胞，使其凋亡。由于本发明的抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体使导致“免疫抑制”和“免疫逃逸”的A238L和P54以及损伤淋巴细胞的CD2V 抗原蛋白失活，同时激活T细胞；既消除“免疫抑制”和“免疫逃逸”，又保护并激活免疫细胞；因此，从另一个角度解决疫苗诱导产生的抗体不具备中和非洲猪瘟病毒能力的难题。

3、抗体纳米脂质体化提高治疗指数：本发明将抗非洲猪瘟病毒IgY抗体、抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体制成微胶囊和纳米微囊或微乳或纳米脂质体，可提高抗体的生物利用度，并产生延效作用；当将这种抗体制成口服剂或添加到饲料中供猪只食用，以口服方式用于预防和治疗非洲猪瘟时，纳米脂质体剂型可减少胃和消化道酶对抗体生物活性的破坏。同时，制成微胶囊和纳米微囊或微乳或者纳米脂质体化的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体、抗非洲猪瘟病毒和CD 复合IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体可增强进入微循环血管和渗透细胞间隙的能力，使抗体更有效地渗透进入病灶部位抑灭非洲猪瘟病毒病原体。另外，偶联了穿膜肽的以及抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体可通过胞吞作用进入受非洲猪瘟病毒感染的细胞发挥细胞免疫作用；从而，进一步提升治疗指数。

4、多种复合抗体优化组合全方位防治：本发明提供了针对六种有代表性抗原蛋白的、采用“重组蛋白”或“重组病毒”抗原免疫鸡而制成的多种抗非洲猪瘟病毒IgY抗体、抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体，既有单价和双价的，也有多价的，有效价最高、功效最全的VIP产品，也有单一或复合的单价和双价的普及型产品。在实际应用中可根据当地流行的非洲猪瘟病毒的型号特点以及疫情和发病猪群的病情进行优化选择，采用最经济的手段，达到有效防治的目的。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

一、制备抗非洲猪瘟病毒IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY 抗体。所述抗非洲猪瘟病毒IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体由如下方法制备得到：

S1、制备抗原：在非洲猪瘟病毒抗原重组蛋白、表达非洲猪瘟病毒抗原蛋白的重组病毒和猪CD重组蛋白中的一种或多种中加入弗氏佐剂，并置于高速匀浆器中高速匀化，得到免疫用的重组蛋白单价抗原、重组蛋白复合双价抗原、重组病毒单价抗原、重组病毒复合双价抗原、重组蛋白双价抗原、重组病毒双价抗原、重组蛋白多价抗原以及重组病毒多价抗原；

S2、制备免疫蛋：利用步骤S1获得的重组蛋白单价抗原、重组蛋白复合双价抗原、重组病毒单价抗原、重组病毒复合双价抗原、重组蛋白双价抗原、重组病毒双价抗原、重组蛋白多价抗原以及重组病毒多价抗原分别免疫产蛋鸡，每隔两周对产蛋鸡注射一次，注射2-5次，最后一次注射后的至少第12天后取产蛋鸡所产免疫蛋，并进行编码标记，得到抗非洲猪瘟病毒IgY免疫蛋和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY免疫蛋；

S3、制备抗非洲猪瘟病毒IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体粗提物；

S4、制备抗非洲猪瘟病毒IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体纯品溶液；

S5、制备抗非洲猪瘟病毒IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体纳米粉；

S6、制备抗非洲猪瘟病毒IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体脂质体液晶微囊。

具体地，在步骤S1中，所述非洲猪瘟病毒抗原重组蛋白为真核细胞或原核细胞表达并纯化的非洲猪瘟病毒代表性抗原蛋白；将非洲猪瘟病毒代表性抗原蛋白的基因***病毒载体的基因组中，获得所述表达非洲猪瘟病毒抗原蛋白的重组病毒；所述非洲猪瘟病毒代表性抗原蛋白包括VP73、 P54、P72、P30、A238L、CD2V中的至少一种；所述猪CD重组蛋白为真核细胞或原核细胞表达并纯化的代表性猪CD蛋白，所述代表性猪CD蛋白包括猪CD3蛋白、猪CD2蛋白、猪CD8蛋白中的至少一种。利用非洲猪瘟病毒抗原重组蛋白制备重组蛋白单价抗原和重组蛋白复合双价抗原，利用表达非洲猪瘟病毒抗原蛋白的重组病毒制备重组病毒单价抗原和重组病毒复合双价抗原，利用非洲猪瘟病毒抗原重组蛋白和猪CD重组蛋白制备重组蛋白双价抗原，利用表达非洲猪瘟病毒抗原蛋白的重组病毒和猪CD重组蛋白制备重组病毒双价抗原，利用非洲猪瘟病毒抗原重组蛋白、表达非洲猪瘟病毒抗原蛋白的重组病毒和猪CD重组蛋白制备重组蛋白多价抗原以及重组病毒多价抗原。

因此，步骤S1包括：

1、选择有代表性的抗原成份：

鉴于非洲猪瘟病毒VP73蛋白是主要结构蛋白且具有稳定的免疫原性， P54蛋白在逃避宿主防御系统的机制中起关键作用，P72蛋白参与病毒与细胞的吸附和进入，针对P72的抗体可以阻断病毒与巨噬细胞的结合；P30蛋白是主要结构蛋白和强免疫原性蛋白，参与了病毒与细胞表面受体结合的过程，在病毒内化过程中也起到了关键作用；A238L蛋白是一种双功能蛋白，是强有力的免疫抑制剂，具有促细胞凋亡作用；CD2V是病毒粘附蛋白，在病毒扩散及损伤淋巴细胞过程中起重要作用。因此，本发明优选这六种蛋白作为有代表性抗原成份蛋白。为便于辨别，将VP73蛋白命名为A 蛋白，P54蛋白命名为B蛋白，P72蛋白命名为C蛋白，P30蛋白命名为D 蛋白，A238L蛋白名为E蛋白，CD2V蛋白命名为F蛋白。

2、基因重组有代表性的抗原成份

(1)利用非洲猪瘟病毒VP73、P54、P72、P30、A238L、CD2V等六种代表性抗原蛋白(也可选用非洲猪瘟病毒其它蛋白)表达于真核细胞或原核细胞中并加以纯化，得到纯化的代表性重组蛋白，分别命名为A1、B1、 C1、D1、E1、F1；或者将非洲猪瘟病毒VP73、P54、P72、P30、A238L、 CD2V等六种代表性抗原蛋白的基因(也可选用非洲猪瘟病毒其它蛋白的基因)***到乳多空病毒或者腺病毒、或者疱疹病毒、或者痘病毒、或者RNA 病毒等病毒载体的基因组中，构建表达VP73、P54、P72、P30、A238L、CD2V或者非洲猪瘟病毒其它蛋白的重组病毒并加以纯化，得到纯化的代表性重组病毒，分别命名为A2、B2、C2、D2、E2、F2。

(2)利用大肠杆菌表达猪CD3重组蛋白或其它种类猪CD重组蛋白(如 CD2和CD8)并纯化猪CD3重组蛋白或其它种类猪CD重组蛋白(如CD2和 CD8)，为便于辨别，将CD蛋白命名为G蛋白。

3.制作抗原

(1)制作单价抗原和复合单价抗原

将六种代表性重组蛋白中的VP73单一重组蛋白或VP73重组蛋白与其它5种重组蛋白混合均匀或者其中一种重组蛋白与其它5种重组蛋白混合均匀，再加上弗氏佐剂等佐剂，重组蛋白抗原成份与弗氏佐剂的质量比的比值为(1-10):(10-1)，并置于高速匀浆器中高速匀化，制成重组蛋白单价抗原和复合单价抗原。分别为A1，(A1+B1+C1+D1+E1+F1)。

将六种代表性重组病毒中的VP73单一重组病毒或VP73重组病毒与其它5种重组病毒混合均匀或者其中一种重组病毒与其它5种重组病毒混合均匀，再加上弗氏佐剂等佐剂，重组病毒抗原成份与弗氏佐剂的质量比的比值为(1-10):(10-1)，并置于高速匀浆器中高速匀化，制成重组病毒单价抗原和复合单价抗原。分别为A2，(A2+B2+C2+D2+E2+F2)。

(2)制作双价抗原

将六种代表性重组蛋白中的其中一种与猪CD3重组蛋白或其它种类猪 CD(如CD2和CD8)重组蛋白中的一种混合均匀再加上弗氏佐剂等佐剂，重组蛋白抗原成份与弗氏佐剂的质量比的比值为(1-10):(10-1)，并置于高速匀浆器中高速匀化，制成重组蛋白双价抗原或重组病毒双价抗原。分别为A1G、B1G、C1G、D1G、E1G、F1G。可以将A1G与其它1-5种双价抗原组合制成重组蛋白复合双价抗原。

将六种代表性重组病毒中的其中一种与猪CD3重组蛋白或其它种类猪CD(如CD2和CD8)重组蛋白中的一种混合均匀再加上佐剂，抗原成份与弗氏佐剂的质量比的比值为(1-10):(10-1)，并置于高速匀浆器中高速匀化，制成重组病毒双价抗原。分别为A2G、B2G、C2G、D2G、E2G、F2G。可以将A2G与其它1-5种双价抗原组合制成重组病毒复合双价抗原。

(3)制作多价抗原

将六种代表性重组蛋白中的其中一种与其它代表性抗原蛋白中的任意 1-5种混合，或者将表达六种代表性重组病毒中的一种与其它代表性重组病毒中的1-5种混合；然后再与猪CD3重组蛋白或其它种类猪CD(如CD2 和CD8)重组蛋白中的一种混合均匀加上佐剂，抗原成份与弗氏佐剂的质量比的比值为(1-10):(10-1)，并置于高速匀浆器中高速匀化，即制成多种组合的重组蛋白多价抗原或重组病毒多价抗原。其中一种组合可为： A1B1G、A1B1C1G、A1B1C1D1G、A1B1C1D1E1G、A1B1C1D1E1F1G，另一种组合可为：A2B2G、A2B2C2G、A2B2C2D2G、A2B2C2D2E2G、A2B2C2D2E2F2G，等等。

具体地，在步骤S2中，采用所制备的(1)重组蛋白单价抗原和复合双价抗原或重组病毒单价抗原和复合双价抗原，(2)重组蛋白双价抗原或重组病毒双价抗原，(3)多种组合的重组蛋白多价抗原或重组病毒多价抗原，分别免疫产蛋鸡；每隔两周对产蛋鸡注射一次，共注射2-5次，最后一次注射后的至少第12天后取产蛋鸡所产免疫蛋，并进行编码标记，得到多种组合的抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体免疫蛋。所获的的免疫蛋可分别标记为：A1免疫蛋和A2免疫蛋、(A1+B1+C1+D1+E1+F1)免疫蛋、 (A2+B2+C2+D2+E2+F2)免疫蛋以及A1G免疫蛋、B1G免疫蛋、C1G免疫蛋、 D1G免疫蛋、E1G免疫蛋、F1G免疫蛋，A2G免疫蛋、B2G免疫蛋、C2G免疫蛋、D2G免疫蛋、E2G免疫蛋、F2G免疫蛋；依此类推。

具体地，在步骤S3中，采用纯水提取法、氯仿萃取法、冷乙醇沉淀法或硫酸铵沉淀法制备抗非洲猪瘟病毒IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD复合 IgY抗体粗提物。以纯水提取法为例说明：具体包括：把所制备的抗非洲猪瘟病毒IgY免疫蛋或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY免疫蛋用流动水洗净，酒精擦洗消毒，再用打蛋机打碎抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY免疫蛋，采用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；再按蛋黄液体积的 3-8倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.5；将调好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至 2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液于高速离心；取分离所得的上清液置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入浓度为1.0-3.0％的海藻酸钠液，缓慢添加海藻酸钠液至终浓度为0.1-0.2％，搅拌至出现浑浊；再加入 1.0-3.0％CaCl2液，至终浓度为0.1-0.2％，搅拌均匀，3-4℃静置8-12小时；高速离心并取上清液，得到抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体粗提物。

具体地，在步骤S4中，将制得抗非洲猪瘟病毒IgY抗体粗提物或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体粗提物溶解于pH7.0、0.01mol/L的M PB 磷酸盐缓冲液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，得到抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体纯品溶液。

具体地，在步骤S5中，将制得的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体纯品溶液或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体纯品溶液经过冷冻干燥或中低温喷雾干燥或者流化床干燥以及其他不影响抗体活性的干燥方式制得抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体纯品干粉。

具体地，在步骤S6中，将所制得的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体纯品干粉或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体纯品干粉加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，制得抗非洲猪瘟病毒IgY抗体纳米粉或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体纳米粉。

具体地，在步骤S7中，先把卵磷脂和胆固醇溶于***中，再将抗非洲猪瘟病毒IgY抗体纯品或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体纯品加入 4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成IgY抗体溶液，超声处理2min(每处理 0.5min，间歇.0.5min)，立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽***，进而超速离心(35000r/min，30min)分离除去未包入的IgY抗体，沉淀用水洗二次，离心，得沉淀，用 10mmol/L PBS稀释，即制得抗非洲猪瘟病毒IgY抗体脂质体液晶微囊或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体脂质体液晶微囊。

将制得的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体脂质体液晶微囊或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体脂质体液晶微囊经过冷冻干燥或中低温喷雾干燥或者流化床干燥以及其他不影响抗体活性的干燥方式除去水份即制得纳米脂质体抗非洲猪瘟病毒IgY抗体粉或纳米脂质体抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体粉。

以上所制成的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合 IgY抗体粗提物、纯品溶液、纯品干粉、纳米粉、纳米脂质体粉，都应根据免疫的抗原不同分别标记为A1-IgY抗体、B1-IgY抗体、C1-IgY抗体、 D1-IgY抗体、E1-IgY抗体、F1-IgY抗体或者A1G-IgY抗体、B1G-IgY抗体、C1G-IgY抗体、D1G-IgY抗体、E1G-IgY抗体、F1G-IgY抗体；依此类推。

二、制备抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体

将所制得的抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体纯品溶液调节pH至 3.0-5.0，加入催化蛋白质酶；催化蛋白酶加入质量比的比例为 0.01％-0.1％；充分搅拌溶解，产生酶促反应，然后低温高速旋转离心，弃去沉淀得上清液，对上清液进行超滤，得到浓缩液；再将超滤后所获浓缩液进行凝胶层析，将层析收集物透析浓缩，得到抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体。

所制成的抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体都必须根据所对应的抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体，分别标记为A1G-小分子抗体、B1G- 小分子抗体、C1G-小分子抗体、D1G-小分子抗体、E1G-小分子抗体、F1G- 小分子抗体；依此类推。

三、长效化处理抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体

将得到的抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体利用聚乙二醇、右旋糖苷或聚氨基酸长效化修饰得到长效化的抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体。

本发明以利用聚乙二醇进行长效化修饰为例说明，实际应用时不限于这一方法，可采用氯仿萃取法与冷乙醇沉淀法以及硫酸铵沉淀法等方法。采用聚乙二醇长效化修饰的方法如下：

调节硼酸缓冲液pH值至6.5-10.0，在抗非洲猪瘟病毒和CD复合Fab 小分子抗体中加入调节pH后的硼酸缓冲液，使抗非洲猪瘟病毒和CD复合 Fab小分子抗体的浓度为0.1-0.5mg/mL，加入聚乙二醇进行反应，且抗非洲猪瘟病毒和CD复合Fab小分子抗体与聚乙二醇的摩尔比的比值为1/10～ 1/30，反应温度为15℃～30℃，反应时间控制在1h～3h。

四、抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体偶联穿膜肽

采用天然来源的CPPs或人工合成的CPPs偶联抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体，得到渗透细胞膜能力强的偶联的抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体，其中一种偶联方法如下：

取如下质量份数的粉末状的抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体干粉1-3份、CPPs-EGFP1-3份、BSA-NS蛋白微球5-10份，分别溶于各自的 pH7.5、0.01mol/L的PBS，得到浓度为0.5-1.5g/L的抗非洲猪瘟病毒和 CD多克隆小分子抗体溶液、浓度为0.5-1.5g/L的CPPs-EGFP溶液、浓度为 2.5-5g/L的蛋白微球溶液，再分别以体积比1:10～1:30的比例缓慢加入 10-25mol/L的乙醇溶液，室温搅拌反应10-30分钟，将抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体的反应混合物和CPPs-EGFP的反应混合物分别加入超滤离心管，分别以pH4.5、0.01mol/L的醋酸盐缓冲液和pH7.5、 0.01mol/L的PBS为洗涤液在4℃条件下离心洗涤；将BSA-NS蛋白微球反应混合物加入超滤离心管，并以pH7.5、0.01mol/L的PBS在4℃条件下离心洗涤，以去除剩余SPDP，分别得到抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体Fab-PDP、CPPs-EGFP-PDP、BSA-NS-PDP的SPDP衍生物，4℃保存备用；在得到的抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体Fab-PDP醋酸盐溶液中加入适量DTT使反应体系中DTT终浓度为50mmol/L，室温下轻搅30 分钟，加入超滤离心管中，以pH7.5、0.01mol/L的PBS为洗涤液在4℃条件下离心洗涤，去除剩余DTT，得到抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体Fab-PDP-SH溶液，并立即与CPPs-EG-FP-PDP、BSA-NS-PDP溶液混合， 4℃搅拌15-20h，用PBS离心洗涤，沉淀，最终得到CPPs-EG-FP-BSA-NS- 抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体Fab蛋白偶联物。

在实际应用时，可将以上A1-IgY抗体、B1-IgY抗体、C1-IgY抗体、 D1-IgY抗体、E1-IgY抗体、F1-IgY抗体或者A1G-IgY抗体、B1G-IgY抗体、C1G-IgY抗体、D1G-IgY抗体、E1G-IgY抗体、F1G-IgY抗体或者 A2G-IgY抗体、B2G-IgY抗体、C2G-IgY抗体、D2G-IgY抗体、E2G-IgY抗体、F2G-IgY抗体任意组合成单价或双价或多价抗非洲猪瘟病毒和CD复合 IgY抗体组合物。其中针对六种代表性的抗原的集合A1-IgY抗体、B1-IgY 抗体、C1-IgY抗体、D1-IgY抗体、E1-IgY抗体、F1-IgY抗体等六种抗体或者集合A2-IgY抗体、B2-IgY抗体、C2-IgY抗体、D2-IgY抗体、E2-IgY 抗体、F2-IgY抗体等六种抗体(统一简称“六单优抗”)以及集合A1G-IgY 抗体、B1G-IgY抗体、C1G-IgY抗体、D1G-IgY抗体、E1G-IgY抗体、 F1G-IgY抗体等六种抗体或者集合A2G-IgY抗体、B2G-IgY抗体、C2G-IgY 抗体、D2G-IgY抗体、E2G-IgY抗体、F2G-IgY抗体六种抗体等六种抗体(统一简称“六双优抗”)，按一定比例混合而成的抗体组合物效价最高、功效也最全，是实际应用中最优选项。而作为添加到饲料中的抗体成份，为节约成本可选用仅包括A1-IgY抗体或A2-IgY抗体或者集合A1-IgY抗体、 B1-IgY抗体、C1-IgY抗体、D1-IgY抗体、E1-IgY抗体、F1-IgY抗体以及集合A2-IgY抗体、B2-IgY抗体、C2-IgY抗体、D2-IgY抗体、E2-IgY抗体、F2-IgY抗体的经济型产品。

抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体同样参照以上方式进行组合。在实际应用时，为提高疗效，最好将抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体按一定比例与相对应的抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体混合后联合使用，以利用多克隆小分子抗体容易渗透粘膜层的特点，特别是可发挥偶联穿膜肽的多克隆小分子抗体具有的进入受感染细胞产生“细胞免疫”作用的独特优势。

本发明还提供了上述的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和 CD复合IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体在制备用于阻止和清除非洲猪瘟病毒对猪的侵染、和/或用于预防和治疗非洲猪瘟的药物、消毒产品中的应用。

本发明还提供了一种抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD 复合IgY抗体预防非洲猪瘟在制备生物安全饲料和饲料添加剂中的应用。由于猪饲料是非洲猪瘟从传染源到易感动物的重要传播途径，非洲猪瘟病毒又可在饲料原料中存活超过30天；因此，可将单价、双价、多价或复合单价、双价、多价的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体干粉或者其粗提物干粉添加到猪饲料中，生产一种预防非洲猪瘟的饲料和饲料添加剂。

另外，本发明还提供一种组合物，该组合物包含前述的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD 多克隆小分子抗体加上药学上可接受的辅料。需要说明的是，该组合物可以是由前述的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体加上辅料制备的各种药物制剂等，也可以是制备的动保产品和消毒产品等。

前述的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体以及抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体或纳米脂质体化的抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体可以制成各种稳定制剂，包括但不限于下述制剂：

优选地，辅料包括赋形剂、填充剂、溶剂、助溶剂、表面活性剂和胶囊辅料中一种或多种。

优选地，该制剂为喷雾剂(供环境和运输工具消毒以及养猪场和屠宰场消毒和净化)、粉剂(可制成猪饲料成份或饲料添加剂)、片剂、口服液剂、猪用口喷剂、鼻喷剂或胶囊等。

前述的抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体或纳米脂质体化的抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体制成注射用水针剂和粉针剂中的至少一种。其可用于以下用途：受非洲猪瘟病毒严重感染猪只的紧急救治。

或者，前述的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体或抗非洲猪瘟病毒和CD复合 IgY抗体和抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体或纳米脂质体化的抗非洲猪瘟病毒和CD复合IgY抗体添加辅料或基料制成口服剂、凝胶、洗液、喷雾剂、鼻喷剂、滴鼻剂、丸剂、片剂、泡腾片、胶囊剂、软胶囊、消毒剂、水针剂和粉针剂中的至少一种，可制备用于消除非洲猪瘟病毒感染以及预防和治疗非洲猪瘟病的生物药或消毒产品。由于猪饲料是非洲猪瘟从传染源到易感动物的重要传播途径，非洲猪瘟病毒又可在饲料原料中存活超过30天；因此，可将单价单价、双价、多价或复合单价、双价、多价的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体干粉或粗提物干粉或者抗体纯化液或粗提液作为干粉状或液体状的饲料成份或饲料添加剂添加到干粉状或液体状的猪饲料中，生产一种预防非洲猪瘟的饲料和饲料添加剂。

下面通过具体实施例进行详细说明。

实施例一

抗非洲猪瘟病毒IgY对VP73、P54、P72、A238L、CD2V等五种代表性抗原蛋白的抗体结合效价检测。

分别采用VP73、P54、P72、A238L、CD2V作为检测抗原，用“ELISA”方法(酶联免疫法)检测所制得的抗非洲猪瘟病毒IgY的抗体效价，结果如下表所示：

注：测试样本中的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体溶液浓度为1mg/mL。

从以上检测结果可看出，所制备的抗非洲猪瘟病毒IgY抗体对有代表性VP73、P54、P72、P30、A238L、CD2V蛋白抗原都有很高的抗体结合效价。

实施例二

抗非洲猪瘟病毒和CD-IgY对VP73、P54、P72、A238L、CD2V等五种代表性抗原蛋白的抗体结合效价检测。

分别采用VP73、P54、P72、A238L、CD2V作为检测抗原，用“ELISA”方法(酶联免疫法)检测所制得的抗非洲猪瘟病毒和CD-IgY的抗体效价，结果如下表所示：

注：测试样本中的抗非洲猪瘟病毒和CD-IgY抗体溶液浓度为1mg/mL。

从以上检测结果可看出，所制备的抗非洲猪瘟病毒和CD-IgY抗体对有代表性VP73、P54、P72、P30、A238L、CD2V蛋白抗原都有很高的抗体结合效价。

实施例三

抗非洲猪瘟病毒和CD-IgY抗体对CD的抗体结合效价检测。以CD3抗原为例。

采用CD3作为检测抗原，用“ELISA”方法(酶联免疫法)检测所制得的抗非洲猪瘟病毒和CD-IgY抗体的抗体效价，结果如下表所示：

注：测试样本中的抗非洲猪瘟病毒和CD-IgY抗体溶液浓度为 1mg/mL。

从以上检测结果可看出，所制备的抗非洲猪瘟病毒和CD-IgY抗体对 CD3抗原有很高的抗体结合效价。

实施例四

【抗非洲猪瘟病毒IgY抗体口服液】和【纳米脂质体抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体针剂】预防和治疗非洲猪瘟病毒感染的动物试验。

试验动物：非洲猪瘟病毒抗原和抗体双阴性的30日龄(12kg)仔猪60 头，随机分为四组，空白对照组、生理盐水对照组、抗体预防组、抗体治疗组。

试验环境要求：在生物安全防护3P实验室(室内处于负压状态)进行。

试验用药物：1.抗体预防组使用【抗非洲猪瘟病毒IgY抗体口服液】； 2.抗体治疗组使用【纳米脂质体抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体针剂】；3.生理盐水对照组用生理盐水针剂。

试验方法：

病毒稀释方法

对非洲猪瘟病毒阳性血清用PBS稀释,使得毎毫升血清稀释液所含原血清量为1uL，经荧光定量PCR分析,所含非洲猪瘟病毒拷贝数为20,000，每头猪只攻毒剂量为1mL血清稀释液。

攻毒方法

每头猪只按注射原血清量1uL进行攻毒。

空白对照组(不攻毒)、生理盐水对照组(攻毒后第二天和第七天各注射一次生理盐水，每头猪每次注射2mL)、抗体预防组(攻毒前三天开始饲喂【抗非洲猪瘟病毒IgY抗体口服液】，每天饲喂两次，连续饲喂14天、抗体治疗组(攻毒后第二天注射【纳米脂质体抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体针剂】，第三天和第七天再每天各注射一次，每头猪每次注射 2mL)。

采血检测

在攻毒前一天和攻毒后的第1、2、7、10、21天进行采血和检测。

试验结果

(1)症状观察

(2)非洲猪瘟病毒抗原检测

6.结论：

(1)【抗非洲猪瘟病毒IgY抗体口服液】可预防仔猪受非洲猪瘟病毒感染，保护率达86％；

(2)【纳米脂质体抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体针剂】可治疗已受到非洲猪瘟病毒感染的仔猪，治愈率达100％。

实施例五

生产【纳米脂质体抗非洲猪瘟病毒和CD多克隆小分子抗体针剂】

将所制得的纳米脂质体化的“六双优抗”小分子抗体(包括A1G小分子抗体、B1G小分子抗体、C1G小分子抗体、D1G小分子抗体、E1G小分子抗体、F1G小分子抗体等六种小分子抗体)制成一种新型注射剂，用于预防和治疗非洲猪瘟。具体配方和生产工艺如下：

配方

原料	重量百分比(％)
		纳米脂质体化的“六双优抗”小分子抗体	12.5
磷酸二氢钠一水合物	9.0
		磷酸氢二钠七水合物	27.5
氯化钠	11.5
		聚山梨醇酯-80	0.5
PEG400	6.0
		注射用水	33.0

工艺

(1)将配方量注射用水加0.1％针用活性炭，60℃搅拌15min；脱炭过滤；滤液密闭加热100℃30min，冷却至室温备用；

(2)一边搅拌一边分别将配方量磷酸二氢钠一水合物和磷酸氢二钠七水合物以及氯化钠加入占配方量90％的经活性炭处理过的灭菌注射用水中，加热溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入PEG400混匀；在搅拌下加入上述混合液中；再加0.1％针用活性炭，60℃搅拌15min,脱炭过滤；滤液密闭加热100℃30min，冷却至室温备用，得混合液A；

(3)一边搅拌一边将纳米脂质体“六双优抗”小分子抗体纯化液加入占配方量10％的经活性炭处理过的灭菌注射用水，充分溶解，得纳米脂质体抗非洲猪瘟病毒和抗CD小分子抗体溶液B。

(4)一边搅拌一边将小分子抗体溶液B以细流加于混合液A中，充分溶解，得溶液C。

(5)用0.1mol的NaOH溶液调节溶液C的pH值至6.0～7.5。

(6)采用已灭菌的0.45μm串联0.22μm微孔滤膜将溶液C过滤除菌。于无菌灌封机中灌封于无菌容器中；灯检、检漏、印字、包装出厂。

实施例六

生产防控非洲猪瘟消毒用喷雾剂或口服剂溶液(供猪场、屠宰场、运输车辆消毒以及猪场净化用，也可分装在喷雾罐作猪用口喷剂和鼻喷剂以及滴鼻剂以及分装在口服剂瓶内用于猪群预防和治疗非洲猪瘟病毒感染)。

配方

工艺

(1)将配方量海藻精华、医药级甘油、香精以及403、503发泡剂用紫外光照射灭菌消毒24小时，无菌密封备用；

(2)将配方量蒸馏水加热至90℃，停留15分钟；再冷却至60℃，一边搅拌一边先后加入海藻精华和医药级甘油，低速揽拌30分钟，直至完全溶解，冷却至室温，得溶液A；

(3)一边搅拌一边将香精(玫瑰花香精)加入溶液A中，低速搅拌60min，直至完全溶解，得溶液B；

(4)将403加热至80℃，然后一边搅拌一边将503徐徐滴加入到403中，低速搅拌30min，得到溶液C；

(5)保持溶液C温度在80℃，一边搅拌一边将薄荷油徐徐滴加入到溶液C中，低速搅拌60min，得到溶液D；

(6)将溶液D加热至90℃高温灭菌5min，然后冷却至室温；

(7)一边搅拌一边将溶液B缓慢地加到溶液D中，低速搅拌60min；如未形成均质稳定的乳状溶液，则需延长搅拌时间，制得溶液E；

(8)一边搅拌一边将“六双优抗”小分子抗体纯化液缓慢地加到溶液 E中，低速搅拌60min；如未形成均质稳定的乳状溶液，则需延长搅拌时间，制得溶液F；

(9)用pH计测量溶液F的pH值，采用柠檬酸或pH4.5磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液调节pH值至4.5±0.1；

(10)静置一夜，直至上部泡沫全部消溶后，再将溶液F液分装在清洗消毒过的塑料容器中，贴上标签出厂。

实施例七

生产“六双优抗”抗体片剂(用于受非洲猪瘟病毒感染病猪的紧急救治)

配方

工艺

(1)山梨糖醇过60目筛两次备用；

(2)羧甲基纤维素分散于30％乙醇中制成1％乙醇溶液；

(3)将(1)项用适量(2)项制软材，14目筛网制粒，60℃通风干燥， 18目筛整粒；用40目筛筛出适量细粉与“六双优抗”抗体干粉充分混匀；

(4)再拌入硬脂酸镁，一起与整批颗粒混合均匀，密闭4小时以上；

(5)压片机压片，每片600mg；

(6)检验合格后，包装，全验出厂。

实施例八

生产“六双优抗”抗体果冻型乳猪料。

配方

工艺

1、将配方量蒸馏水采用高压蒸气灭菌，加热到121-126℃，压力升至 102.9kPa(1.05kg/cm2)，停留60min，冷却到95℃，然后保持温度在95℃。

2、将配方量果冻粉加入占配方量90％的95℃的蒸馏水中溶解，充分搅拌均匀，制成果冻水溶液A。

3、将配方量糖液加热至95℃，然后加入到果汁果冻水溶液A中，再用大火迅速煮沸浓缩，边煮边搅拌，在20分钟内使混合液上升达106℃，这时即为浓缩终点，制成果冻浓浆B。

4、把占配方量10％的95℃的蒸馏水冷却到室温，再将配方量“六双优抗”抗体液或“六双优抗”抗体干粉加入冷却到室温的蒸馏水中溶解，充分搅拌均匀，制成“六双优抗”抗体水溶液C。

5、将果冻浓浆B冷却到室温，然后一边搅拌一边缓慢地将“六双优抗”抗体水溶液C滴加入到果冻浓浆B中，高速(3000r/min)搅拌60min以上，即制成香甜可口的抗非洲猪瘟果冻型乳猪料。

实施例九

生产“六双优抗”抗体泡腾片

配方

工艺

1.NaHCO3 60℃干燥2hr，加20％PEG乙醇液适量制软材，14目尼龙筛制粒60℃干燥备用。

2.枸椽酸、乳糖、MCC混匀80目粉碎，加于2％HPMC醇液中搅匀。

3.加入“六双优抗”抗体干粉、氢氧化铝混匀过一次14目筛，再加硬脂酸镁混匀压片即得。

4.检验合格后水泡眼包装，外套铝塑复合膜塑料袋密封，装盒，装箱入库。

实施例十

制备抗非洲猪瘟病毒丸剂。配方和工艺如下：

配方

工艺

1、将配方量蜂蜡和麻油按3:7配比混合，一边加热一边搅拌，制成蜂蜡麻油混合物A。

2、一边加热一边搅拌将配方量糊精加入混合物A，充分搅拌均匀，制成混合物B。

3、一边搅拌一边先后将配方量硬脂酸钠、酒石酸、蔗糖加入配方量去离子水中，制得溶液C。

4、一边搅拌一边将“六双优抗”抗体干粉缓缓加入溶液C，搅拌60min，得到溶液D。

5、一边搅拌一边将溶液D滴加入混合物B中，搅拌60min，充分混合均匀，得到膏体E。

6、将膏体E置入全自动中药制丸机，在炼药仓内将膏体E练合成组织均匀、软硬相同、致密性一致的条状物料。然后在送入制丸机的料仓中，经挤压成细条、切断成粒后高速搓制成丸。

7、待药丸发汗，外表***后，用蜡纸、保鲜膜、塑料袋或蜡壳等包好，贮存于阴凉干燥处即可。

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