阅读说明：本技术 一种海地瓜和驼血降糖肽 () 是由 邸多隆 王宁丽 裴栋 魏鉴腾 于 2020-06-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种海地瓜和驼血降糖肽的制备方法,所提供的海地瓜和驼血降糖肽包括以下重量份数的各组分：海地瓜多肽1份～9份,驼血多肽1份～9份。本发明采用海地瓜和驼血为原料,通过蛋白酶酶解、膜分离等技术制备了海地瓜降糖肽及驼血降糖肽,并将二者以恰当的比例混合,制备出一种海地瓜和驼血降糖肽,能够辅助降低血糖。该制备方法绿色环保,并且实现驼血和海地瓜的高值化利用,具有广阔的市场前景,能够产生良好的经济效益和社会效益。()

一种海地瓜和驼血降糖肽

技术领域

本发明属于活性物质开发技术领域，具体涉及一种海地瓜和驼血降糖肽。

背景技术

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。我国糖尿病患病率居世界榜首，2型糖尿病的发病率在18岁以上成年人人群中占10.4％，60岁以上的老年人患病率高达20％以上。糖尿病可导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害，功能障碍。如糖尿病长期不能有效控制，可导致脑中风、冠心病、失明，肾衰***、下肢坏死等严重后果。引起糖尿病的病因与生活方式和不良的生活习惯都有一定的关系，患有糖尿病的患者，应尽早进行调理治疗。糖尿病的治疗包括糖尿病教育、饮食治疗、运动治疗、药物治疗、血糖监测、以及其他心血管疾病危险因子的检测和控制几个方面。主要是通过饮食控制，运动，降低体重并联合降糖药物降血糖。糖尿病患者对饮食的要求比较严格，饮食治疗的原则是：控制总热量和体重。一般主张每日膳食中的蛋白质，按照0.6-0.8克/公斤标准体重给予，还要在限量范围内提高优质蛋白的比例。处于糖尿病肾病第3、4期的患者，在坚持糖尿病营养治疗其他原则的同时，掌握好每日蛋白质摄入的质和量。糖尿病患者没有给自己制定科学合理的饮食方案，那么一旦肾功能发生障碍，轻则血压上升，周身乏力；重则肾功能障碍，浮肿，男性出现阳萎，睾丸萎缩等；重则完全丧失生活自理能力，甚至有可能被夺去生命。现有治疗糖尿病的药物都有一定的副作用，如引起低血糖，胃肠道不适等。因此，亟需开发具有辅助降血糖功效的食品来进一步指导糖尿病患者的饮食。

海地瓜作为海参的替代品，价格低廉、富含多种氨基酸及微量元素、营养丰富，但因其口感不佳，未被大众认可。驼血做为骆驼产业链的副产物，常被丢弃，造成资源浪费及环境污染

发明内容

本发明的目的是提供一种海地瓜和驼血降糖肽，该降糖肽能够有效的降血糖；从而弥补现有技术的不足。

一种驼血多肽，所述的驼血多肽是使用黑曲霉蛋白酶和胰蛋白酶酶解驼血多肽制备的，其中多肽的分子量为160—1000Da；

所述的驼血多肽，其一种制备方法如下：将驼血用黑曲霉蛋白酶和胰蛋白酶酶解，酶解产物离心后使用分子量范围为160～1000Da的膜进行过滤分离后制备的；

其中黑曲霉蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1～3:3～1；

所述的酶解条件，是酶解时间3～5h，温度40～60℃，pH值5～8；

本发明所提供的驼血多肽用于制备用于降血糖的食品或药品；

本发明还提供一种降糖肽，所述的降糖肽中使用了上述的驼血多肽和海地瓜多肽，所述的海地瓜多肽是使用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶进行复合酶解制备的分子量为360-1000Da范围的多肽；

其中胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1～5:5～1；

酶解条件为时间1～5h，温度40～60℃，pH值6-8；

所述的降糖肽中海地瓜多肽和驼血多肽的质量比为：海地瓜多肽1～9份，驼血多肽1～9份。

本发明以海地瓜和驼血为原料，通过蛋白酶酶解、膜分离等现代分离技术得到具有降糖活性的多肽，并通过恰当比例搭配，得到口感佳、营养价值高、活性好的降糖肽。本发明中的降糖肽降血糖效果优于单纯的海地瓜多肽和驼血多肽，同时，服用该降糖肽可以补充人体所需的各种营养物质，除了单纯的动物蛋白外，还包括海洋生物所特有的营养物质及沙生生物所特有的营养物质。

附图说明

图1：不同蛋白酶酶解所得驼血多肽的α-淀粉酶抑制率(1mg/mL)，其中E1为胰蛋白酶；E2为无花果蛋白酶；E3为木瓜蛋白酶；E4为黑曲霉蛋白酶；E5为胃蛋白酶；E6为黑曲霉蛋白酶:无花果蛋白酶＝1:1；E7为黑曲霉蛋白酶:胃蛋白酶＝1:1；E8为胰蛋白酶:木瓜蛋白酶＝1:1；E9为黑曲霉蛋白酶:木瓜蛋白酶＝1:1；E10黑曲霉蛋白酶:胰蛋白酶＝1:1。

图2：不同蛋白酶酶解所得驼血多肽的α-葡萄糖苷酶抑制率(100μg/mL)，其中E1为胰蛋白酶；E2为无花果蛋白酶；E3为木瓜蛋白酶；E4为黑曲霉蛋白酶；E5为胃蛋白酶；E6为黑曲霉蛋白酶:无花果蛋白酶＝1:1；E7为黑曲霉蛋白酶:胃蛋白酶＝1:1；E8为胰蛋白酶:木瓜蛋白酶＝1:1；E9为黑曲霉蛋白酶:木瓜蛋白酶＝1:1；E10黑曲霉蛋白酶:胰蛋白酶＝1:1。

图3：不同蛋白酶酶解所得驼血多肽DPP4抑制率(100μg/mL)，其中E1为胰蛋白酶；E2为无花果蛋白酶；E3为木瓜蛋白酶；E4为黑曲霉蛋白酶；E5为胃蛋白酶；E6为黑曲霉蛋白酶:无花果蛋白酶＝1:1；E7为黑曲霉蛋白酶:胃蛋白酶＝1:1；E8为胰蛋白酶:木瓜蛋白酶＝1:1；E9为黑曲霉蛋白酶:木瓜蛋白酶＝1:1；E10黑曲霉蛋白酶:胰蛋白酶＝1:1。

图4：海地瓜多肽对α-淀粉酶的抑制作用图，

图5：海地瓜多肽对DPP4的抑制作用图，

图6：海地瓜多肽对RIN-m5f细胞胰岛素分泌量的影响图。

具体实施方式

本发明以海地瓜和驼血为原料，通过蛋白酶酶解、膜分离等现代分离技术得到具有降糖活性的多肽。

申请人通过α-淀粉酶抑制剂筛选模型、α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型及DPP4抑制剂筛选模型等多种筛选评价方法确定经黑曲霉蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解所得的驼血多肽降血糖功效强于其他蛋白酶酶解所得驼血多肽(图1、图2、图3)。通过α-淀粉酶抑制剂筛选模型、DPP4抑制剂筛选模型、高糖损伤后胰岛素细胞分泌胰岛素含量测定等多种筛选评价方法确定经胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的复合酶酶解所得的海地瓜多肽具有良好的降血糖功效(图4、图5、图6)。

采用高效液相色谱仪测定法，以分子量360-1000Da的多肽为指标，根据GB/T22729-2008方法分析具有降血糖功效的酶解产物中多肽的比例，根据色谱图，并通过与蛋白质标准分子量对比，确定海地瓜降糖肽在360Da-1000 Da分子量之间。而经黑曲霉蛋白酶和胰蛋白酶的复合酶酶解所得的驼血多肽降糖肽在160Da-1000 Da分子量之间。

下面通过具体实施例对本发明做详细的说明。

实施例1

将1L新鲜驼血或冷冻驼血解冻，匀浆后用4～400目的滤网过滤，得到预处理的驼血，向预处理的驼血中加入2％的复合蛋白酶(黑曲霉蛋白酶:胰蛋白酶＝1:1)，其中，黑曲霉蛋白酶购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司(生产许可证编号：SC10345010800150)，酶解时间4h，温度50℃，pH值7；酶解过程中使用磁力搅拌器搅拌，酶解结束后，酶解液经1000Da和160Da的膜进行过滤，收集160-1000Da分子量的浓缩液，浓缩液经活性炭脱色、脱腥，喷雾干燥后得到9.25g驼血多肽。

上述得到的驼血多肽对α-淀粉酶的半数抑制浓度(IC₅₀)为0.5mg/mL，对α-葡萄糖苷酶的IC₅₀为51μg/mL，对DPP4的IC₅₀为43μg/mL。多种体外降血糖筛选评价方法均表明驼血多肽具有较好的降血糖效果。

将100g干海地瓜粉碎，加水制成悬浊液，其中海地瓜与水的质量比为1:6；然后加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的复合酶(复合酶中胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1:1)至终浓度为2％；酶解时间4h，温度50℃，pH值7；酶解过程中使用磁力搅拌器。酶解结束后，加入乙醇进行多糖的沉淀，8000rpm离心20min后取上清，上清液经1000Da和360Da的膜分别进行过滤，收集360Da-1000Da分子量的浓缩液，浓缩液经活性炭脱色、脱腥，喷雾干燥后得到10.65g海地瓜多肽。

将制备的海地瓜多肽和驼血多肽以1:1的比例配比，制备得到海地瓜和驼血降糖肽。

参照保健食品检验与评价技术规范(2003版)描述的方法测定降糖肽的降血糖功效。

实验动物：SD大鼠(180±20g)，雄性，每组8-12只。高血糖动物模型建立：大鼠禁食24h后，给予四氧嘧啶造型，5-7天后禁食3-5小时，测血糖，血糖值10-25mmol/L为高血糖模型成功动物。

选高血糖模型动物按禁食3-5小时的血糖水平分组，随机选1个模型对照组和3个剂量组(5、10、15mg/kg体重)。剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予溶剂，连续30天，测空腹血糖值(禁食同实验前)。比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。

结果表明，当剂量组大鼠给予海地瓜和驼血降糖肽5mg/kg体重时，30天后，空腹血糖试验后与试验前具有显著性差异，且试验后平均血糖下降14.4％；试验后5mg/kg体重剂量组大鼠血糖值与模型对照组相比，差异具有显著性，说明海地瓜和驼血降糖肽具有辅助降血糖功效。

实施例2

将100g干海地瓜粉碎，加水制成悬浊液，其中海地瓜与水的质量比为1:6；然后加入2％胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的复合酶(胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为3:2)酶解，酶解过程中使用磁力搅拌器，酶解时间2h，温度50℃，pH值7。酶解结束后，加入乙醇进行多糖的沉淀，8000rpm离心20min后取上清，上清液经1000Da和360Da的膜进行过滤，收集360-1000Da分子量的浓缩液，浓缩液经活性炭脱色、脱腥，喷雾干燥后得到13.5g海地瓜多肽。

将1L驼血预处理后，加入2％的黑曲霉蛋白酶和胰蛋白酶(2:1)酶解，酶解过程中使用磁力搅拌器，酶解时间4h，温度50℃，pH值7；酶解结束后，酶解液经1000Da和160Da的膜进行过滤，收集160-1000Da分子量的浓缩液，浓缩液经活性炭脱色、脱腥，喷雾干燥后得到12.32g

驼血多肽。

将海地瓜多肽和驼血多肽以55:45的比例混合制备得到海地瓜和驼血多肽降糖肽。

按照实施例1中的方法检测海地瓜和驼血降糖肽的降血糖功效。结果表明，当剂量组大鼠给予海地瓜和驼血降糖肽5mg/kg体重时，30天后，空腹血糖试验后与试验前具有显著性差异，且试验后平均血糖下降13.6％；试验后5mg/kg体重剂量组大鼠血糖值与模型对照组相比，差异具有显著性，说明海地瓜和驼血降糖肽具有辅助降血糖功效。

实施例3

将100g干海地瓜粉碎，加水制成悬浊液，其中海地瓜与水的质量比为1:6；然后加入4％胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的复合酶(3:1)酶解，酶解过程中使用磁力搅拌器，酶解时间2h，温度50℃，pH值7；酶解结束后，加入乙醇进行多糖的沉淀，8000rpm离心20min后取上清，上清液经1000Da和360Da的膜进行过滤，收集360-1000分子量的浓缩液，浓缩液经活性炭脱色、脱腥，喷雾干燥后得到17.8g海地瓜多肽。

将1L驼血预处理后，加入2％的黑曲霉蛋白酶和胰蛋白酶(1:2)酶解，酶解过程中使用磁力搅拌器，酶解时间4h，温度50℃，pH值7；酶解结束后，酶解液经1000Da和160Da的膜进行过滤，收集160-1000Da分子量的浓缩液，浓缩液经活性炭脱色、脱腥，喷雾干燥后得到8.96g驼血多肽。

将海地瓜多肽和驼血多肽以3:2的质量比例配比，制备得到海地瓜和驼血降糖肽。该降糖肽具有很好的降血糖作用。

按照实施例1中的方法检测海地瓜和驼血降糖肽的降血糖功效。结果表明，当剂量组大鼠给予海地瓜和驼血降糖肽5mg/kg体重时，30天后，空腹血糖试验后与试验前具有显著性差异，且试验后平均血糖下降16.4％；试验后5mg/kg体重剂量组大鼠血糖值与模型对照组相比，差异具有显著性，说明海地瓜和驼血降糖肽具有辅助降血糖功效。

实施例4

将100g干海地瓜粉碎，加水制成悬浊液，其中海地瓜与水的质量比为1:6；然后加入2％胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的复合酶(1:1)酶解，酶解过程中使用磁力搅拌器，酶解时间2h，温度50℃，pH值7；酶解结束后，加入乙醇进行多糖的沉淀，8000rpm离心20min后取上清，上清液经1000Da和360Da的膜进行过滤，收集360-1000分子量的浓缩液，浓缩液经活性炭脱色、脱腥，喷雾干燥后得到11.4g海地瓜降糖肽。

经检测，海地瓜降糖肽菌落总数为25CFU·g-1，大肠菌群＜30MPN·(100g)-1，霉菌＜10CFU·g-1，沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌均未检出，因此微生物检测指标均符合要求；总砷含量(以As计)为0.021mg·kg-1，铅(Pb)含量为0.13mg·kg-1，铜(Cu)未检出，因此，重金属均符合食品安全要求。

将1L驼血预处理后，加入2％的黑曲霉蛋白酶和胰蛋白酶(2:1)酶解，酶解过程中使用磁力搅拌器，酶解时间4h，温度50℃，pH值7；酶解结束后，酶解液经1000Da和160Da的膜进行过滤，收集160-1000分子量的浓缩液，浓缩液经活性炭脱色、脱腥，喷雾干燥后得到12.56g驼血多肽。

将海地瓜多肽和驼血多肽以65:35的比例配比，制备得到海地瓜和驼血降糖肽。

按照实施例1中的方法检测海地瓜和驼血降糖肽的降血糖功效。结果表明，当剂量组大鼠给予海地瓜和驼血降糖肽5mg/kg体重时，30天后，空腹血糖试验后与试验前具有显著性差异，且试验后平均血糖下降15.4％；试验后5mg/kg体重剂量组大鼠血糖值与模型对照组相比，差异具有显著性，说明海地瓜和驼血降糖肽具有降血糖功效。