阅读说明：本技术 一种细胞切向粘附力的自动化测量方法 (Automatic measurement method for cell tangential adhesion ) 是由 孙明竹 赵新 李璐 姚亚彤 于 2020-05-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种细胞切向粘附力的自动化测量方法,包括以下步骤：将细胞测量区和洗针区设置于同一个培养皿中,微管在洗针区润洗后移动至细胞测量区；微管自动移动至细胞上方,并使气液交界面移动至微管前端；在微管下降的过程中进行自动化接触检测,待微管接触细胞表面时,微管自动停止下降；减小微管内平衡压,记录细胞与微管间刚形成密封时和细胞刚被吸进微管时的平衡压压强值,计算细胞切向粘附力。本发明将细胞测量区和洗针区设置于同一个培养皿,免去卸下微管进行润洗的步骤；通过检测微管下降过程中的运动情况判断微管是否与细胞接触,剔除人为因素的影响；通过平衡压测量吸附力,计算细胞切向粘附力,实现了细胞切向粘附力的自动化测量。(The invention discloses an automatic measurement method of cell tangential adhesion, which comprises the following steps: arranging the cell measuring area and the needle washing area in the same culture dish, and moving the microtube to the cell measuring area after the microtube is wetted in the needle washing area; the micro-tube automatically moves to the upper part of the cell and the gas-liquid interface moves to the front end of the micro-tube; carrying out automatic contact detection in the process of descending the microtube, and automatically stopping descending the microtube when the microtube contacts the cell surface; reducing the equilibrium pressure in the microtube, recording the equilibrium pressure intensity values when a seal is just formed between the cell and the microtube and when the cell is just sucked into the microtube, and calculating the tangential adhesion of the cell. According to the invention, the cell measuring area and the needle washing area are arranged on the same culture dish, so that the step of removing the microtube for rinsing is omitted; whether the microtubules are in contact with the cells or not is judged by detecting the movement condition of the microtubules in the descending process, and the influence of human factors is eliminated; the adsorption force is measured through the equilibrium pressure, the cell tangential adhesion force is calculated, and the automatic measurement of the cell tangential adhesion force is realized.)

一种细胞切向粘附力的自动化测量方法

技术领域

本发明属于细胞级别的测量技术领域，特别涉及一种细胞切向粘附力的自动化测量方法。

背景技术

细胞粘附力与细胞的生长、分化等生理过程紧密相关，测量细胞粘附力在研究细胞力学特性，探究肿瘤形成过程甚至细胞癌变等医学领域上有重要意义。目前，测量细胞粘附力的方法多种多样，例如，微管吸持法、光镊法、磁镊法、环境扫描电镜、原子力显微镜等技术。其中，微管吸持法因为其低设备要求、对细胞伤害小、与其他仪器集成度较高的原因，被广泛应用。

传统的微管吸持法测细胞切向粘附力，为减少微管与细胞间的摩擦，每测量一个细胞都需要卸下微管在胰酶中润洗，大大降低了测量的效率。同时由于测量过程中，吸持位置上微管尖端与细胞的相对高度是全凭操作者的经验判断的，缺乏一个客观的标准，所以对操作者有很高的要求，并且由于主观因素的影响使得测量的结果存在很大的不确定性。除此之外，在传统的测量过程中，气动注射器中的气体与培养皿中的液体由于毛细作用力会在微管内形成一个气液交界面，气液交界面处的液体会受到毛细作用力，对测量结果产生很大影响。因此，设计一个快速的能够自动检测微针下降高度、消除毛细作用力影响的自动化测量细胞切向粘附力的方法很有必要。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种细胞切向粘附力的自动化测量方法，能够免去微管的卸下、润洗过程，自动检测微管与细胞接触，并消除毛细作用力对测量结果的影响，快速、准确的测量细胞切向粘附力。

本发明采用的技术方案是：一种细胞切向粘附力的自动化测量方法，包括以下步骤：

a.将细胞测量区和洗针区设置于同一个培养皿中，使用电动注射器在洗针区不断抽吸充分润洗测量微管，然后移动至细胞测量区；

细胞测量区和洗针区放置方式为：待测细胞接种于培养皿上；取适量胰酶滴在半块盖玻片上；将培养皿与盖玻片分别用蒸馏水并排粘在另一个较大的培养皿盖上，确保培养皿与培养皿之间、培养皿与盖玻片之间没有气泡；并且微管在细胞测量区和洗针区的运动方向与微管垂直。

b.微管移动至细胞上方，并使气液交界面移动至微管前端；

将测量微管在z方向上调节到高于细胞10-20μm处，再使微管在x-y平面内移动至细胞上方；控制电动注射器持续施加正压，使气液交界面移动至微管前端，平衡毛细作用力。

c.在微管下降的过程中进行自动化接触检测，待微管接触细胞表面时，微管停止下降；

微管下降的过程中进行微管与细胞的运动检测，通过获取感兴趣区域(ROI)，并对该区域用运动历史图像(Motion History Image)方法检测微管与细胞的运动，判断感兴趣区域中运动部分的像素平均值是否达到合适的阈值，来判断微管是否接触到细胞。在运动检测中，只有发生运动的部分，才会呈现为白色像素点。当微管接触细胞表面，细胞会发生肉眼难以分辨的运动，此时ROI内的白色像素点数会增加。

d.控制注射器减小微管内的平衡压，使细胞被完全吸离培养皿底面，进入微管内，记录细胞与微管间刚形成密封时的平衡压和细胞刚被吸进微管时的平衡压的压强值，使用平衡压代替注射器的压力测量微管对细胞的吸附力，计算细胞切向粘附力；

细胞切向粘附力的值由以下公式求得：

其中，r表示微管口内半径，α表示x轴与微管的夹角，P_IC表示密封刚形成时的平衡压，P′表示细胞刚被吸进微管时的平衡压，σ表示培养液表面张力系数，β_C、β′分别表示密封刚形成时和细胞刚被吸进微管时气液交界面与管壁的接触角，R_C、R′则分别表示两个时刻的微管内壁半径。

与现有技术相比，本发明所具有的有益效果是：

1.本发明将细胞测量区和洗针区设置于同一个培养皿中，免去卸下微管进行润洗的步骤，提高了测量效率；

2.本发明通过检测微管下降过程中的运动情况判断微管是否与细胞接触，确定测量的最佳高度，剔除人为因素的影响，提高了测量速度和准确性；

3.本发明通过平衡压测量吸附力，计算细胞切向粘附力，实现了细胞切向粘附力的自动化测量，测量速度快、测量结果准确度高。

附图说明

图1是本发明的流程图；

图2是本发明的洗针与测量区域放置示意图；

图3是本发明的自动化微管运动检测图像；

图4是本发明的细胞与微管间刚形成密封时的受力分析示意图；

图5是本发明的细胞刚被吸进微管时的受力分析示意图；

图6是本发明中将细胞吸离培养皿底面的图像。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明。

本发明的实施例公开了一种细胞切向粘附力的自动化测量方法，如图1所示，其包括以下步骤：

(1)小鼠成骨细胞获取；

本实施例所用的小鼠成骨细胞由相关合作单位提供，拿到细胞后，将细胞放入37℃，5％CO₂，100％湿度培养箱中培养。每2-3天换一次培养液，完全培养基由89％DMEM(高糖)、10％FBS和1％双抗组成，在37℃水浴锅中预热10分钟后加入到培养皿中。待细胞培养至密度达80％以上时进行传代：将细胞培养基吸干舍弃；培养皿加入2-3ml无菌PBS，轻轻晃动浸洗培养皿后吸干舍弃；加入1ml胰酶，轻轻晃动培养皿，使胰酶浸没皿底所有部位，将皿盖好放入培养箱中消化，3分钟后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞不再贴壁，加入3ml预热好的完全培养基终止消化；用移液枪吹打培养皿底面的细胞，使之完全脱落；收集细胞悬液，1000rpm离心3分钟，弃去上清液，加入2ml完全培养基，吹打分盘，加入完全培养液9-10ml，轻晃培养皿，使细胞分布均匀，之后将细胞放入培养箱中培养。培养24小时后进行实验。

(2)洗针与测量区域的放置，如图2所示；

本实施例中，小鼠成骨细胞接种在3cm培养皿上，胰酶滴于半块洁净的盖玻片上，将盖玻片与培养皿用蒸馏水粘在6cm的培养皿盖上，一同置于载物台上。实验前，电动注射器不断抽吸润洗微管，以减小微管内壁与细胞间摩擦力的影响。充分润洗过后，控制微操作臂与载物台，使微管快速移动至待测量区域。

(3)自动化微管运动检测，如图3所示；

本实施例中，在微管移动到x-y平面内合适位置，施加正压将气液交界面(GLI)移动到微管前端之后。此时，微管的高度与细胞相差10-20μm，开始进行微管与细胞的运动检测。通过获取感兴趣区域(ROI)，并对该区域用运动历史图像(Motion History Image)方法检测微管与细胞的运动，判断感兴趣区域中运动部分的像素平均值是否达到合适的阈值来判断微管是否接触到细胞。图3(a)为感兴趣区域(ROI)的选择图像，图3(b)为进行运动检测的部分微管与细胞的图像，图3(c)为当前帧ROI内微管与细胞的运动情况。在运动检测中，只有发生运动的部分，才会呈现为白色像素点。当微管接触细胞表面，细胞会发生肉眼难以分辨的运动，此时ROI内的白色像素点数会增加，通过实验，我们设定当ROI内图像均值超过10的时候，判定微管与细胞发生接触，微管到达目标位置。

(4)基于平衡压模型的细胞切向粘附力的测量，如图4、图5所示；

施加正压平衡毛细作用力，将GLI移动到微管前端，当微管达到目标位置后，控制电动注射器缓慢减小平衡压，获得微管作用在细胞上的吸附力。

图4为由于平衡压减小，细胞与微管间刚形成密封时的受力分析示意图，此时平衡压大小如下：

P_IC＝2σcosβ_C/R_C

其中，β_C表示密封形成时GLI与管壁的接触角，R_C表示密封形成时GLI处的微管内壁半径。

图5为细胞刚被吸进微管时的受力分析示意图，此时，平衡压为P′，由于细胞已经将微管密封，微管外的液体无法进入到微管内，进而在微管口处形成一个吸持压ΔP，P′由下式表示：

P′＝2σcosβ′/R′-ΔP

其中，β′和R′为细胞刚被吸进微管时GLI处的接触角和内壁半径。

整理以上两式可得到吸持压ΔP为：

ΔP＝(P_IC-P′)+2σ(cosβ′/R′-cosβ_C/R_C)

本实施例中，操作时使用的物镜放大倍数较大，使得处于视野中的微管长度有限，由于微管在长度很小的范围内，内径变化不大。因此，假设微管内径一直不变，则毛细压也没有变化，即上式第二项为零。吸持压ΔP可由以下公式求得：

ΔP＝P_IC-P′

(5)细胞切向粘附力的计算；

细胞切向粘附力的值可根据以下公式得到：

P_τ＝πr²p/cosα

其中p为作用在细胞上的压力，r表示微管口内半径，α表示x轴与微管的夹角，为30°。

吸持压ΔP即为作用在细胞上的压力p，将ΔP代入得到最终测量公式为：

P_τ＝πr²(P_IC-P’)/cosα

图6为实验中将细胞吸离培养皿底面的图像；图6(a)为实验中细胞与微管间刚形成密封时的图像，图中对应的P_IC为21.329kPa。图6(b)为细胞刚被吸进微管时的图像，图中对应的P′为9.793kPa。两图中的微管口内半径为7.935μm。计算得到图中细胞切向粘附力为2.635×10^-1dyne。为减小测量多次细胞对微管内壁的影响，每测量三到四个细胞更换一根微管。本实施例中用该方法测得了5个细胞的切向粘附力，结果为3.231±0.845×10^-1dyne，与文献中测得人成骨细胞粘附力一致，并且本方法的操作速度约是现有方法的4倍(传统方法：20-30min/cell，本发明方法：5-7min/cell)。

以上通过实施例对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的示例性实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。本发明的保护范围由权利要求书限定。凡利用本发明所述的技术方案，或本领域的技术人员在本发明技术方案的启发下，在本发明的实质和保护范围内，设计出类似的技术方案而达到上述技术效果的，或者对申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖保护范围之内。