阅读说明：本技术 乏氧响应性阳离子聚合物及其制备方法与应用 (Hypoxic responsive cationic polymer and preparation method and application thereof ) 是由 殷黎晨 李旭东 于 2020-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了乏氧响应性阳离子聚合物及其制备方法与应用,以4,4’-二羧基偶氮苯和聚乙烯亚胺制备为原料,反应制备乏氧响应性阳离子聚合物；乏氧响应性阳离子聚合物与核酸复合得到纳米药物,或乏氧响应性阳离子聚合物与阴离子聚合物、蛋白复合得到纳米药物。本发明聚合物不仅可以作为核酸载体提供良好的稳定性、乏氧敏感性和生物相容性,并且能够结合负电性材料作为纳米载体用于基因和蛋白的肿瘤靶向递送。(The invention discloses an anaerobic responsive cationic polymer and a preparation method and application thereof, wherein 4,4' -dicarboxy azobenzene and polyethyleneimine are prepared as raw materials and are reacted to prepare the anaerobic responsive cationic polymer; the hypoxic responsive cationic polymer is compounded with nucleic acid to obtain the nano-drug, or the hypoxic responsive cationic polymer is compounded with anionic polymer and protein to obtain the nano-drug. The polymer not only can be used as a nucleic acid carrier to provide good stability, hypoxic sensitivity and biocompatibility, but also can be combined with electronegative materials to be used as a nano carrier for tumor targeted delivery of genes and proteins.)

乏氧响应性阳离子聚合物及其制备方法与应用

技术领域

本申请涉及基因蛋白负载和递送领域，具体涉及具有高效基因递送能力的乏氧响应性阳离子递送材料及其制备方法与应用，可应用于肿瘤治疗领域。

背景技术

在癌细胞的生长过程中，营养和氧气会被细胞的增殖过程迅速消耗，而新的血管尚未及时形成，内部组织结构中又存在暂时性的阻断，都导致了肿瘤内灌流不足和暂时的乏氧。作为肿瘤微环境的重要特征之一，乏氧参与了肿瘤相关细胞的生长，侵袭和转移过程，并且对乏氧靶向药物在内肿瘤治疗产生了深远影响，其中生物还原的化学官能团（如硝基咪唑，醌和偶氮苯衍生物）也得到了越来越多的尝试和探索。

尽管存在乏氧激活策略具可以将药物递送至肿瘤部位，但由于肿瘤乏氧的异质性以及基因递送的难度，目前仍无法实现较高程度的肿瘤乏氧基因递送的选择性和实时的释放水平。而在肿瘤基因递送的过程中，聚乙烯亚胺是一类研究最为广泛的阳离子材料。大分子量阳离子虽然可以有效地携带核酸或蛋白用作递送载体，但同时会不可避免地引起较强的细胞毒性。

发明内容

本发明提供了一种由偶氮苯键连接、乏氧响应的阳离子递送载体材料，该聚合物不仅可以作为核酸载体提供良好的稳定性、乏氧敏感性和生物相容性，并且能够结合负电性材料作为纳米载体用于基因和蛋白的肿瘤靶向递送。

本发明采取如下技术方案：

一种乏氧响应性阳离子聚合物，具有如下所示的化学结构：

式中：n为5～8，r为1～200，m为1～200，r+m为15～200。

本发明提供了上述乏氧响应性阳离子聚合物的制备方法，以4,4'-二羧基偶氮苯和聚乙烯亚胺制备为原料，反应制备乏氧响应性阳离子聚合物；具体的，将4,4'-二羧基偶氮苯、聚乙烯亚胺、脱水剂和催化剂按摩尔比1∶（1～4）∶5∶3.6溶于有机溶剂二甲基亚砜，室温反应45～50小时，得到乏氧响应性阳离子聚合物；优选以4-硝基苯甲酸和还原剂为原料制备4,4'-二羧基偶氮苯。

优选的，所述聚乙烯亚胺选自重均分子量为的600～25000，比如600、1800、1000和25000的聚乙烯亚胺。

优选的，所述脱水剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或N,N'-二环己基碳二亚胺。

优选的，所述催化剂N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基硫代琥珀酰亚胺。

本发明公开了纳米药物的制备方法，包括以下步骤：以4,4'-二羧基偶氮苯和聚乙烯亚胺制备为原料，反应制备乏氧响应性阳离子聚合物；所述乏氧响应性阳离子聚合物与核酸复合得到纳米药物，或所述乏氧响应性阳离子聚合物与阴离子聚合物、蛋白复合得到纳米药物；具体的，对于二元复合物，将乏氧响应性阳离子聚合物溶解于去离子水中，再加入核酸溶液，然后37 ^oC孵育，得到纳米药物；对于三元复合物，将乏氧响应性阳离子聚合物、阴离子聚合物分别溶解于去离子水中，蛋白溶液先与阴离子溶液混合，再加入乏氧响应性阳离子聚合物，然后37 ^oC孵育，最终得到纳米药物。

具体的，本发明乏氧响应性阳离子聚合物的制备方法如下：

（1）以4-硝基苯甲酸、葡萄糖和氢氧化钠为原料，反应制备4,4'-二羧基偶氮苯；

（2）以4,4'-二羧基偶氮苯和聚乙烯亚胺为原料，反应制备乏氧响应性的阳离子聚合物。

步骤（1）反应中，所述反应溶剂为水，50 ^oC下反应18小时，反应在氧气存在的条件下进行，所得的粗产物通过盐酸酸化；所述4,4'-二羧基偶氮苯的化学结构式为：

上述具体反应可表示如下：

本发明中，所述核酸选自小分子干扰RNA（siRNA）、DNA。

本发明中，所述蛋白选自核糖核酸酶A、葡萄糖氧化酶等治疗性蛋白。

本发明中，所述乏氧响应性阳离子聚合物与核酸的质量比为（0.5-4）∶1，优选的质量比为（1-2）∶1。

本发明中，所述乏氧响应性阳离子聚合物与阴离子聚合物的质量比为（0.5-8）∶1，优选的质量比为（1-4）∶1。

本发明公开了乏氧响应性的阳离子聚合物在制备药物载体中的应用或者在制备纳米药物中的应用；或者上述纳米药物在制备基因以及蛋白药物中的应用。

本发明的优势在于，该阳离子聚合物具有丰富的正电荷，一方面能够很好的复合核酸药物形成稳定的纳米复合物，在乏氧条件下，实现聚合物降解，从而降低材料毒性，并显著提高转染效率。另一方面，通过结合阴离子聚合物以及蛋白药物形成纳米复合物，提升载体对蛋白药物的递送效率。

附图说明

图1为实施例一中4,4'-二羧基偶氮苯的核磁图谱。

图2为实施例二中乏氧响应性阳离子聚合物的核磁图谱。

图3为实施例三中乏氧处理前后AO阳离子聚合物的紫外吸收图。

图4为实施例三中乏氧处理前后MALDI-TOF测定分子量（MW）图。

图5为实施例四中乏氧处理前后AO与BO对siRNA包载能力的琼脂糖凝胶电泳图。

图6为实施例四在不同比例下siRNA与AO形成纳米复合物的粒径和电势图。

图7为实施例四中常氧和乏氧下AO/siXIAP复合物在Skov-3细胞中mRNA XIAP表达水平图。

图8为实施例四中常氧和乏氧下AO在Skov-3细胞中的毒性测试图。

图9为实施例五中不同比例下HA与AO形成纳米复合物的粒径和电势图。

图10为实施例五乏氧处理前后HAG纳米复合物中GOx的蛋白累计释放图。

图11为实施例五HAG纳米复合物在HeLa细胞中的摄取含量图。

图12为实施例五中常氧和乏氧下HAG和HBG纳米复合物在HeLa细胞中的毒性水平测试图。

图13为实施例五中HAG纳米复合物在HeLa细胞中H₂O₂的产生浓度图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

实施例中：

聚乙烯亚胺、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-硝基苯甲酸、联苯二甲酸等购买于阿拉丁试剂。

所有使用玻璃仪器购买于欣维尔。

分析天平购买于Sartorius（型号：BSA224S）。

离心机购买于Thermo SCIENTIFIC（型号：MULTIFUGE X1R）。

磁力搅拌器购买于IKA（型号：RH digital）。

旋转蒸发仪购买于IKA（型号：RV10）。

PrimeScript RT kit以及 SYBR Premix Ex Taq kit 购买于宝日医（北京，中国）。

XIAP siRNA (siXIAP), 阴性对照siRNA (siNC)购买于吉玛基因（上海，中国）。

常氧由湿润的O₂（20%）、CO₂（5%）和N₂混合气氛组成，而乏氧由湿润的O₂（1%）、CO₂（5%）和N₂混合气氛组成；具体为本领域常规测试条件。

乏氧处理条件：乏氧下，将HEPES缓冲液（含大鼠肝微粒体（0.5 mg/mL）和NADPH（100 μM））与材料孵育12小时。

实施例一

将4-硝基苯甲酸（10.0 g，59.9 mmol）和水（50 mL）添加到三颈圆底烧瓶中，之后加入氢氧化钠溶液（5.6 M，100 mL），加热至50^oC，然后加入葡萄糖水溶液（1.7 M，200 mL），并持续向溶液中通入空气，溶液开始会产生橙色沉淀，之后颜色逐渐变为棕色。50 ^oC下反应18小时，过滤获得粗产物。粗产物重新溶于水（300 mL），盐酸（1 M）酸化，析出橙色沉淀。再次过滤，固体用水（100 mL × 5）洗涤，60^oC下干燥，获得橙色固体状4,4'-二羧基偶氮苯（4.26g，产率 43%），氘代二甲基亚砜打核磁，附图1为其核磁谱图。

实施例二

将4,4'-二羧基偶氮苯（50 mg，0.19 mmol）溶解于二甲基亚砜（3 mL）中，之后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（210 mg，1.10 mmol）与N-羟基琥珀酰亚胺（80mg，0.70 mmol）。在室温下搅拌4小时后，滴加含分子量为600的聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液（0.37 M，1 mL）。避光反应24小时，去离子水（MWCO ＝ 3.5 kDa）透析2天，-80℃冻干获得橙色泡沫状的阳离子聚合物（AO），氘代重水打核磁，附图2为其核磁谱图。

上述具体反应可表示如下：

在上述方法的基础上，聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液更换为0.5 mL，其余不变，得到的阳离子聚合物不具水溶性，将其加入去离子水配置浓度为1 mg/mL溶液时，呈现浑浊液，加入10倍去离子水，依然为浑浊液。

对比例一

将联苯二甲酸（46 mg，0.19 mmol）溶解于二甲基亚砜（3 mL）中，之后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（210 mg，1.10 mmol）与N-羟基琥珀酰亚胺（80 mg，0.70mmol）。在室温下搅拌4小时后，滴加含分子量为600的聚乙烯亚胺的二甲基亚砜溶液（0.37M，1 mL）。避光反应24小时，去离子水（MWCO ＝ 3.5 kDa）透析2天，冻干获得白色泡沫状的联苯阳离子聚合物（BO）：

实施例三

在乏氧条件下，将HEPES缓冲液（含大鼠肝微粒体（0.5 mg/mL）和NADPH（100 μM））与材料孵育12小时，评估阳离子材料的乏氧响应性。用UV-Vis分光光度计（LAMBDA 750，PerkinElmer，美国）测量阳离子材料在乏氧或常氧条件下的紫外吸收光谱，并通过MALDI-TOF确定乏氧处理前后聚合物MW的变化。

图3为乏氧处理前后的UV图，利用图得出，阳离子聚合物中450 nm偶氮苯的吸收峰在处理后消失，证明了AO的乏氧敏感性。

图4为乏氧处理前后MALDI-TOF测定出的分子量（MW）变化图，数据分析得出，聚乙烯亚胺的MW由665增加至AO的4382 Da；乏氧处理后，AO的MW也相应减少到785 Da，表明乏氧响应性阳离子聚合物AO的成功合成。

实施例四 siRNA纳米药物的制备、表征以及性能

将实施例二的乏氧响应性阳离子聚合物溶于去离子水配置浓度为1 mg/mL的溶液（澄清溶液），配置XIAP siRNA（siXIAP，购自吉玛基因（上海，中国））浓度为0.1 mg/mL的DEPC水溶液；然后将siRNA和乏氧响应性阳离子聚合物以不同质量比（1/0.25、1/0.5、1/1、1/2、1/4、1/6）混合，将混合物涡旋10s，然后在37^oC下孵育30分钟，形成乏氧响应性阳离子聚合物/siRNA复合物纳米药物。上样3%琼脂糖凝胶电泳上样孔内，100V下运行40 分钟，溴化乙锭显示，凝胶成像系统成像，测定siRNA的包载效率。以BO替换AO同时进行平行实验对比。

将siRNA和乏氧响应性偶氮苯阳离子聚合物按不同质量比（1/0.25、1/0.5、1/1、1/2、1/4、1/6）混合，将混合物涡旋10s，然后在37^oC下孵育30分钟，形成偶氮苯阳离子聚合物/siRNA复合物。使用大鼠肝微粒体（0.5 mg/mL）和NADPH（100 μM），处理偶氮苯阳离子聚合物/siRNA复合物12小时，通过凝胶电泳分析评估乏氧处理前后偶氮苯阳离子聚合物对siRNA包载能力的变化。

利用动态光散射（DLS）评估偶氮苯阳离子聚合物/siRNA在不同质量比混合下的复合物粒径和电位。

Skov-3细胞以5 × 10⁵细胞/孔的密度接种在6孔板上，培养24小时。培养基换成无血清DMEM，分别加入BO/siXIAP和AO/siXIAP（w/w = 1/1）二元复合物（2 μg siXIAP/孔）。在37 ^oC，乏氧或常氧条件下孵育6小时，培养基换成含10% FBS的DMEM，继续培养24小时。从细胞中分离总RNA，使用cDNA反转录试剂盒合成cDNA，通过实时PCR确定XIAP的基因沉默水平。未经处理的细胞用作对照，以评估乏氧条件下XIAP的基因沉默效率。

Skov-3细胞以1 × 10⁴细胞/孔的量接种在96孔板上，培养24小时。加入不同浓度的偶氮苯阳离子聚合物，孵育6小时。细胞换液，乏氧或常氧条件下继续培养72小时，MTT测定法检测细胞毒性。

图5为乏氧处理前后比较AO与BO对siRNA包载能力的琼脂糖凝胶电泳图。由于氨基的正电荷密度和偶氮苯的疏水性，质量比为1时，阳离子聚合物AO表现出优异的核酸包载能力。乏氧处理后，AO促进释放siRNA，而BO在处理前后并没有包载能力的改变，表明乏氧下偶氮苯键的断裂，导致阳离子聚合物降解，促进基因释放。

图6为不同比例下siRNA与AO形成纳米复合物的粒径和电势图。质量比为1时，siRNA与偶氮苯阳离子聚合物就可形成100 nm左右的稳定粒径，电势也一直维持在约30mV，证明阳离子材料对核酸具有良好包载的能力。

图7为乏氧条件下检测阳离子聚合物AO是否具有促进siXIAP释放并降低XIAP基因水平图。与AO/siXIAP复合物孵育后，XIAP mRNA表达降低约50%。乏氧条件下，处理细胞6小时后，AO/siXIAP复合物可实现额外20-30%基因水平的下降。而对照组在处理前后没有任何变化，表明乏氧诱导偶氮苯聚合物的降解，促使siXIAP在细胞内发挥作用，这与现有技术在胞外断裂不同。

图8为常氧与乏氧条件下AO在HeLa细胞中的毒性水平图。常氧下，与细胞孵育48小时后，AO显示出较强的浓度依赖和细胞毒性。而AO乏氧条件下的最高浓度（35 μg/mL），其细胞存活率仍高于90%，毒性显著降低。

实施例五 蛋白纳米药物的制备、表征以及性能

实施例二的水溶性偶氮苯阳离子聚合物AO（1 mg/mL），透明质酸HA（5 mg/mL）分别溶于去离子水中。将AO与HA按不同质量比（1/0.5、1/1、1/2、1/4、1/8）混合，将混合物涡旋10 s，然后在37 ^oC下孵育30 分钟，形成HA/AO复合物。利用动态光散射（DLS）评估HA/AO在不同质量比混合下，复合物粒径和电位。

之后葡萄糖氧化酶GOx（0.1 mg/mL）溶于去离子水中，将HA加入到GOx的溶液中（HA/GOx = 80/1），涡旋10秒钟，37 ^oC下孵育10分钟。之后，AO加入到混合物中（AO/HA = 2/1），室温下继续孵育1小时，形成HA/AO/GOx蛋白纳米复合物（HAG NCs）。同样的方法，将GOx替换为FITC荧光标记的GOx（FITC-GOx），制得包载FITC-GOx的HAG NCs。

将包载FITC-GOx的HAG NCs（200 μL）置于透析袋（MWCO = 10 kDa）内，在37 ^oC的条件下，PBS溶液（pH 7.4，30 mL）或Na₂S₂O₄的PBS溶液（155 mM）中孵育，研究FITC-GOx的释放行为。在预定的时间间隔，收集释放介质（1 mL），并通过荧光分光光度法（λ_ex = 490 nm，λ_em = 525 nm）对GOx的浓度进行定量，计算累积药物释放量。用新鲜的PBS（1 mL）补充透析袋外溶液，保持其体积恒定。

为了测定HAG NCs中GOx的催化能力，在连续供氧的条件下，将HAG NCs或游离GOx（10 μg/mL）与不同浓度的葡萄糖溶液进行孵育。在不同时间点收集溶液，同时使用ROS检测试剂盒（碧云天，中国）检测H₂O₂浓度。将HAG NCs或GOx（10 μg/mL）直接与固定浓度的葡萄糖溶液（1 mg/mL）混合，使用pH计测量溶液的实时pH值变化。为了进一步研究乏氧诱导纳米复合物释放GOx的能力，将材料用Na₂S₂O₄（155 mM）处理4小时后，通过超滤（MWCO = 3.5 kDa）纯化HAG NCs，冻干备用，以排除Na₂S₂O₄处理产生离子对pH变化造成的影响。

为了检测HAG NCs的细胞摄取能力，HeLa细胞以1 × 10⁵细胞/孔密度接种在24孔板中，培养24小时。更换DMEM培养基，分别加入GOx 和HAG NCs（FITC-GOx, 2 μg/mL）。37 ^oC下孵育4小时后，细胞用PBS洗3次，胰蛋白酶（不含EDTA）消化。将悬浮液在1000 g的转速下离心5分钟，PBS洗2次，最后再用PBS（300 μL）重悬细胞。流式细胞仪（Beckton Dickinson，美国）检测细胞摄取水平，并用Cell Quest软件分析数据。将细胞用游离HA（终浓度为10mg/mL）预处理6小时，并在加入HAG NCs之前用PBS洗涤3次，采用同样的方法检测细胞摄取水平。

为了对纳米复合物的细胞毒性进行测定，HeLa细胞以1 × 10⁴细胞/孔密度接种在96孔板中，培养24小时。分别加入不同浓度的HA/AO/GOx（w/w = 4/1/0.05）（HAG） NCs和HA/BO/GOx（w/w = 4/1/0.05）（HBG）NCs，乏氧或常氧条件下将细胞孵育48小时，通过MTT计算细胞存活率。

为了通过GOx测定细胞内H₂O₂浓度，HeLa细胞以1×10⁶细胞/孔密度接种在12孔板中，培养24小时。将培养基更改为不含葡萄糖的DMEM（1 mL/孔），并加入不同浓度的HAGNCs。在37 ^oC孵育，并在不同测定时间点将细胞裂解，同时使用过氧化氢测定试剂盒（碧云天，中国）对细胞裂解液中的H₂O₂含量进行测定。

图9为不同比例下HA与AO静电结合形成纳米复合物的粒径和电势的图。当HA/AO质量比从0.5增加到4时，可以获得粒径为150-200 nm的NCs，Zeta电势从+28.9 mV连续降低到-23.1 mV。当质量比大于4时，电位没有继续产生变化。因此，AO可以有效地包载蛋白形成粒径约为140 nm，表面电荷为-18.1 mV 的HA/AO/GOx NCs（HAG NCs，HA/AO/GOx = 4/1/0.05，w/w/w）。

图10为乏氧处理前后HAG NCs中GOx蛋白释放量的图。在未处理条件下，24小时内从HAG NCs中释放出的GOx只占12.2%，表明HARPG NCs稳定包载蛋白的能力。而经Na₂S₂O₄处理后，24小时内从HAG NCs释放的GOx增加至73.8%。以上结果证明了乏氧介导的AO降解可实现NCs中蛋白的可控释放。

图11为HeLa细胞中HAG NCs摄取能力图。与GOx低摄取量相比，NCs表现出了优异的细胞摄取水平。为证明HAG NCs表面HA介导的靶向对肿瘤细胞摄取行为有积极作用，通过HA预处理HeLa细胞，检测肿瘤细胞对NCs内吞水平的影响。相比未处理，预处理组的摄取量大幅度降低，从而说明了HA有助于促进肿瘤细胞对NCs的摄取。

图12为常氧和乏氧条件下HAG NCs和HBG NCs对HeLa细胞毒性差异图。在催化葡萄糖转化的过程中，GOx可大量消耗氧气，同时产生双氧水。在常氧条件下，HAG NCs会增强GOx对癌细胞的增殖抑制，而HBG NCs未观察到明显的毒性，证明GOx造成乏氧的过程中，促使AO降解，从而快速释放大量GOx，最终完成对HeLa细胞的杀伤作用。

图13为递送HAG NCs后HeLa细胞中不同时间H₂O₂浓度变化的图。在氧气存在的情况下，HAG NCs可以在细胞内产生H₂O₂，证明了GOx在HeLa细胞中的成功递送，并同时也说明了GOx催化葡萄糖底物的功能。

本发明提供了具有乏氧响应性的阳离子聚合物，通过偶氮苯小分子为连接基团，使用不同分子量的聚乙烯亚胺为单体，共同制备交联结构的递送载体材料。本发明合成可降解阳离子材料，克服现有阳离子载体类材料缺陷，在降解材料毒性的同时，提升基因或蛋白的递送效率。