阅读说明：本技术 一种林蛙油冻干粉抗衰老药理作用的研究方法 (Research method for anti-aging pharmacological effect of oviductus ranae freeze-dried powder ) 是由 张凤春 于 2020-06-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种林蛙油冻干粉抗衰老药理作用的研究方法,包括体重及力竭时间测试、对大鼠血清中一氧化氮、丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶及过氧化氢酶活力的影响和依据上述研究做出整体评估,该研究方法可从引起衰老的机理多方面对林蛙油冻干粉进行研究,形成系统的评价方法,对林蛙油冻干工艺的发展和冻干制品的推广具有重大意义。(The invention discloses a method for researching anti-aging pharmacological effects of oviductus ranae freeze-dried powder, which comprises the steps of testing body weight and exhaustion time, and carrying out overall evaluation on the influences of activities of nitric oxide, malondialdehyde, superoxide dismutase, glutathione reductase and catalase in rat serum according to the research.)

一种林蛙油冻干粉抗衰老药理作用的研究方法

技术领域

本发明涉及保健食品技术领域，特别涉及一种林蛙油冻干粉抗衰老药理作用的研究方法。

背景技术

林蛙，又称蛤什蟆，是我国著名的集药用、滋补和美容于一体的经济蛙种。林蛙油是雌林蛙怀卵成熟期的输卵管，它含有18种氨基酸、13种无机元素、9种维生素和多种复合多肽等生物活性因子，特别富含三种性激素，即***、睾酮、孕酮。其中***和睾酮分别是***和雄性激素中生理作用最强的激素，具有显著的滋阴强肾激发免疫功能和调节机理作用，此外，林蛙油还有良好的抗衰老作用，是日常生活中极佳的保健品之一。

直接从雌林蛙体内获得的林蛙油为干林蛙油，其属于油脂类物质不易被人体消化，同时也带有病毒或寄生虫卵以及浓烈的血腥味，不经过加工处理不能直接食用。现有林蛙油的加工处理方法一般是将林蛙油进行高温蒸煮(100℃)，达到除腥、除菌的目的。但是，长时间高温蒸煮使得林蛙油营养流失严重，其具有功效的活性物质被破坏，如不饱和脂肪酸、维生素E、维生素C以及***等，严重影响其功效。此外，高温蒸煮只能消除绝大部分腥味，制成的林蛙油成品仍然带有一丝腥味，同时高温蒸煮后的林蛙油也不够柔软，影响其口感。因此，越来越多的技术指向林蛙油冻干的研究，冻干工艺使林蛙油具有使用方便快捷的效果，但是针对冻干后的林蛙油是否会有功能上的影响，现有技术还研究较少，且缺少系统的研究方法对林蛙油冻干粉在抗衰老方面的药理作用研究，阻碍了林蛙油制品的发展进程和广泛推广。

因此，如何提供一种系统的林蛙油冻干粉抗衰老药理作用的研究方法是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种林蛙油冻干粉抗衰老药理作用的研究方法，以实验室常用的鼠类为研究对象，从对引起衰老的多方面机理进行研究，以达到可系统综合评价林蛙油抗衰老作用的效果。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种林蛙油冻干粉抗衰老药理作用的研究方法，包括以下步骤：

步骤一：体重及力竭时间测试

将实验用SD雄性大鼠并进行适应性饲养一周，淘汰不适应运动的大鼠后将剩余大鼠等数分为若干组，设置静止对照组、运动对照组、实验组和对照组并进行相应的处理，处理过程中每周记录体重，连续处理30d，于末次给药60min后进行负重5％游泳力竭实验，使大鼠游泳至力竭，记录力竭时的游泳时间；

步骤二：对大鼠血清中一氧化氮、丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶及过氧化氢酶活力的影响

在力竭测试后24h称重，麻醉后腹主动脉取血，4℃、3000r/min离心分离得到血清，测定一氧化氮、丙二醛含量和超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶及过氧化氢酶活力；

步骤三：依据步骤一到步骤三所测定数据结果综合评估。

进一步的，所述步骤一中的静止对照组处理为生理盐水灌胃1mL/d，末次处理后不进行力竭实验。

进一步的，所述步骤一中的运动对照组处理为生理盐水灌胃1mL/d，末次处理后进行力竭实验。

进一步的，所述步骤一中的实验组的处理为林蛙油冻干粉混悬液灌胃，末次处理后进行力竭实验。

进一步的，所述实验组包括三个及以上不同剂量给药组。

进一步的，所述步骤一中的对照组的处理为现有技术中抗衰老保健品灌胃，末次处理后进行力竭实验。

进一步的，所述力竭实验中的力竭标准以大鼠下沉后10s不露出水面为度，记录力竭时的游泳时间。

经由上述技术方案，与现有技术相比，本发明提供了一种林蛙油冻干粉抗衰老药理作用的研究方法，可从引起衰老的多方面因素对林蛙油冻干粉进行研究，形成系统的评价方法，对林蛙油冻干工艺的发展和推广具有重大意义。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验材料

1.受试药物

名称 林蛙油冻干粉

提供单位 黑龙江四宝生物科技股份有限公司

批号 20171101

含量 符合要求

理化性质 本品为淡黄色粉末。

2.试验动物

品系 SD品系大鼠。

来源 青岛市实验动物和动物实验中心提供，合格证号为SCXK(鲁)20140001。

体重 见各项试验。

性别 雄性。

动物数 见各项试验。

3.主要药品及试剂

药品名称	生产厂家	批号
			林蛙油冻干粉	黑龙江四宝生物科技股份有限公司	20171101
75％乙醇	山东利尔康医疗科技股份有限公司	171129D1
			生理盐水	哈尔滨三联药业股份有限公司	171004D5
MDA试剂盒	美国R&DSystems公司	ELA05990
			SOD试剂盒	美国R&DSystems公司	ELA05990
CAT试剂盒	美国R&DSystems公司	ELA05990
			尿素氮试剂盒	南京建成生物工程研究所	C013-2
CAT试剂盒	南京建成生物工程研究所	A007-1-1
			MDA试剂盒	南京建成生物工程研究所	A003-1
NO试剂盒	南京建成生物工程研究所	A013-2
			SOD试剂盒	南京建成生物工程研究所	A001-3
GR试剂盒	南京建成生物工程研究所	A062

4.主要仪器

101A-1E型电热鼓风干燥箱	上海实验仪器有限公司
		FA2004分析电子天平	上海良平仪器仪表
倒置显微镜	日本Olympus公司
		VICTOR X3酶标仪	PerkinElmer公司
TDL-4型低速台式离心机	上海安享科学仪器厂
		108mL手动组织匀浆器	天津玻璃仪器厂
H2050R型台式高速冷冻离心机	湖南湘仪实验室仪器开发有限公司

(1)体重及力竭时间测试

取雄性SD雄性大鼠70只，体重0.18±0.02kg，在整个实验过程中，实验室内温度保持在22±2℃，相对湿度55～75％，光照时间随自然变化。所有实验大鼠均以基础饲料和蒸馏水常规饲养，自由饮食。实验时间为34d，正式给药时间为30d。实验大鼠适应性饲养一周后，以20min的运动量对其进行筛选，淘汰不适应游泳训练的大鼠，将剩余56只大鼠随机分组法分为7组，①静止对照组(生理盐水灌胃1mL/d)；②运动对照组(生理盐水灌胃1mL/d)；③LWY-冻干粉低剂量干预组(0.05g/kg林蛙油冻干粉混悬液)；④LWY-冻干粉中剂量干预组(0.10g/kg林蛙油冻干粉混悬液)；⑤LWY-冻干粉高剂量干预组(0.20g/kg林蛙油冻干粉混悬液)；⑥LWY组(0.10g/kg林蛙油混悬液)；⑦汤臣倍健组(0.30g/kg汤臣倍健雄赳赳益康胶囊)各组每天自由摄食饮水，每天灌胃给药1次。每周进行称重，记录各大鼠体重。于末次给药60min后进行负重5％游泳力竭实验，均采用100cm×50cm×60cm的玻璃泳槽作为大鼠游泳训练装置，水深50cm。水温31±2℃，为防止大鼠在水面漂浮不动，特在游泳箱底部放置佳宝“AP1500”型水泵形成流动水，使大鼠游泳至力竭。(大鼠开始游泳至力竭所用时间为力竭运动时间，力竭标准以大鼠下沉后10s不露出水面为度，记录力竭时的游泳时间。)t检验统计学处理，结果见表1。

表1林蛙油冻干粉对大鼠体重及力竭时间的影响(n＝8)

注:与正常组对比^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001，与模型组对比^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，与LWY组对比^〇P<0.05，^〇〇P<0.01，^〇〇〇P<0.001。

体重的变化和力竭时间可以反映训练对机体的影响及机体对训练的适应状况。

结果表明：体重：游泳对照组与静止对照组相比，游泳对照组的体重与静止对照组的差别不大。LWY-冻干粉各给药组与游泳对照组相比，体重升高，且具有极显著性(P<0.001)。说明林蛙油冻干粉可以使大鼠体重增加。且在相同剂量下林蛙油冻干粉与林蛙原油组相比，并无显著性差异。

力竭时间：LWY-冻干粉各给药组与游泳对照组相比，力竭时间延长，且具有极显著性(P<0.001)。说明林蛙油冻干粉可以增加大鼠的力竭时间，具有一定抗衰老的作用。且在相同剂量下林蛙油冻干粉与林蛙原油组相比，并无显著性差异。

(2)对大鼠血清中NO、MDA、SOD、GR、CAT活力的影响

按上述实验方法，在力竭测试后24h后称重，水合氯醛适度麻醉，从腹主动脉处取血，4℃，3000r/min离心，分离制备血清，严格按照试剂盒说明书测定一氧化氮(NO)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase，GR)及过氧化氢酶(Catalase，CAT)活力。t检验统计学处理，结果见表2。

表2林蛙油冻干粉对大鼠血清中NO、MDA、SOD、GR、CAT活力的影响(n＝8)

注:与静止对照组对比^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001，与运动对照组对比^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，与LWY组对比^〇P<0.05，^〇〇P<0.01，^〇〇〇P<0.001。

一氧化氮(NO)携带一个未配对电子，在体内极不稳定，这一特性恰好和其它游离自由基一样。这样两者就非常容易结合产生反应。从而使体内自由基数量大大减少。衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联，NO含量的降低可以起到抗氧化的作用。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是氧自由基氧化细胞膜上磷脂形成的脂质过氧化物的稳定存在形式，可反应机体内脂质过氧化程度。它的产生还能加剧膜的损伤。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。为人体不断地补充SOD，具有抗衰老的特殊效果。谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase，GR)是催化机体内氧化型谷胱甘肽还原成谷胱甘肽，谷胱甘肽能和氧自由基结合，清除机体内部的氧合自由基，以减少自由基对机体的损害。过氧化氢酶(Catalase，CAT)存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不至于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH，对机体具有保护作用。

结果表明：NO：运动对照组与静止对照组相比，NO含量升高，且具有极显著性差异(P<0.001)。LWY-各给药组与运动对照组相比，NO含量降低且具有极显著性差异(P<0.001)。说明林蛙油冻干粉可以降低大鼠的NO含量，具良好抗氧化的作用。且在相同剂量下林蛙油冻干粉与林蛙原油组相比，并无显著性差异。

MDA：运动对照组与静止对照组相比，MDA含量升高，具有极显著性差异(P<0.001)。LWY-各给药组与运动对照组比较MDA含量降低，具有极显著性差异(P<0.01或P<0.001)；说明林蛙油冻干粉可以降低大鼠MDA的含量，具有抗氧化的作用。且在相同剂量下林蛙油冻干粉与林蛙原油组相比，并无显著性差异。

SOD：模型组与正常对照组相比，SOD含量降低，具有极显著性差异(P<0.001)。LWY-各给药组与模型组比较，SOD含量升高，且具有极显著性差异(P<0.001)，说明林蛙油冻干粉可以使大鼠SOD活力升高，具有抗氧化的作用。且在相同剂量下林蛙油冻干粉与林蛙原油组相比，干预组的增强作用更加明显(P<0.05)。

GR：运动对照组与静止对照组相比，含量降低，且具有极显著性差异(P<0.001)。LWY-冻干粉各给药组的GR含量均高于运动对照组，且具有极显著性(P<0.001)，说明林蛙油冻干粉可以使大鼠GR活力升高，具有抗氧化的作用。且在相同剂量下林蛙油冻干粉与林蛙原油组相比，并无显著性差异。

CAT：运动对照组与静止对照组相比，运动对照组CAT含量降低，且具有极显著性差异(P<0.001)。LWY-冻干粉各给药组和运动对照组比较CAT含量明显升高，具有极显著性差异(P<0.001)；说明林蛙油冻干粉可以使大鼠CAT活力升高，具有抗衰老的作用。且在相同剂量下林蛙油冻干粉与林蛙原油组相比，并无显著性差异。。

通过上述的分步骤系统评估可以发现，林蛙油冻干粉相较于林蛙油普通制品和其余对应功能的药物组分，均具有更好的效果，因此，上述评估方法对林蛙油冻干粉的在抗衰老作用方面做出了整体评价，具有较高的试剂参考意义。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。