阅读说明：本技术 去整合蛋白变异体及其用途 (Variants of disintegrin and uses thereof ) 是由 黄德富 郭育汝 庄伟哲 于 2017-08-09 设计创作，主要内容包括：在此揭示去整合蛋白变异体,以及用以抑制或抑止亟需此去整合蛋白变异体的个体体内血小板聚集的方法。所述方法包含对该个体施予一有效量的本发明去整合蛋白变异体,以减缓或改善与血小板聚集造成的疾病、病状及/或病症相关的病征。依据较佳实施方式,本发明去整合蛋白变异体是被涂覆于诸如支架或导管等植入式装置的表面上。(Variants of disintegrin are disclosed, as are methods for inhibiting or suppressing platelet aggregation in a subject in need thereof. The methods comprise administering to the subject an effective amount of a disintegrin variant of the invention to alleviate or ameliorate symptoms associated with diseases, conditions and/or disorders caused by platelet aggregation. According to a preferred embodiment, the inventive deitegrin variants are coated on the surface of an implantable device, such as a stent or catheter.)

去整合蛋白变异体及其用途

技术领域

本发明是关于新颖的去整合蛋白变异体，以及其于抑制个体体内血小板聚集及血小板活化的用途。

背景技术

血小板参与多种人体生理及病理的调控机制，例如粥状动脉硬化血栓(atherothrombosis)、干细胞移行(stem cell trafficking)、肿瘤转移(tumormetastasis)及关节炎(arthritis)。血小板于发炎内皮细胞处的活化有助于血管发炎及血管壁重建。血小板可与血管内皮反应，进而影响诸如发炎、血栓及粥状动脉硬化形成等经由血小板及内皮细胞/白血球作用所媒介的生理/病理反应。血小板可造成单核球、噬中性白血球、内皮细胞或内皮先驱细胞等细胞的发炎反应，以引发主要的发炎机制，例如附着、趋化(chemotaxis)、转移、血栓，或是使单核细胞分化为巨噬细胞或泡沫细胞(foam cells)。

血小板活化在发炎反应及引发粥状动脉硬化形成的过程中扮演着重要的角色。诸如引发粥状动脉硬化血栓等心血管疾病(cardiovascular diseases,CVDs)皆与血小板异常或过度活化相关，因此血小板异常/过度活化常被视为造成CVD的独立风险因子。乙酰水杨酸(Acetylsalicylicacid，又称为阿司匹林(aspirin))为第一代抗血小板药剂，其通过乙酰化(acetylation)环加氧酶1(cyclooxygenase 1,COX1)酶的活化位置来不可逆地抑制花生四烯酸(arachidonic acid)路径中COX1酶的作用。对患有粥状动脉硬化血栓且有罹患后续心肌梗塞、中风或血管性死亡的中高度风险的病患长时间施予阿司匹林，可减少其罹患风险(约20％-25％，Patrono et al.,2004Chest 126,234S-264S)。然而，出血性风险仍大幅限制了抗血小板治疗的临床应用。即使氯吡格雷(clopidogrel)及替卡格雷(ticagrelor)等新颖的抗血小板药剂具有治疗CVD的潜力，出血依然是一项有待克服的临床议题。研发人员目前仍致力于探寻抗血小板药剂所引发的出血问题及其治病功效之间的平衡点。

有鉴于此，相关领域亟需一种药剂，其可抑制(suppress)或抑止(inhibit)血小板的聚集及/或活化，而不具引发出血的风险，以研发可用以治疗因血小板聚集所造成的疾病、病状及/或病症的药物。

发明内容

发明内容旨在提供本发明的简化摘要，以使阅读者对本发明具备基本的理解。此发明内容并非本发明的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。

本发明大致是基于发明人意外地发现可用以抑制血小板聚集、血小板活化及血栓形成的新颖去整合蛋白变异体。因此，该些新颖的去整合蛋白变异体可作为潜力候选药剂，以制备用以治疗因血小板聚集所造成的疾病及/或病症的药物。

据此，本发明的第一方面提供了一种去整合蛋白变异体，其可抑制或抑止血小板聚集。该去整合蛋白变异体在结构上包含：

(a)一具有序列编号：1、4、7、8或9的氨基酸序列的连接子(linker)；

(b)一具有序列编号：11-20、24或25的氨基酸序列的RGD环；以及

(c)一具有序列编号：3、6、21、22或23的氨基酸序列的C端。

本发明的去整合蛋白实例包含，但不限于，白唇竹叶青素(albolabrin)、食鱼蝮素(applagin)、墨西哥西海岸响尾蛇素(basilicin)、大具窍蝮蛇素(batroxostatin)、扁头腹蛇素(bitistatin)、亚利桑那黑响尾蛇素(cereberin)、角响尾蛇素(cerastin)、西部菱背响尾蛇素(crotatroxin)、南美响尾蛇素(durissin)、华刚蛇毒素(elegantin)、扁鼻蝮素(eristicophin)、黄绿竹叶青蛇素(flavoridin)、黄绿竹叶青抑制素(flavostatin)、白眉蝮素(halysin)、哈里氏蝮抑制素(halystatin)、美洲矛头蝮蛇素(jararacin)、美洲矛头蝮蛇抑制素(jarastatin)、蝮蛇毒素(kistrin)、叶林腹素(lachesin)、大盆地响尾蛇素(lutosin)、黑尾响尾蛇素(molossin)、马来亚蝮蛇毒蛋白(rhodostomin,Rho)、白眉蝮蛇素(salmosin)、哈里氏蝮素(saxatilin)、大草原响尾蛇素(tergeminin)、黄绿竹叶青蛇毒素(trimestatin)、原矛头蝮素(trimucrin,TMV-7)、原矛头蝮素酶(trimutase)、乌苏里蝮蛇素(ussuristatin)及霍皮响尾蛇(viridian)。

依据某些较佳的实施方式，本发明的去整合蛋白变异体是源自TMV-7。依据其他实施方式，本发明的去整合蛋白变异体是源自Rho。

在某些实施方式中，去整合蛋白变异体包含：

(a)序列编号：1的连接子；

(b)序列编号：10-20的任一RGD环；以及

(c)序列编号：3、21、22及23的任一C端。

在一较佳实施方式中，去整合蛋白变异体包含序列编号：1的连接子，序列编号：14的RGD环，以及序列编号：21的C端。

在其他实施方式中，去整合蛋白变异体包含：

(a)序列编号：7的连接子；

(b)序列编号：13或18的RGD环；以及

(c)序列编号：3、21或22的C端。

在某些实施方式中，去整合蛋白变异体包含序列编号：8的连接子，序列编号：14的RGD环，以及序列编号：21的C端。

在某些实施方式中，去整合蛋白变异体包含：

(a)序列编号：9的连接子；

(b)序列编号：14或20的RGD环；以及

(c)序列编号：3、21或22的C端。

在其他实施方式中，去整合蛋白变异体包含序列编号：4的连接子，序列编号：24或25的RGD环，以及序列编号：6的C端。

依据本发明可选的实施方式，去整合蛋白变异体还包括一聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)链，其具有2-20个乙二醇(ethylene glycol，EG)重复单元且连接于该去整合蛋白变异体的N端。

据此，本发明的第二方面提供了一种用以治疗因血小板聚集所造成的疾病及/或病症的药学组合物。该药学组合物包含一有效量的本发明所述的去整合蛋白变异体，以及一药学上可接受的载体。

依据本发明较佳的实施方式，去整合蛋白变异体在结构上包含序列编号：1的连接子，序列编号：14的RGD环，以及序列编号：21的C端。

依据可选的实施方式，去整合蛋白变异体还包括一PEG链，其具有2-20个EG重复单元且连接于该去整合蛋白变异体的N端。

依据本发明实施方式，因血小板聚集所造成的疾病及/或病症是血栓疾病，其可选自由血管成形术或支架放置后的突发性血管闭合(abrupt vessel closure followingangioplasty or stent placement)、粥状动脉硬化血栓(atherothrombosis)、急性血栓性中风(acute thrombotic stroke)、心肌梗塞(myocardial infarction)、周边血管手术引发的血栓(thrombosis resulted from periphery vascular surgery)、不稳定型绞痛症(unstable angina)及静脉血栓(venous thrombosis)所组成的群组。

依据本发明较佳的实施方式，血栓疾病是粥状动脉硬化血栓。

依据本发明可选的实施方式，该药学组合物还包括一抗凝血剂，其可选自由阿昔单抗(abciximab)、阿哌沙班(apixaban)、阿司匹林(aspirin)、氯吡格雷(clopidogrel)、二吡待摩(dipyridamole)、依度沙班(edoxaban)、依替巴肽(eptifibatide)、利伐沙班(rivaroxaban)、替罗非班(tirofiban)、噻氯匹啶(ticlopidine)、华法林(warfarin)及维生素K(vitamin K)所组成的群组。

依据较佳的实施方式，是将去整合蛋白变异体涂覆于一植入式装置的表面，该植入式装置包含，但不限于，一支架及一导管。可选地，可将去整合蛋白变异体及抗凝血剂分别涂覆于一植入式装置的表面。

本发明的第三方面提供一种用以治疗一罹患或可能罹患一因血小板聚集所造成的疾病及/或病症的个体的方法。该方法包含对该个体施予本发明所述的药学组合物，以减缓或改善与血小板聚集造成的疾病及/或病症相关的征状。

依据本发明实施方式，是对该个体施予每公斤0.01-100毫克的去整合蛋白变异体。较佳地，是对该个体施予每公斤0.1-50毫克的去整合蛋白变异体。

依据本发明实施方式，因血小板聚集所造成的疾病及/或病症是血栓疾病，其可选自由血管成形术或支架放置后的突发性血管闭合、粥状动脉硬化血栓、急性血栓性中风、心肌梗塞、周边血管手术引发的血栓、不稳定型绞痛症及静脉血栓所组成的群组。

依据本发明较佳的实施方式，血栓疾病是粥状动脉硬化血栓。

依据本发明实施方式，该方法还包括对该个体施予一抗凝血剂，其可选自由阿昔单抗、阿哌沙班、阿司匹林、氯吡格雷、二吡待摩、依度沙班、依替巴肽、利伐沙班、替罗非班、噻氯匹啶、华法林及维生素K所组成的群组。

依据本发明较佳的实施方式，是将去整合蛋白变异体涂覆于一植入式装置的表面，该植入式装置包含，但不限于，一支架及一导管。可选地，可将去整合蛋白变异体及抗凝血剂分别涂覆于一植入式装置的表面。

依据本发明实施方式，该个体是人类。

在参阅下文实施方式后，本领域技术人员当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。

附图说明

本发明至少包含一张彩色图示。任何人可于缴付一定费用后向主管机关申请取得附有彩色图示的本专利或其公开说明书。

图示为本发明的一部分，用以为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂。也可通过附图更了解本发明，附图说明如下：

图1A-1C依据本发明一实施方式以生理食盐水(控制组)、原矛头复素T/KRRR变异体(RR)或Ept在活体外(A)及离体(B-C)抑制胶原蛋白所诱发的血小板聚集反应(平均值±标准偏差，误差线，n＝8，相较于对照组，***P<0.001，以Dunnett's测试进行分析)。

图1D-1E依据本发明一实施方式比较RR及生理食盐水(对照组)抑制小鼠由FeCl₃所诱发的颈动脉血栓的功效。结果为小鼠经FeCl₃诱发产生颈动脉血栓(E)及其典型动脉血流图(D)。(平均值±标准偏差，误差线，相较于对照组，***P<0.001，以Dunnett's测试进行分析)。

图1F依据本发明一实施方式经FeCl₃处理的颈动脉的组织切片

图1G依据本发明一实施方式比较以生理食盐水(CTL)、原矛头复素T/KRRR变异体(RR)或依替巴肽处理小鼠尾巴出血时间的效果。各符号表示各小鼠的出血时间。(平均值±标准偏差，误差线，相较于对照组，***P<0.001，以Dunnett's测试进行分析；n.s，不显著)。

具体实施方式

为了使本发明的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，也可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

1.定义

以下为本发明所使用的部分词汇。除非另有所指，否则所有的技术及科学词汇具有与本领域技术人员所理解的相同含义。

在本发明中，是由肽的N端来编号肽中特定氨基酸的位置。除非本发明指出特定的异构物，否则在未标示氨基酸为D-或L-氨基酸时，该氨基酸可以是L-氨基酸，或可以是D-或L-氨基酸。“D-氨基酸”(D-amino acid)及“L-氨基酸”(L-amino acid)是指氨基酸的绝对构形，而非一平面偏光的特定旋转方向。本发明的用法与本领域技术人员的标准用法一致。本发明是使用标准单一字母码来指定氨基酸，例如工业产权信息和文件手册(Handbook OnIndustrial Property Information and Documentation)的标准ST.25所指定的单一字母码。

在不影响一蛋白/肽的生理活性的情况下，本发明及发明概念也包含该蛋白/肽的氨基酸序列的微小变异。举例来说，改变及/或删除某些氨基酸而不影响肽的生理活性(即治疗因血小板聚集所造成的疾病及/或病症的能力)。特别是，保留性氨基酸取代也包含于其中。保留性取代为具有相似/相关侧链的氨基酸间的相互取代。一般来说，由基因编码的氨基酸可分为四大类：(1)酸性氨基酸，即天门冬氨酸(aspartate)、谷氨酸(glutamate)；(2)碱性氨基酸，即赖氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)、组氨酸(histidine)；(3)非极性氨基酸，即丙氨酸(alanine)、缬氨酸(valine)、白氨酸(leucine)、异白氨酸(isoleucine)、脯氨酸(proline)、苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)、色氨酸(tryptophan)；以及(4)非带电极性氨基酸，即甘氨酸(glycine)、天门冬酰胺(asparagine)、谷氨酰胺(glutamine)、半胱氨酸(cysteine)、丝氨酸(serine)、苏氨酸(threonine)、酪氨酸(tyrosine)。较佳的分类是：丝氨酸及苏氨酸是属脂肪羟基(aliphatic-hydroxy)类；天冬酰胺酸及谷酰胺是属含酰胺(amide-containing)类；丙氨酸、缬氨酸、白氨酸及异白氨酸是属脂肪类；而苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸则属芳香(aromatic)类。举例来说，当可想见若以异白氨酸或缬氨酸取代白氨酸、以谷氨酸取代天门冬氨酸、以丝氨酸取代苏氨酸，或是以一结构相似的氨基酸取代另一氨基酸时，并不会造成分子结合或蛋白特性的显著改变，特别是当该取代位置不是位于骨架区域时，氨基酸之间的取代更不会影响上述特性。可通过检测肽衍生物的特定活性来了解一氨基酸的改变是否可形成一具功能性的肽。

“多肽”(polypeptide)及“蛋白”(protein)在本说明书为可互换的词汇，是指由天然且非重组细胞、基因工程或重组细胞，或是化学合成所制备的蛋白，且包含于天然序列中取代、删除及/或***一或多个氨基酸的分子。依据本发明的实施方式，去整合蛋白变异体为多肽或蛋白，其包含经修饰的TMV-7及经修饰的Rho，或是其片段，可用以抑制整合素αIIbβ3(integrinαIIbβ3)的活性。

“去整合蛋白”(disintegrin)一词是指一类由蛇毒纯化的蛋白，其结构上至少包含一连接子区域、一位于整合素结合域的挠性环顶部的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid，RGD)域，以及一C端。所有由蛇毒纯化的去整合蛋白可选择性地与纤维蛋白原受体(fibrinogen receptor)结合，例如αIIbβ3整合素，以抑制与纤维蛋白原相关的血小板聚集及其他由纤维蛋白原受体媒介的生物活性。去整合蛋白因此可阻断与纤维蛋白原相关的反应，并作为血小板聚集抑制剂。

“去整合蛋白变异体”(disintegrin variant)是指一功能活性蛋白、多肽或其衍生物，其包含一由野生型去整合蛋白(例如Rho或TMV-7)修饰或突变的氨基酸序列。依据本发明实施方式，一功能活性去整合蛋白变异体可专一地结合并抑制整合素αIIbβ3的活性。可以本领域技术人员所知的方法来建构本发明所述的去整合蛋白变异体，举例来说，位点突变(site-directed mutagenesis)或聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction,PCR)。相较于参照肽，变异体可包含***、加入、删除或取代。多肽序列的变异体包含生物活性多型变异体。

在本发明某些实施方式中，去整合蛋白变异体包含一经修饰的TMV-7蛋白，相较于天然TMV-7(或野生型TMV-7)，该经修饰的TMV-7包含至少一氨基酸取代、***至删除。在本发明其他实施方式中，去整合蛋白变异体包含一经修饰的Rho蛋白，相较于天然Rho(或野生型Rho)，该经修饰的Rho蛋白包含至少一氨基酸取代、***至删除。

“一连接子区域”(a linker region)一词是指去整合蛋白中紧邻于RGD环的N端的区域。举例来说，TMV-7的连接子区域包含序列编号：1(⁴¹KKKRT)的氨基酸序列，而Rho的连接子区域则包含序列编号：4(³⁹SRAGK)的氨基酸序列。依据本发明较佳的实施方式，去整合蛋白变异体包含一突变连接子区域，其于序列编号：1(⁴¹KKKRT)氨基酸序列的残基位置1到5中包含至少一突变。较佳地，去整合蛋白变异体包含一突变连接子，其包含序列编号：7、8或9的氨基酸序列。或者是，本发明的去整合蛋白变异体包含一TMV-7或Rho的天然连接子区域，而不是一突变连接子。

“RGD环”(RGD loop)一词是指一去整合蛋白的RGD域。举例来说，TMV-7的RGD环包含序列编号：2(⁵⁰ARGDNP)的氨基酸序列，而Rho的RGD环则包含序列编号：5(⁴⁸PRGDMP)的氨基酸序列。依据本发明某些实施方式，去整合蛋白变异体包含一源自TMV-7的突变RGD环，于其序列编号：2(⁵⁰ARGDNP)氨基酸序列的残基位置1到6中包含至少一突变；更佳地，去整合蛋白变异体包含一氨基酸序列，其是选自由序列编号：11、12、13、14、15、16、17、18、19及20所组成的群组。依据本发明其他实施方式，去整合蛋白变异体包含一源自Rho的突变RGD环，其于序列编号：5(⁴⁸PRGDMP)氨基酸序列的残基位置1到6中包含至少一突变；更佳地，去整合蛋白变异体包含序列编号：24或25的氨基酸序列。

“C端”(C-terminus)一词是指一去整合蛋白的C端的氨基酸序列。举例来说，TMV-7的C端包含序列编号：3(⁶⁷PRNGLYG)的氨基酸序列，而Rho的C端则包含序列编号：6(⁶⁵PRYH)的氨基酸序列。依据本发明某些实施方式，去整合蛋白变异体包含一源自TMV-7的突变C端，其于序列编号：3(⁶⁷PRNGLYG)氨基酸序列的残基位置1到7中包含至少一突变；更佳地，去整合蛋白变异体包含一氨基酸序列，其是选自由序列编号：6、21、22及23所组成的群组。或者是，去整合蛋白变异体包含TMV-7的一天然C端(即序列编号：3)或Rho的一天然C端(即序列编号：6)，而不是一突变C端。

依据本发明较佳的实施方式，本发明的去整合蛋白变异体包含一突变RGD。此外或可选地，本发明去整合蛋白变异体还包括一去整合蛋白的突变连接子及/或突变C端。

“IC₅₀”一词是指去整合蛋白或其变异体的浓度，其可抑制50％的生物反应，例如血小板聚集或细胞附着活性。

在本说明书中，“治疗”(treatment)一词是指获得一期望的医药及/或生理功效，例如，推迟或抑制血小板聚集及/或血小板活化。该效果可以是预防性的，即完全或部分预防一疾病或其病征；及/或是治疗性的，即部分或完全治愈一疾病及/或其所造成的不适。“治疗”(treatment)一词在本说明书包含预防、治疗或减缓一哺乳类动物(特别是人类)的疾病；该治疗包含：(1)预防、治疗或减缓一个体罹患一疾病或病症(例如与血小板聚集相关的疾病或病症)，其中该个体为罹患该疾病的高风险族群，或是已罹患该疾病而尚未确诊断定；(2)抑制一疾病(例如抑制其发生)；或(3)减轻一疾病(例如减轻与该疾病相关的征状)。

“施予”(administered,administering,or administration)一词在本说明书中是指传递的模式，包含但不限于静脉内、肌肉内、腹腔内、动脉内或皮下施予一药剂(例如，化合物或组合物)。在某些实施方式中，是将本发明的去整合蛋白变异体配制为使用前(例如，静脉注射前)可与适合载体(例如，缓冲溶液)混合的粉末。在其他实施方式中，是将本发明的去整合蛋白变异体直接应用或涂覆于血管外科手术使用的血管成形术支架(例如，一冠状动脉血管支架或一血管支架)或支架移植物上。

“有效量”(effective amount)一词在本说明书是指一种于特定时间内可产生治疗疾病的期望反应的使用量，其中该疾病是由血小板聚集所造成的疾病。举例来说，在治疗血栓疾病时，能减少、预防、延迟或抑制任何与血栓疾病相关的病征的药剂(即本发明去整合蛋白变异体)即为有效量的药剂。一药剂的有效量不必然能治愈一疾病或病症，却可治疗一疾病或病症，以延迟、防止或预防该疾病或病症的发生，或是减缓疾病或病症的征状。具体的有效量取决于多种因素，如欲治疗的特定状况、患者的生理条件(如，患者体重、年龄或性别)、接受治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、目前疗法(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。可将有效量表示成药物的总重量(譬如以克、毫克或微克为单位)或表示成药物重量与体重的比例(其单位为毫克/公斤(mg/kg))。有效量可配制为适合形式的进行1、2或多次施予的剂量，并于特定时间间隔进行1、2或多次施予。

“个体”(subject)或“病患”(patient)是指包含人类的动物，其可接受本发明的组合物及/或方法的治疗。除非特定指出单一性别，否则“个体”(subject)或“病患”(patient)同时意指雄性及雌性。因此，“个体”(subject)或“病患”(patient)包含任何可接受治疗的哺乳类动物。“个体”(subject)或“病患”(patient)包含，但不限于，人类、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、猪、羊、牛、马、狗、猫、鸟及家禽。在本发明实施例中，病患为人类。

“药学上可接受的”(pharmaceutically acceptable)一词是指当施予至一个体(例如一人类)后，不会产生不利或非预期反应(例如毒性或过敏反应)的分子及组合物。

“赋形剂”(excipient)及“载体”(carrier)在本发明为可互换的词汇，是指任何可形成一活物药剂的载体的惰性物质(例如粉末或液体)。赋形剂通常是安全、无毒性的物质，且就广义来说，可包含任何已知药学工业用于制备药学组合物的物质，例如填充剂、稀释剂、凝集物、接合剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、着色剂、润湿剂及崩解剂等。

虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％的内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本领域技术人员的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一段点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。

在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词(“a,”“an”or“the”)涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时也涵盖该名词的单数型。

2.较佳实施方式的详细说明

2.1去整合蛋白变异体

本发明至少部分是基因发明人意外发现源自TMV-7或Rho的去整合蛋白变异体可抑制或抑止血小板聚集，而不会影响生理止血。据此，本发明去整合蛋白变异体可作为一种潜力候选药剂，以研发可用以治疗因血小板聚集所造成的疾病、病状及/或病症的药物。

本发明因此包含去整合蛋白变异体、包含该去整合蛋白变异体的药学组合物、制备用以预防或治疗一个体或病患的血栓或由血栓造成的疾病的药物。本发明的研究结果显示，本发明去整合蛋白变异体可抑制血小板的聚集或活化，并抑制活体的血栓形成，而不会影响其出血时间。

本发明的第一方面是关于源自蛇毒(例如Rho及TMV-7)的去整合蛋白变异体，其分别可靶向整合素αIIbβ3。本发明是通过突变去整合蛋白的连接子区域、RGD环及/或C端中，至少一氨基酸残基来制备可与整合素αIIbβ3结合的去整合蛋白变异体。

因此，本发明的去整合蛋白变异体在结构上包含至少一源自TMV-7或Rho的突变RGD环。举例来说，本发明的去整合蛋白变异体可包含一突变RGD环，相对于天然RGD域(例如TMV-7的RGD域(⁵⁰ARGDNP，序列编号：2)及Rho的RGD域(⁴⁸PRGDMP，序列编号：5))，该突变RGD环的氨基酸序列包含至少一经取代及/或删除的氨基酸。例示性的该些变异体包含，但不限于，本发明所述的具有突变RGD环的变异体，其中该突变RGD环的氨基酸序列是选自由序列编号：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24及25所组成的群组。

附加地或可选地，本发明的去整合蛋白变异体可还包括去整合蛋白的一突变连接子及/或一突变C端。举例来说，除了上述突变RGD环的外，去整合蛋白变异体可包含一突变连接子，其中相较于天然连接子区域(例如TMV-7的连接子区域(⁴¹KKKRT，序列编号：1)及Rho的连接子区域(³⁹SRAGK，序列编号：4))，该突变连接子的氨基酸序列包含至少一经取代及/或删除的氨基酸。例示性的该些变异体包含，但不限于，该些具有上述突变RGD环及一突变连接子的变异体，其中该突变连接子的氨基酸序列是选自由序列编号：7、8及9所组成的群组。

在其他实施例中，除了上述突变RGD环的外，去整合蛋白变异体还包括一突变C端，其中相较于天然C端(例如TMV-7的C端(⁶⁷PRNGLYG，序列编号：3)及Rho的C端(⁶⁵PRYH，序列编号：6))，该突变C端的氨基酸序列包含至少一经取代及/或删除的氨基酸。例示性的该些变异体包含，但不限于，该些具有上述突变RGD环及一突变C端的变异体，其中该突变C端的氨基酸序列是选自由序列编号：21、22及23所组成的群组。

此外，在上述任一种变异体中，除了突变RGD环外，可包含特定去整合蛋白的一天然连接子区域(即序列编号：1或4)，及/或一天然C端(即序列编号：3或6)。

依据某些实施方式，本发明去整合蛋白变异体在结构上包含一序列编号：7的突变连接子，一序列编号：13或18的突变RGD环，以及一序列编号：3、21或22的C端。

依据其他实施方式，本发明去整合蛋白变异体在结构上包含一序列编号：8的突变连接子，一序列编号：14的突变RGD环，以及一序列编号：21的突变C端。

依据某些实施方式，本发明去整合蛋白变异体在结构上包含一序列编号：9的突变连接子，一序列编号：14或20的突变RGD环，以及一序列编号：3、21或22的C端。

依据其他实施方式，本发明去整合蛋白变异体在结构上包含一序列编号：4的突变连接子，一序列编号：24或25的突变RGD环，以及一序列编号：6的C端。

依据较佳的实施方式，本发明去整合蛋白变异体在结构上包含一序列编号：1的天然连接子，一氨基酸序列是选自序列编号：10到20所组成的群组的突变RGD环，以及一序列编号：21、22或23的突变C端。或者是，该些实施例的去整合蛋白变异体在结构上包含一序列编号：1的天然连接子，一氨基酸序列是选自由序列编号：10到20所组成的群组的突变RGD环，以及一序列编号：3的天然C端。较佳地，去整合蛋白变异体在结构上包含一序列编号：1的天然连接子，一具有序列编号：14的氨基酸序列的突变RGD环，以及一序列编号：21的突变C端。

依据其他实施方式，本发明去整合蛋白变异体在结构上包含一序列编号：4的天然连接子，一具有序列编号：24或25的氨基酸序列的突变RGD环，以及一序列编号：6的天然C端。

可利用任何本领域技术人员所知的方法来制备本发明的去整合蛋白变异体。举例来说，可利用位点突变来制备本发明的去整合蛋白变异体。或者是，可利用任何本领域技术人员所熟知的克隆及表达技术(利用将一核酸载体转入诸如大肠杆菌等宿主细胞，以及将宿主细胞培养于适于表达的环境，的后直接由培养液或宿主细胞收集表达的蛋白)来制备本发明的去整合蛋白变异体。可通过一经修饰的去整合蛋白核酸来编码表达本发明去整合蛋白变异体，其中该经修饰的去整合蛋白核酸可用以编码一经修饰的去整合蛋白，其氨基酸序列相较于天然序列，具有至少一经取代及/或删除的氨基酸残基。可修饰源自蛇毒的特定去整合蛋白的编码序列来制备去整合蛋白变异体的编码序列。例示性的本发明所述的去整合蛋白包含，但不限于，白唇竹叶青素、食鱼蝮素、墨西哥西海岸响尾蛇素、大具窍蝮蛇素、扁头腹蛇素、亚利桑那黑响尾蛇素、角响尾蛇素、西部菱背响尾蛇素、南美响尾蛇素、华刚蛇毒素、扁鼻蝮素、黄绿竹叶青蛇素、黄绿竹叶青抑制素、白眉蝮素、哈里氏蝮抑制素、美洲矛头蝮蛇素、美洲矛头蝮蛇抑制素、蝮蛇毒素、叶林腹素、大盆地响尾蛇素、黑尾响尾蛇素、马来亚蝮蛇毒蛋白、白眉蝮蛇素、哈里氏蝮素、大草原响尾蛇素、黄绿竹叶青蛇毒素、原矛头蝮素、原矛头蝮素酶、乌苏里蝮蛇素及霍皮响尾蛇。在某些较佳的实施方式中，本发明去整合蛋白变异体为TMV-7变异体。在其他实施方式中，本发明去整合蛋白变异体为Rho变异体。

或者是，可利用本领域技术人员所知的技术来化学合成去整合蛋白变异体，例如肽合成技术或固态合成。

可通过诸如硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换层析、亲和层析及凝集素层析等方法由重组细胞培养来收取或纯化本发明的去整合蛋白变异体。在某些实施方式中，是利高效液相层析(high performance liquid chromatography,HPLC)来进行纯化。

本发明去整合蛋白变异体可进一步与亲水性聚合物键合，以增加其水溶性或循环半衰期。适合与本发明去整合蛋白结合的水溶性聚合物包含，但不限于，聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸及聚乙烯醇等聚烷基醚；纤维素及其衍生物(例如聚葡萄醣或其衍生物)。较佳地，本发明去整合蛋白变异体还包括一PEG链，其具有2-20个EG重复单元且连接于该去整合蛋白变异体的N端。

2.2药学组合物

本发明的另一方面是关于药学组合物，其包含一有效量的任一种上述去整合蛋白变异体，以及一药学上可接受的载体。

一般来说，包含于药学组合物中的本发明去整合蛋白变异体的重量百分比(相对于药学组合物的总重量)为0.01％到99.9％。在某些实施方式中，本发明去整合蛋白变异体的重量百分比(相对于药学组合物的总重量)为0.1％。在某些实施方式中，本发明去整合蛋白变异体的重量百分比(相对于药学组合物的总重量)为5％。在其他实施方式中，本发明去整合蛋白变异体的重量百分比(相对于药学组合物的总重量)为10％。在某些实施方式中，本发明去整合蛋白变异体的重量百分比(相对于药学组合物的总重量)为25％。

在某些实施方式中，本发明药学组合物还包括一药剂(例如抗凝血药剂)，其可减缓或改善与血小板聚集造成的疾病及/或病症相关的病征。例示性的药剂包含，但不限于，醣蛋白IIb/IIIa拮抗剂(glycoprotein IIb/IIIa antagonist)、肝素(heparin)、组织胞浆素原活化物(tissue plasminogen activator)、Xa因子抑制剂(Factor Xa inhibitor)、凝血酶抑制剂(thrombin inhibitors)、磷酸二酯酶抑制剂(phosphodiesteras inhibitor)及环氧合酶抑制剂(cyclooxygenase inhibitor)等。适合的抗凝血剂可选自由阿昔单抗、阿哌沙班、阿司匹林、氯吡格雷、二吡待摩、依度沙班、依替巴肽、利伐沙班、替罗非班、噻氯匹啶、华法林及维生素K所组成的群组。

药学上可接受的赋形剂或载体可与制剂中其他成分兼容且为生物可接受的物质。

依据施予路径的不同，本发明药学组合物可还包括不同类型的赋形剂或载体。可通过静脉内、真皮内、动脉内、腹腔内、病灶内(intralesionally)、颅内(intracranially)、鼻腔内、胸腔内(intrapleurally)、气管内(intratracheally)、直肠内、局部性、肌肉内、皮下、血管内、心包内(intrapericardially)、眼内(intraocularally)、口腔内(orally)、部位性(locally)注射、吸入、输入、部位性灌注(localized perfusion)等方式施予本发明药学组合物，且可将其配制为粉末、乳剂、液体及喷雾剂等形式。

临床医护人员可依据个体的生理因素来决定药物或药学组合物的实际施予剂量，该些生理因素包含，但不限于年龄、性别、体重、疾病种类、疾病的严重程度、病史、是否使用其他药物及投药路径等。依据本发明非限定的实施例，每次施予单剂可产生每公斤体重0.01-100毫克的本发明去整合蛋白变异体。较佳地，每次施予单剂可产生每公斤体重0.1-50毫克的本发明去整合蛋白变异体。

可将包含本发明去整合蛋白变异体的药学组合物配制为适合口服使用的剂型，举例来说，片剂(tablets)、锭剂(lozenges)、水性或油性悬浮液(aqueous or oilysuspensions)、分散性粉末或颗粒(dispersible powders or granules)、乳剂(emulsions)、硬性或软性胶囊(hard or soft capsules)、糖浆(syrups)或酏剂(elixirs)。可依据任何本所属领域所熟知的配制药学组合物的方法来制备口服使用的组合物，制得的组合物可以包一或多种成份，其是选自由甜味剂(sweetening agents)、香味剂(flavoring agents)、着色剂(coloring agents)及提供药学上美观及可口的防腐剂(preserving agents)。片剂包含本发明去整合蛋白变异体及与本发明去整合蛋白变异体混合的非毒性且适合用以制备片剂的药学上可接受的赋形剂。举例来说，该些赋形剂可以是惰性稀释剂(inert diluents，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠)、造粒及崩解剂(granulating and disintegrating agents，例如玉米淀粉或海藻酸(alginic acid))、结合剂(binding agents，例如淀粉、明胶(gelatin)或***胶(acacia))及润滑剂(lubricating agents，例如硬脂酸镁(magnesium stearate)、硬酯酸(stearic acid)或滑石(talc))。

片剂可以是未涂覆的(uncoated)形式或利用已知技术涂覆的形式，以推迟片剂于胃肠道中的崩解及吸收，进而提供一长效性的作用。举例来说，可使用诸如甘油单硬脂酸酯(glyceryl monostearate)或甘油二硬脂酸酯(glyceryl distearate)等缓释材料。也可将其涂覆形成可控制释放的渗透型治疗片剂。

也可将口服使用的剂型配制为硬明胶胶囊(hard gelatin capsules)，其中是将活性成分与一惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土(kaolin))进行混合，或是配制为软明胶胶囊(hard gelatin capsules)，其中是将活性成分与一水混溶溶剂(water-miscible solvents，例如丙二醇(propylene glycol)、PEG及乙醇或包含花生油、液体石蜡及橄榄油等油性介质(oil medium))进行混合。

举例来说，一固体口服组合物(例如片剂或胶囊)可包含1到99％(重量/重量)的本发明去整合蛋白变异体；0到99％(重量/重量)的稀释剂或填充物(filler)；0到20％(重量/重量)的崩解剂；0到5％(重量/重量)的润滑剂；0到5％(重量/重量)的助流剂(flow aid)；0到50％(重量/重量)的造粒剂或结合剂；0到5％(重量/重量)的抗氧化剂(antioxidants)；及0到5％(重量/重量)的色素(pigment)。此外，一控制释放片剂也可包含0到90％(重量/重量)的控制释放聚合物。

当将本发明去整合蛋白变异体配制为适于静脉内、皮肤或皮下注射的形式时，可将多肽制备为无菌的非口服可接受的水溶液。本领域技术人员可知制备该种具有特定pH、等渗性及稳定性的非口服可接受的多肽溶液的方法。除了本发明去整合蛋白变异体，一较佳的用于静脉内、皮肤或皮下注射的药学组合物应包含一等张的载体，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖及氯化钠注射液、乳酸林格氏注射液或其他本发明所属技术领域中惯用的载体。本发明药学组合物也可包含稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂其他本发明所属技术领域中惯用的添加剂。可依据欲治疗疾病的严重程度及个体的生理状况与潜在的特异反应来调整本发明药学组合物的静脉内治疗的作用时间。当可理解，每次施予本发明去整合蛋白变异体的作用时间应介于持续静脉内施予的12到24小时之间。医疗人员最终将决定适合的静脉内治疗作用时间。

一非口服制备可包含1到50％(重量/重量)的本发明去整合蛋白变异体；以及50％(重量/重量)到99％(重量/重量)的液体或半固体载体(例如水等溶剂)；以及0-20％(重量/重量)的一或多其他赋形剂，例如缓冲剂、抗氧化剂、悬浮液稳定剂、张力调整剂及防腐剂。

也可将本发明去整合蛋白变异体配制为适用于局部性、全身性或部位性施予的生理上可接受的形式。举例来说，可将本发明去整合蛋白涂覆于一移植物或装置的表面。此外，可将组合物包覆或注射为一用以传递至部位组织损伤的黏性形式。如上所述，本发明组合物可可选地包含其他药剂，或是可选地与其他药剂同时或依序地施予至个体体内。

本发明去整合蛋白变异体也可制备为栓剂(suppositories)，并以直肠投药方法施予至个体体内。可将药物与一适合的非刺激性赋形剂混合以制备该些组合物，其中该非刺激性赋形剂于室温下为固体，于直肠温度下为液体，因此于直肠中会溶解并释放出药物。该些材料为可可脂(cocoa butter)及聚乙二醇。

为局部使用，可施予包含本发明去整合蛋白变异体乳液、软膏、凝胶、溶液或悬浮液等。就本申请而言，局部施予应包含口腔冲洗及漱口。局部制剂通常可由药物载体、共溶剂、乳化剂、穿透增强剂、防腐剂系统及润肤剂所组成。

2.3使用方法

本发明也提供一种用以治疗一罹患或可能罹患一因血小板聚集造成的疾病、病状及/或病症的个体的方法。该方法包含对一有治疗需要的个体施予本发明所述的药学组合物，其包含一有效量的本发明去整合蛋白变异体，以减缓或改善与血小板聚集造成的疾病、病状及/或病症相关的征状。

在某些实施方式中，本发明去整合蛋白变异体可抑制整合素αIIbβ3的活化，进而抑制血小板聚集。整合素αIIbβ3的活化会造成血小板聚集，特别是对罹患急性血管疾病的个体而言，其包含，但不限于，粥状动脉硬化血栓、深静脉血栓(deep vein thrombosis)、心肌梗塞、肺栓塞(pulmonary embolism)、周边动脉阻塞(peripheral arterialocclusion)、中风(stroke)、不稳定型绞痛症及其他血管系统栓塞。

在其他实施方式中，本发明药学组合物可抑制或抑止多种医疗程序中非预期的血小板聚集，例如抑制血管手术(例如血管成形术或支架放置)后的血小板聚集。

依据本发明某些实施方式，是以静脉内、皮下或口服方式对个体施予本发明药学组合物，以产生每公斤0.01-100毫克的本发明去整合蛋白变异体；较佳地，每公斤0.1-50毫克的本发明去整合蛋白变异体。

依据其他实施方式，是将包含本发明去整合蛋白变异体的药学组合物涂覆于一植入式装置(例如一支架或一导管)的表面，的后再将该植入式装置植入血管、尿道或其他难以进入的地方，以预防再狭窄、支持或强化血管或管壁。在这个部分，较佳是将本发明药学组合物配制为溶液或悬浮液的形式，其具有本发明去整合蛋白变异体均质分散于其中。较佳是依序快速涂覆复数层薄层，且较佳是涂覆至处于径向扩张状态的支架。可利用相对高蒸气压的蒸发溶剂材料浸渍或喷涂来进行涂覆，以产生预期的黏度及快速建立涂层的厚度。涂覆流程可使本发明去整合蛋白变异体附着贴合及覆盖支架或导管的开放结构的整个表面。

依据可选的实施方式，本发明去整合蛋白变异体可与一其他种抗凝血剂共同施予至个体体内，以治疗因血小板活化或聚集所造成的疾病、病状及/或病症。适合与本发明去整合蛋白变异体共同使用的抗凝血剂或血小板抑制剂为，举例来说，醣蛋白IIb/IIIa拮抗剂、肝素、组织胞浆素原活化物、Xa因子抑制剂、凝血酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂及环氧合酶抑制剂等。适合的抗凝血剂可选自由阿昔单抗、阿哌沙班、阿司匹林、氯吡格雷、二吡待摩、依度沙班、依替巴肽、利伐沙班、替罗非班、噻氯匹啶、华法林及维生素K所组成的群组。

下文提出多个实验例来说明本发明的某些方面，以利本领域技术人员实践本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。

实施例

材料及方法

表达及纯化去整合蛋白及其变异体

以先前公开文献(Guo et al.,Proteins.2001 43(4),499-508；Shiu et al.,Plos One.20127(1):e28833)所述方法利用毕氏效母菌(P.pastoris)表达去整合蛋白(即TMV-7及Rho)及其变异体。

纯化试剂盒及酵母菌转移载体pPICZαA是向Invitrogen公司购买的。利用重叠延伸聚合酶链锁反应(overlap extension PCR)以野生型构建体来制备突变株。以由Invitrogen购买的Pichia EasyComp试剂盒将构建体转形至毕氏酵母菌株X33中。

以先前公开文献(Guo et al.,Proteins.2001 43(4),499-508；Shiu et al.,Plos One.2012 7(1):e28833)所述方法来制备TMV-7及Rho及其变异体。依据以下流程来制备重组蛋白：将100微升培养于30℃、100毫升的酵母氮源培养液(yeast nitrogen base(YNB)medium，包含1％酵母萃取物、2％蛋白胨(peptone)、2％葡萄糖及每毫升100微克的吉欧霉素(Zeocin，博莱霉素))48小时的细胞原液加入900毫升的YNB培养液中。48小时后，离心细胞，并将其培养于1公升的最低甲醇培养液(minimal methanol medium，1.34％的包含无氨基酸的硫酸铵及4×10^-5％生物素的YNB)。共培养2天，其中每12小时加入一次甲醇(1％，重量/体积)，以诱发蛋白表达。

离心收集上清液后，以10公升水及5公升的结合缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0)进行透析。将透析溶液注入CaptoMMC管柱，再利用包含500mM的NaCl的洗提缓冲液洗提蛋白。以20-30％乙腈(acetonitrile)的浓度梯度进行C18逆相HPLC来纯化蛋白。经三羟甲胺基甘氨酸(tricine)-SDS-PAGE分析后，确认重组蛋白的纯度高于95％。

细胞附着试验

利用细胞附着试验来分析Rho、TMV及其变异体的抑制活性。以100微升的包含每毫升200微克纤维蛋白原或每毫升50微克纤维蛋白原的PBS缓冲液涂覆96孔洞微盘(Costar；Corning)，置于4℃至隔日。加入200微升的1％经热处理而变性的牛血清白蛋白(bovineserum albumin,BSA,Calbiochem)后置于室温反应1.5小时，以阻断非专一蛋白的结合位置。移除经热处理而变性的BSA，并以200微升的PBS洗涤二次。

从Dr.Y.Takada(Scripps Research Institute)取得会表达整合素αvβ3或αIIbβ3的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞(分别命名为CHO-αvβ3及CHO-αIIbβ3细胞)，将其培养于DMEM细胞培养液中。由ATCC购买人类红血球性白血病(erythroleukemia)K562细胞，并将其培养于包含10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI-1640细胞培养液中。将K562细胞重新悬浮于包含5％FBS的RPMI-1640细胞培养液中。分别将CHO及K562细胞稀释至每毫升3×10⁵及2.5×10⁵细胞后，取100微升的体积进行分析试验。

利用CHO-αIIbβ3细胞附着于纤维蛋白原、CHO-αvβ3细胞附着于纤维蛋白原，以及K562细胞附着于纤连蛋白(fibronectin)的试验来分析测试蛋白对整合素αIIbβ3、αvβ3及α5β1的抑制活性。将作为抑制剂的Rho突变体(0.001-500μM)加入细胞中，并于37℃的包含5％CO₂的环境中培养15分钟。将经处理的细胞加入经涂覆的细胞培养盘后，置于37℃(5％CO₂)反应1小时。移除反应溶液，并以200微升的PBS洗涤2次，以移除未附着的细胞。以100微升的10％***固定细胞10分钟后，干燥处理。将50微升的0.05％结晶紫溶液加入各孔洞，置于室温反应20分钟。以200微升的蒸馏水洗涤各孔洞4次后，干燥处理。加入显色溶液(150微升的50％乙醇及0.1％醋酸)。分析光波为600微米时的吸光值，其与附着细胞数量相关。以下述公式计算抑制百分比：抑制百分比＝100–[OD₆₀₀(经Rho及TMV蛋白处理的检体)/OD₆₀₀(未经处理的检体)]×100。由至少3次的独立试验来计算半最大抑制值(IC₅₀)。

制备人类血小板悬浮液(platelet suspension,PS)

由健康自愿个体收集细胞，该些个体在参与本研究前2周内皆未食用任何药物。由每位参与者取得同意书。本实验是经台湾大学附设医院同意后进行。依据先前公开文献(Huang et al.,Experimental haemtology.200836(12),1704-1713.)所述方法来制备人类PS。

计算安全指数

“安全指数”(Safety Index)是指去整合蛋白于AP2(一种抗αIIbβ3的抑制型mAb)存在时诱发血小板活化的浓度，以及于胶原蛋白诱发血小板聚集的IC₅₀的比例。

安全指数＝去整合蛋白活化血小板(加入每毫升4微克的AP2)的最低浓度/去整合蛋白于胶原蛋白诱发血小板聚集的IC₅₀。

动物

本研究是使用体重约为20-30公克的ICR公鼠。将动物饲养于具有充足饲料及饮用水的特定温度(20±1℃)及湿度(55％±5％)环境中。本研究动物实验流程皆经台湾大学医学院实验动物使用委员会的许可。

由FeCl₃所诱发的动脉血栓模式

对ICR公鼠腹腔注射戊巴比妥钠(每公斤50毫克)予以麻醉后，以解剖刀直接在右颈总动脉产生一切口，露出2毫米的颈动脉。将微型都卜勒血流探针置于动脉来监测血流。对小鼠静脉施予RR(每公斤0.125或0.25毫克)。5分钟后，以一吸附三氯化铁溶液(7.5％)的滤纸产生FeCl₃损伤。接触3分钟后，移除滤纸，持续监测颈动脉的血流直到血栓形成，或持续80分钟。

尾部出血时间

利用侧尾静脉方式对ICR公鼠注射药物。注射5分钟后，自尾巴远程切割一2毫米的锐利伤口。将切下的尾巴立即置于填充有37℃的等张生理食盐水的试管中。最长记录出血时间10分钟，终点即为止血时间。

统计分析

以平均值±标准偏差(mean±SEM)来表示各分析结果。以单向变异及Newman-Keuls多重比较测试来统计分析结果。当P值小于0.05(P<0.05)时，即视为具有显著差异。

实施例1克隆及分离去整合蛋白及其变异体

本实施例是依据“材料及方法”所述流程来克隆及分离TMV-7、Rho及其变异体。各变异体皆在天然蛋白(即TMV-7或Rho)的连接子区域、RGD区域或C端中包含至少一突变氨基酸残基。表1及2分别总结各变异体的突变序列。

表1 TMV-7及其变异体在连接子、RGD及C端区域的氨基酸序列

粗体指出突变或异于天然TMV-7的对应氨基酸残基的氨基酸残基。

表2 Rho及其变异体在连接子、RGD及C端区域的氨基酸序列

粗体代表突变或异于天然Rho的对应氨基酸残基的氨基酸残基。

实施例2实施例1的去整合蛋白及/或其变异体对血小板聚集的抑制功效

接着分析实施例1的去整合蛋白及其变异体对由αIIbβ3媒介的血小板聚集的抑制功效。简单来说，收集健康捐赠者的静脉血液样本后，分离富含血小板的血浆。之后将富含血小板的血浆与会引发栓塞形成的刺激物(例如胶原蛋白或AP2)反应，再加入实施例1的去整合蛋白及/或其变异体。表3总结该些结果。

如表3的数据所述，TMV-7变异体(结构上包含将天然C端序列(⁶⁷PRNGLYG)置换为⁶⁷PRNRLYG，将天然RGD环序列(⁵⁰ARGDNP)分别置换为⁵⁰AKGDWP(T/KW)、⁵⁰AKGDYP(T/KY)、⁵⁰AKGDHP(T/KH)及⁵⁰AKGDRP)具有较高的安全指数(各变异体的安全指数分别为8、9、12及26)；然而，当将RGD环序列(⁵⁰ARGDNP)置换为⁵⁰AKGDRR时，安全指数会剧烈增加至>1300，意即突变T/KRRR(即⁴¹KKKRT-⁵⁰AKGDRR-⁶⁷PRNRLYG)可作为一种用以研发抗凝血剂候选药物。

此外，该些结果也指出，TMV-7变异体(将天然C端序列(⁶⁷PRNGLYG)置换为⁶⁷PRNRLYG，以及将天然连接子区域序列(⁴¹KKKRT)置换为⁴¹IEEGT(T/IEEGR))具有较低的安全指数及抗血小板聚集活性，显示连接子区域需维持不变以保留其抗血小板聚集活性。

表3 实施例1的去整合蛋白及其变异体的抗血小板功能

粗体指出突变或异于天然Rho的对应氨基酸残基的氨基酸残基。“–”表示未检测。

实施例3TMV-7的T/KRRR突变及依替巴肽对血小板聚集与血栓形成的作用

通过检测胶原蛋白诱发的聚集反应、实验动物的尾巴出血时间及微血管血栓来探讨实施例1观察的TMV-7T/KRRR突变的抗血小板功能。结果分别阐述于图1。

与其他已知的抗血小板药剂-依替巴肽(一种由东南亚响尾蛇的蛇毒蛋白分离的环形七肽)比对分析TMV-7的T/KRRR突变对由胶原蛋白引发的血小板聚集的功效。结果显示，T/KRRR突变体及依替巴肽(图1的图B及C)皆可显著抑制由胶原蛋白所引发的血小板聚集，且其是以剂量相关的方式来抑制聚集反应，其中T/KRRR突变及依替巴肽的IC₅₀分别为每毫升0.25微克及每毫升0.75微克(图1的图A)。

此外，也利用颈动脉的栓塞时间来分析T/KRRR突变对由FeCl₃引发的血栓形成的影响。如图1的图D到F所述，未经处理的动物在FeCl₃损伤10分钟内即会产生动脉栓塞。相比之下，T/KRRR突变(每公斤0.125及0.25毫克)可预防FeCl₃损伤造成的栓塞，时间长达80分钟，甚至可于血栓形成后回复血流量。经T/KRRR突变处理的动物血管腔中的血栓体积也明显小于未经处理的动物血管腔中的血栓体积(图1的图F)。

在出血试验中，依替巴肽(每公斤0.18毫克)可显著延长出血时间，然而，静脉施予每公斤0.125毫克或更高浓度(即每公斤2.5毫克)的T/KRRR突变并不会延长出血时间。该结果指出，T/KRRR突变可有效抑制血小板聚集及血栓形成，而不会影响出血时间。

实施例4抑制整合素αIIbβ3、αvβ3及α5β1

本实施例将分析Rho、TMV-7及其变异体对抑制整合素αIIbβ3、αvβ3及α5β1与其配体结合的功效。结果分别阐述于表4。

如表4的结果所示，Rho及其R/KWN突变(⁴⁸ARGDWN-⁶⁵PRYH)在抑制会表达整合素αIIbβ3的CHO细胞附着到固定化纤维蛋白原时，IC₅₀数值分别为52.2±8.2及162.8±7.2nM。相比之下，Rho及其⁴⁸ARGDWN-⁶⁵PRYH突变在抑制会表达整合素αvβ3的CHO细胞结合至固定化纤维蛋白原时，IC₅₀数值分别为13.0±5.7及246.6±66.8nM。Rho及其R/KWN突变(⁴⁸ARGDWN-⁶⁵PRYH)在抑制整合素α5β1附着至固定化纤连蛋白时，IC₅₀数值则分别为256.8±87.5及8732.2±481.8nM。其于抑制整合素αIIbβ3、αvβ3及α5β1的差异分别为3.1-、19.0-及34.0-倍。该些结果指出，包含序列⁴⁸ARGDWN的Rho可选择性地与整合素αIIbβ3结合。TMV-7突变-T/KRRR突变(⁵⁰AKGDRR-⁶⁷PRNRLYG)在抑制会表达整合素αIIbβ3、αvβ3及α5β1的细胞结合至其配体时，具有较低的活性。相比之下，其于抑制血小板聚集时则具有较高的活性。

表4 Rho及其⁴⁸ARGDWN突变体，以及TMV-7的T/KRRR突变体抑制整合素αIIbβ3、αvβ3及α5β1

虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。

<110>台湾大学

庄伟哲

DCB-USA LLC

<120> 去整合蛋白变异体及其用途

<130> P3008-TW

<160> 25

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TMV-7_连接子区域

<400> 1

Lys Lys Lys Arg Thr

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TMV-7_RGD区域

<400> 2

Ala Arg Gly Asp Asn Pro

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TMV-7_C端

<400> 3

Pro Arg Asn Gly Leu Tyr Gly

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Rhodostomin_连接子区域

<400> 4

Ser Arg Ala Gly Lys

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Rhodostomin_RGD区域

<400> 5

Pro Arg Gly Asp Met Pro

1 5

<210> 6

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Rhodostomin_C端

<400> 6

Pro Arg Tyr His

1

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/IEEGKRR_连接子区域

<400> 7

Ile Glu Glu Gly Thr

1 5

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/AKRRR_连接子区域

<400> 8

Lys Lys Ala Arg Thr

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/MGKRRR_连接子区域

<400> 9

Met Lys Lys Gly Thr

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/KH_RGD区域

<400> 10

Ala Lys Gly Asp His Pro

1 5

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/KY_RGD区域

<400> 11

Ala Lys Gly Asp Tyr Pro

1 5

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/KWR_RGD区域

<400> 12

Ala Lys Gly Asp Trp Pro

1 5

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/KRR_RGD区域

<400> 13

Ala Lys Gly Asp Arg Pro

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/KRRR_RGD区域

<400> 14

Ala Lys Gly Asp Arg Arg

1 5

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/KRKR_RGD区域

<400> 15

Ala Lys Gly Asp Arg Lys

1 5

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/KKRR_RGD区域

<400> 16

Ala Lys Gly Asp Lys Arg

1 5

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/KKKR_RGD区域

<400> 17

Ala Lys Gly Asp Lys Lys

1 5

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/K_RGD区域

<400> 18

Ala Lys Gly Asp Asn Pro

1 5

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/KF_RGD区域

<400> 19

Ala Lys Gly Asp Phe Pro

1 5

<210> 20

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/KWN_RGD区域

<400> 20

Ala Lys Gly Asp Trp Asn

1 5

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/KHR_C端

<400> 21

Pro Arg Asn Arg Leu Tyr Gly

1 5

<210> 22

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/KS_C端

<400> 22

Pro Arg Asn Ser

1

<210> 23

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T/KRRFH_C端

<400> 23

Pro Arg Asn Arg Phe His

1 5

<210> 24

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> R/K_RGD区域

<400> 24

Pro Lys Gly Asp Met Pro

1 5

<210> 25

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> R/AWN_RGD区域

<400> 25

Ala Arg Gly Asp Trp Asn

1 5