镧在制备改善肠道形态的制品中的应用、含乳酸杆菌的复合物、制备方法及其应用
阅读说明：本技术 镧在制备改善肠道形态的制品中的应用、含乳酸杆菌的复合物、制备方法及其应用 (Application of lanthanum in preparation of product for improving intestinal morphology, lactobacillus-containing compound, preparation method and application thereof ) 是由 蔡亮 于 2021-07-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了镧在制备改善肠道形态的制品中的应用、含乳酸杆菌的复合物、制备方法及其应用,复合物为乳酸杆菌与金属元素的复合物,金属元素为镧元素。含乳酸杆菌的复合物的制备方法：步骤A,将乳酸杆菌接种于培养基进行培养；步骤B,将步骤A的培养物接种到含金属元素的培养基进行培养；步骤C,将步骤B的培养物进行离心、分离获得乳酸杆菌泥。本发明将镧附着在乳酸杆菌表面,将功能性元素镧附着在乳酸杆菌上,获得的含乳酸杆菌的复合物,不仅可以影响微生物菌群,更重要的作用是可以改善肠道形态。(The invention discloses application of lanthanum in preparation of a product for improving the intestinal morphology, a lactobacillus-containing compound, a preparation method and application thereof. The preparation method of the lactobacillus-containing compound comprises the following steps: step A, inoculating lactobacillus to a culture medium for culture; b, inoculating the culture obtained in the step A to a culture medium containing metal elements for culture; and C, centrifuging and separating the culture obtained in the step B to obtain lactobacillus paste. According to the invention, lanthanum is attached to the surface of lactobacillus, and a functional element lanthanum is attached to the lactobacillus, so that the obtained compound containing lactobacillus can influence microbial flora, and has an important function of improving intestinal morphology.)
技术领域
本发明涉及饲料及饲料添加剂技术领域，具体涉及镧在制备改善肠道形态的制品中的应用、含乳酸杆菌的复合物、制备方法及其应用，尤其涉及一种乳酸杆菌镧复合物、制备方法及其在制备改善畜禽肠道健康的药物或饲料中的应用
背景技术
抗生素饲料，利用含有某些抗生素的饲料添加剂作为动物补充饲料。能促进生长，提高饲料利用率和抗病力。抗生素的滥用可能引起公害，使用中应加以限制，目前饲料抗生素在一些地方被全面禁用，益生菌是替代饲料抗生素最佳选择，但在畜禽饲料添加剂中使用的乳酸杆菌，一般为单纯乳酸杆菌，乳酸杆菌在调节肠道菌群有很好的作用，但是对肠道形态的影响较小。寻找到既能调节肠道菌群又能改善肠道形态的饲料抗生素替代品是急需解决的课题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：寻找能够改善肠道形态的饲料抗生素替代品，本发明提供了解决上述问题的一种金属元素和一种含乳酸杆菌的复合物、制备方法及其应用。
本发明通过下述技术方案实现：
镧在制备改善肠道形态的制品中的应用，所述制品包括药物、饲料或饲料添加剂。
进一步优选，改善肠道形态包括改善肠道绒毛长度、肠道隐窝深度。
一种含乳酸杆菌的复合物，为乳酸杆菌与金属元素的复合物，所述金属元素为镧。
进一步优选，所述金属元素以离子形式附着在乳酸杆菌表面，且金属元素与乳酸杆菌的质量比为0.011～0.034。
一种含乳酸杆菌的复合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤A，将乳酸杆菌接种于固体培养基进行培养；
步骤B，将步骤A的培养物接种到含金属元素的培养基进行培养；
步骤C，将步骤B的培养物进行离心、分离获得乳酸杆菌泥；
所述金属元素为镧。
进一步优选，步骤A和步骤B采用的固体培养基均为MRS固体培养基。
进一步优选，步骤B中，将步骤A的培养物，以106CFU/L乳酸杆菌的接种量接种到含每升含0.026g～0.32g金属元素的培养基进行培养，进一步优选以106CFU/L乳酸杆菌的接种量接种到含每升含0.026g～0.078g金属元素的培养基进行培养。
进一步优选，步骤B中，将步骤A的培养物，以106CFU/L乳酸杆菌的接种量接种到每升含0.052g±0.01g金属元素的培养基进行培养。
进一步优选，步骤A中，培养温度为37℃，培养时间为48h；步骤B中培养温度为37℃，培养时间为48h。
进一步优选，步骤C包括以下方法：将步骤B的培养物进行平衡离心；离心完毕后，取沉淀，再与无菌生理盐水混合、溶解沉淀菌体，收集的菌体用蒸馏水冲洗，最终得到乳酸杆菌泥。
进一步优选，还包括步骤D，冻干工艺：将乳酸杆菌泥依次经预冷动、真空低温干燥获得粉末菌体，最后将粉末菌体与复合保护剂进行低温混合，获得乳酸杆菌冻干粉。
关于冻干工艺，具体地，首先，将乳酸杆菌泥置于4℃环境中进行平衡；其次，将乳酸杆菌泥置于-40℃环境中进行预冷冻；然后，预冷冻完成后将乳酸杆菌泥放入真空冷冻干燥机中，设置温度-50℃，抽真空20Pa～40Pa，干燥，得到干燥成粉末的菌体；最后，将粉末的菌体在-40℃条件下与复合保护剂进行混合，获得乳酸杆菌粉于-80℃冷冻保存。
一种含乳酸杆菌的复合物的应用，含乳酸杆菌的复合物为上述的一种含乳酸杆菌的复合物、或者为上述一种含乳酸杆菌的复合物的制备方法制备的含乳酸杆菌的复合物，用于制备改善畜禽肠道健康的药物、饲料添加剂或饲料。
本发明具有如下的优点和有益效果：
现有技术中，益生菌是替代饲料抗生素最佳选择，但在畜禽饲料添加剂中使用的乳酸杆菌，一般为单纯乳酸杆菌，乳酸杆菌在调节肠道菌群有很好的作用，但是对肠道形态的影响较小。寻找到既能调节肠道菌群又能改善肠道形态的饲料抗生素替代品是急需解决的课题。
本发明创造性的将乳酸杆菌与金属镧复合，获得的镧以离子形式附着在乳酸杆菌表面，将功能性元素镧附着在乳酸杆菌上，通过肠道乳酸杆菌代谢释放有效物质，不仅可以影响微生物菌群，更重要的作用是可以改善肠道形态。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明的培养的乳酸杆菌SEM图，对照组每升培养基含0g镧；
图2为本发明的培养的乳酸杆菌镧复合物SEM图，处理组每升培养基含0.026g镧；
图3为本发明的培养的乳酸杆菌镧复合物SEM图，处理组每升培养基含0.052g镧；
图4为本发明的培养的乳酸杆菌镧复合物SEM图，处理组每升培养基含0.32g镧；
图5为本发明的乳酸杆菌镧对断奶仔兔十二指肠上皮细胞钙调蛋白的影响结果图表；图5中，编号“1”表示处理1饲喂基础日粮，编号“2”表示处理2饲喂基础日粮+100mg/kg氧化镧，编号“3”表示处理3饲喂基础日粮+200mg/kg氧化镧，编号“4”表示处理4饲喂基础日量+100mg/kg氯苯胍(抗生素)，“*”表示与其他组差异显著(P<0.05)(统计方法为Duncan法)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例提供了一种含乳酸杆菌的复合物，为乳酸杆菌与金属元素镧的复合物，金属元素镧附着在乳酸杆菌表面，通过以下方法制备获得：
步骤1，冷藏的乳酸杆菌接种于MRS固体培养基(灭菌)，并于CO2无菌培养箱37℃放置48h。
步骤2，将步骤1的乳酸杆菌培养物以106CFU/L乳酸杆菌的接种量接到每升含0.052g金属镧的MRS固体培养基(灭菌)或纯牛奶培养基，并于CO2无菌培养箱中37℃恒温培养48h。
步骤3，将步骤2的培养物在4℃、6000r/min、15min的条件下进行平衡离心；离心完毕后，取沉淀，加入等体积的无菌生理盐水(用于洗涤菌体)溶解沉淀菌体，收集的菌体用蒸馏水冲洗2-3次，最终得到乳酸杆菌泥存放于-4℃无菌冷藏24h。
备注说明：步骤1和步骤2用到的MRS固体培养基具体为：蛋白胨,10g/L；牛肉粉,5g/L；酵母粉,4g/L；葡萄糖,20g/L；磷酸氢二钾,2g/L；柠檬酸氢二铵,2g/L；乙酸钠,5g/L；硫酸镁,0.2g/L；硫酸锰,0.05g/L；吐温80,1ml/L；琼脂,15g/L；PH值5.7±0.2(25℃)；纯牛奶培养基营养成分为：每100mL含能量284KJ，蛋白质3.2g,脂肪4.0g，碳水化合物4.8g，钠62mg，钙100mg。
实施例2
本实施例提供了一种含乳酸杆菌复合物的冻干粉，通过以下方法依次制备获得：
步骤4，将实施例2制备的乳酸杆菌泥平皿先放入4℃冰箱平衡30min；
步骤5，将乳酸杆菌泥放置-40℃冰箱中进行预冷冻20h。
步骤6，预冷冻完成后放入真空冷冻干燥机中，设置温度-50℃，抽真空20Pa～40Pa，干燥24h，得到干燥成粉末的菌体，称重后，立即将菌体在-40℃条件下与复合保护剂(脱脂乳粉、乳糖和甘油)进行混合，获得乳酸杆菌粉于-80℃冷冻保存。
效果试验
采用实施例1的方法，将106CFU/L乳酸杆菌的接种量接种到每升含0.026g、0.052g、0.32g金属元素镧的培养基进行培养，并对制备的乳酸杆菌镧进行以下定性、定量以及效果分析试验：
1、定性分析
(1)将106CFU/L乳酸杆菌的接种量接种到每升含0.026g、0.052g、0.32g金属元素镧的MRS固体培养基进行培养，分别得到1.8×105CFU/ml，1.1×106CFU/ml，2.4×104CFU/ml的乳酸杆菌。说明镧影响了乳酸杆菌的增值，且在每升含0.052g金属元素镧的MRS固体培养基中，乳酸杆菌的表达量最大，故建议镧在每升培养基中的添加范围为0.026g～0.052g，对应金属元素镧与乳酸杆菌的质量比在0.011～0.034。
(2)电镜分析
将培养的乳酸杆菌及乳酸杆菌镧复合物，放置于SEM下观察其表面形态，如图1-4所示，结果表明：与未添加镧的培养基比较，添加镧的培养基获得的乳酸杆菌表面有小部分凸起，预测为镧附着在乳酸杆菌表面而形成的。
2、定量分析
将每升含有0.026g、0.052g镧的MRS固体培养基培养的乳酸杆菌分别消解为分解液，并用ICP-MS检测分解液中镧的浓度，通过质量守恒定律分别计算出每克乳酸杆菌中镧质量为0.011g和0.034g。
3、效果分析
3.1.镧存在替代抗生素可能性的验证
(1)试验方法：
288只断奶仔兔随机分为4个处理，每个处理6个重复，每个重复12只兔，试验期42天。处理1饲喂基础日粮；处理2饲喂基础日粮+100mg/kg氧化镧；处理3饲喂基础日粮+200mg/kg氧化镧；处理4饲喂基础日量+100mg/kg氯苯胍(抗生素)。42天试验结束后，每个处理随机选取4只兔(选自不同的重复)，屠宰后快速取十二指肠上皮细胞，用于检测其钙调蛋白基因mRNA的表达量。
备注：此处，“100mg/kg氧化镧”和“200mg/kg氧化镧”分别是指每公斤基础日粮添加氧化镧的量为100mg/kg和200mg/kg，两组不同浓度氧化镧进入肠道后的浓度就是本发明图2和图3中镧在培养基中的添加浓度；处理2也是制备本发明含金属元素镧的乳酸杆菌的复合物中金属元素镧添加量的指导依据。经过胃酸的作用，氧化镧以镧离子的形式在肠道发挥作用。
(2)试验结果(图5)。
(3)如图5所示，相对于处理1(对照组)，处理2(100mg/kg氧化镧处理组)和处理4(抗生素处理组)均显著提高了仔兔十二指肠上皮细胞钙调蛋白基因mRNA表达量。已有报道证明，钙调蛋白参与的细胞信号通路(G蛋白偶联受体/钙调蛋白/环磷酸腺苷)可以调控肠上皮细胞的增生、成熟和凋亡，故本实验结果说明了基础日粮中添加适宜剂量的镧，能和抗生素一样起到调节肠上皮细胞钙调蛋白基因mRNA表达量的作用，从而调控肠道上皮细胞代谢，利于改善肠道形态。说明镧可在一定程度上可替代抗生素。故将其选为与乳酸杆菌结合的金属。
3.2.镧改善肠道形态的验证
(1)试验方法：
216只断奶仔兔随机分为3个处理，每个处理6个重复，每个重复12只兔，试验期42天。处理1饲喂基础日粮；处理2饲喂基础日粮+100mg/kg氧化镧；处理3饲喂基础日粮+200mg/kg氧化镧。
备注：此处，“100mg/kg氧化镧”和“200mg/kg氧化镧”分别是指每公斤基础日粮添加氧化镧的量为100mg/kg和200mg/kg，两组不同浓度氧化镧进入肠道后的浓度就是本发明图2和图3中镧在培养基中的添加浓度；处理2也是制备本发明含金属元素镧的乳酸杆菌的复合物中金属元素镧添加量的指导依据。经过胃酸的作用，氧化镧以镧离子的形式在肠道发挥作用。
(2)试验结果(表1)。
表1不同水平氧化镧对断奶仔兔肠道形态的影响
(3)效果分析
如表2所示，镧可在一定程度上可以改善肠道形态，故将其选为与乳酸杆菌结合的金属。
3.3.乳酸杆菌镧复合物优于单独使用镧或单独使用乳酸杆菌的效果验证(1+1大于2)
(1)试验方法
大肠杆菌作为动物肠道疾病发生的主要致病菌，其在肠道内的含量直接影响了肠道健康。故我们选择大肠杆菌为试验对象，对比单独添加镧、乳酸杆菌以及同时添加镧和乳酸杆菌对大肠杆菌生长的影响。将相关试验因子(镧、乳酸杆菌和大肠杆菌)分别添加到对应的装有3mL纯牛奶(灭菌)的试管中，混匀后在二氧化碳培养箱中进行培养，培养条件为37℃，48h，二氧化碳含量15％。随后分别取100μl培养液接种到MRS固体培养基中，通过平板计数获得大肠杆菌和乳酸杆菌的生长情况。
(2)试验结果(表2)
表2镧和乳酸杆菌对大肠杆菌生长的影响
注：纯牛奶营养成分为：每100mL含能量284KJ，蛋白质3.2g,脂肪4.0g，碳水化合物4.8g，钠62mg，钙100mg。乳酸杆菌和大肠杆菌最初在纯牛奶中的添加量均为0.73×103CFU/m。乳酸杆菌和大肠杆菌最初在纯牛奶中的添加量均为0.73×103CFU/mL，含镧处理组的镧均以离子形式添加，且添加量均为0.052mg/mL。同时添加镧和乳酸杆菌的处理组可形成本发明方法制备的乳酸杆菌镧复合物。
(3)效果分析
1)单独添加乳酸杆菌作用效果
与大肠杆菌组对比，单独添加乳酸杆菌对大肠杆菌有抑制作用，大肠杆菌降低了1.71×107(大肠杆菌含量是对比组的0.34倍)。
2)单独镧金属元素作用效果
与大肠杆菌组比较，添加了镧和大肠杆菌的处理组，纯牛奶中大肠杆菌增加了0.3×107CFU/mL(大肠杆菌含量是对比组的1.12倍)。与乳酸杆菌组比较，添加了镧和乳酸杆菌的处理中，纯牛奶中乳酸杆菌降低了0.3×105CFU/mL(乳酸杆菌含量是对比组的0.95倍)。
3)本发明提供的含镧乳酸杆菌复合物的作用效果
相对于同时加入乳酸杆菌和大肠杆菌但未加入镧的处理组，同时加入镧、乳酸杆菌和大肠杆菌的处理组，纯牛奶中乳酸杆菌数量增加了1.7×105CFU/mL(乳酸杆菌含量是对比组的1.38倍)，大肠杆菌数量减少3.4×106CFU/mL(大肠杆菌含量是对比组的0.62倍)。综上所述，单独添加镧对乳酸杆菌和大肠杆菌的生长影响较小，但是同时加入镧和乳酸杆菌，对增加乳酸杆菌的含量和降低大肠杆菌的含量效果更好，实现了1+1大于2的效果。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：牡蛎养殖废弃物的回收利用方法