阅读说明：本技术 一种鹿茸多肽的制备方法及其应用 (Preparation method and application of pilose antler polypeptide ) 是由 丁传波 刘文丛 赵婷 王慈 郑毅男 沈立国 时清评 李沈琦 于 2020-05-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种鹿茸提取物的制备方法,具体涉及一种鹿茸多肽的制备方法,其特征是,将鲜鹿茸处理后,均质处理,加入碱性蛋白酶后在一定压力作用下进行酶解,酶解结束后对酶解液短时间高压,随后酶解液过两次滤膜,得到粗多肽,粗多肽精制后得到两种较纯的多肽,利用这种技术制备的多肽活性更高、同时能够大幅度缩短生产周期、增加收率。(The invention provides a preparation method of a pilose antler extract, and particularly relates to a preparation method of pilose antler polypeptide, which is characterized in that after fresh pilose antler is treated, homogenization treatment is carried out, alkaline protease is added, enzymolysis is carried out under the action of certain pressure, short-time high pressure is carried out on enzymolysis liquid after the enzymolysis is finished, then the enzymolysis liquid passes through twice filter membranes to obtain crude polypeptide, and two purer polypeptides are obtained after the crude polypeptide is refined.)

一种鹿茸多肽的制备方法及其应用

技术领域

本发明提供一种鹿茸提取物制备方法，具体涉及一种鹿茸多肽的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

鹿茸是隶属于脊索动物门哺乳纲鹿科的动物，它是梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化并且密生绒毛的幼角。鹿茸史载于《神农本草经》，指出:―鹿茸专入命门、督，兼入肝。甘咸气温，禀纯阳之质，含发生之气”，属中品。李时珍曰:―龟、鹿皆灵而有寿。鹿鼻常反向尾，能通督脉，故取其角，以补命、补精、补气，皆以养阳也。乃物理之玄微，神工之能事”。而且，现代药理研究亦表明，鹿茸有抗炎作用，可抑制和清除自由基，延缓衰老，促进创伤愈合等作用，鹿茸中提取的鹿茸多肽能够促进体外软骨细胞、成骨细胞的增殖和分化，抑制软骨细胞调亡，同时，文献研究也提示，以鹿茸等为代表的归肝、肾经药物在治疗“痹症”

的方剂中使用频率占到39.3％。

鹿茸中含有比较复杂的化学成分，氨基酸的种类有19种以上，其中包括人体自身不能合成的必需氨基酸，10种磷脂成分，9种脂肪酸(生物活性最强的油酸、亚油酸、亚麻酸含量较高 )、糖脂、糖，固醇类、激素样物质、***素、脑素、核糖核酸、去氧核糖核酸、三磷酸腺苷、硫酸软骨素、多胺、肽类、脂蛋白、维生素、酶类及各种微量元素等。

鹿茸多肽是鹿茸蛋白水解后的产物或从鹿茸中直接分离得到的一类分子量小于10kDa的化合物,鹿茸多肽具有多种活性，如促进骨骼发育、调节免疫、促进细胞增殖和神经再生等生物活性，目前制备鹿茸多肽的主要方法是酸解和酶解制备多肽，酸解制备多肽容易将多肽水解成为氨基酸，酶解多肽能够很好的将蛋白质水解成为需要的肽类成分，但酶解时间较长，酶灭活过程中需要高温，这样容易将多肽活性降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离制备鹿茸多肽的技术方法，通过本方法可以大幅度缩短酶解制备多肽的时间，同还能够提高多肽活性，提高多肽提取率，得到高活性多肽组分。本发明是通过以下步骤实现的：

（1）样品预处理：取新鲜鹿茸，鹿茸切片、粉碎，按重量比1:5-10加入无水乙醇，浸泡1-2h，过滤收集残渣。

（2）将步骤（1）中的残渣按照1：10-15加入蒸馏水，后利用均质机匀浆，匀浆后将鲜鹿茸浆液pH调至9-11，同时加入碱性蛋白酶。随后将鹿茸酶解液放入超高压容器中，压力为50-60Mp，温度为40-50℃，保压时间为20-40min，随后升高设备压力至400兆帕以上，保压时间时间为30-120秒，泄压，得到鲜鹿茸酶解后的浆液，随后将酶解液调至pH调至中性。

（3）将步骤（2）中的酶解液离心，收集上清液，板框过滤后利用再次过分子量为10KDa的中控纤维滤膜，过滤液过1000Da的中控纤维滤膜，弃去1000Da的过滤液，原液冻干，得到鹿茸粗多肽。

（4）将步骤（3）中的鹿茸粗多肽过2次葡聚糖凝胶分离后冻干得到2种单一组分的多肽，分别为APP-1和APP-2。

进一步地，步骤（3）中的粗多肽，利用双缩脲法检测，含量为79.24-82.1%，收率为1.85-2.44%。

进一步地，步骤（4）中的葡聚糖凝胶优选为Sephadex G-75。

进一步地，步骤（4）中鹿茸多肽APP-1和APP-2的SDS-PAGE电泳显示均为一条带，分子量分别为2546.2和4627.1。

进一步地，步骤（4）中鹿茸多肽APP-1和APP-2的纯度分别为94.35-95.72%和96.17-97.25%，收率分别为0.55-0.68%和0.87-0.94%。

本发明的积极效果在于：

1）缩短鹿茸多肽酶解时间，提高反应效率，降低生产成本。

2）增加产物收率，提高多肽活性。

3）得到高纯度、组分单一的2种多肽成分。

实验例1 常规鹿茸多肽的制备

（1）样品预处理：取新鲜鹿茸，鹿茸切片、粉碎，按重量比1-10加入无水乙醇，浸泡2h，过滤收集残渣。

（2）将步骤（1）中的残渣按照1：15加入蒸馏水，后利用均质机匀浆，匀浆后将鲜鹿茸浆液pH调至10.5，同时加入碱性蛋白酶50℃酶解7h，随后95℃高温将酶灭活，将酶解液调至pH调至中性。

（3）将步骤（2）中的酶解液离心，收集上清液，板框过滤后利用再次过分子量为10KDa的中控纤维滤膜，过滤液过1000Da的中控纤维滤膜，弃去1000Da的过滤液，原液冻干，得到鹿茸粗多肽，双缩脲法检测，多肽含量为71.53%，收率为1.23%。

（4）将步骤（3）中的鹿茸粗多肽过2次葡聚糖凝胶分离后冻干得到2种单一组分的多肽，分别为APP-C1和APP-C2，二者分子量分别为4823.5和6138.8，纯度分别为89.32%和85.65%，收率分别为0.12%和0.26%。

实验例2超高压设备压力对鹿茸多肽收率的影响

实验中选择相同的料液比，反应温度和保压时间，主要考察压力对鹿茸粗多肽收率的影响

实验例3鹿茸多肽对糖尿病小鼠血糖和糖化血红蛋白的影响

模型建立

ICR小鼠100只，适应性饲养7天后，随机选取其中10只小鼠为空白对照组，喂正常饲料，其他90只小鼠，喂高脂饲料30天，于第30天晚间禁食不禁水，第31天随机抽取30只眼眶取血，离心取血清测TC、TG，高于正常值，且有显著性差异。腹腔注射100mg/kgSTZ柠檬酸缓冲液，继续喂高脂饲料10天，第10天晚间禁食不禁水，于第11天尾部采血测定血糖值，测空腹血糖≥16.8mmol/L为造模成功，选取成模中60只小鼠，随机分为6组，分别为模型组、鹿茸粗多肽组、APP-1、APP-2、APP-C1、APP-C2，每组10只，空白对照组和模型组每天灌胃生理盐水，其他给药组分别灌胃相应药物，0.1mL/10g剂量给药，共给药40天。

实验结果

备注：APP为高压处理酶解组，APP-C为常规酶解处理组，##表示模型组与空白组相比具有显著性差异，**表示模型组给药组相比具有显著性差异，a表示APP组与APP-C相比具有显著性差异。

具体实施方式

实施例1

（1）样品预处理：取新鲜鹿茸，鹿茸切片、粉碎，按重量比1-10加入无水乙醇，浸泡2h，过滤收集残渣。

（2）将步骤（1）中的残渣按照1：15加入蒸馏水，后利用均质机匀浆，匀浆后将鲜鹿茸浆液pH调至9.45，同时加入碱性蛋白酶。随后将鹿茸酶解液放入超高压容器中，压力为50Mp，温度为50℃，保压时间为40min,随后升高设备压力至500兆帕，保压时间时间为120秒，泄压，得到鲜鹿茸酶解后的浆液，随后将酶解液调至pH调至中性。

（3）将步骤（2）中的酶解液离心，收集上清液，板框过滤后利用再次过分子量为10KDa的中控纤维滤膜，过滤液过1000Da的中控纤维滤膜，弃去1000Da的过滤液，原液冻干，得到鹿茸粗多肽，双缩脲法检测，多肽含量为82.01%，收率为1.93%。

（4）将步骤（3）中的鹿茸粗多肽过2次葡聚糖凝胶分离后冻干得到2种单一组分的多肽，分别为APP-1和APP-2，二者分子量分别为2546.2和4627.1，纯度分别为94.35%和96.17%，收率分别为0.55%和0.87%。

实施例2

（1）样品预处理：取新鲜鹿茸，鹿茸切片、粉碎，按重量比1-10加入无水乙醇，浸泡2h，过滤收集残渣。

（2）将步骤（1）中的残渣按照1：15加入蒸馏水，后利用均质机匀浆，匀浆后将鲜鹿茸浆液pH调至10.5，同时加入碱性蛋白酶。随后将鹿茸酶解液放入超高压容器中，压力为60Mp，温度为50℃，保压时间为30min,随后升高设备压力至450兆帕，保压时间时间为60秒，泄压，得到鲜鹿茸酶解后的浆液，随后将酶解液调至pH调至中性。

（3）将步骤（2）中的酶解液离心，收集上清液，板框过滤后利用再次过分子量为10KDa的中控纤维滤膜，过滤液过1000Da的中控纤维滤膜，弃去1000Da的过滤液，原液冻干，得到鹿茸粗多肽，双缩脲法检测，多肽含量为81.51%，收率为2.44%。

（4）将步骤（3）中的鹿茸粗多肽过2次葡聚糖凝胶分离后冻干得到2种单一组分的多肽，分别为APP-1和APP-2，二者分子量分别为2546.2和4627.1，纯度分别为94.89%和97.25%，收率分别为0.67%和0.91%。