一种建立大小鼠慢性创面模型的方法
阅读说明：本技术 一种建立大小鼠慢性创面模型的方法 (Method for establishing rat and mouse chronic wound model ) 是由 李恭驰 李炳辉 于 2021-06-21 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种建立大小鼠慢性创面模型的方法,该方法选择6-8周龄C57BL/6小鼠或SD大鼠作为模型的基础,以大小鼠背部脊柱为中线,建立直径为8mm-12mm圆形全层皮肤缺损创面,并在创面中心保留直径为3mm-5mm的圆形皮岛,在创面内缝合一个完全封闭的圆柱体形塑料隔板,从而阻挡周围细胞向创面窗口内迁移,达到防止大小鼠慢性创面收缩同时提供创缘种子细胞的目的。该模型的建立完全隔绝了创面周围组织的干扰,适合用于评估外源性因素对慢性创面愈合的作用。(The invention provides a method for establishing a chronic wound model of rats and mice, which selects C57BL/6 mice or SD rats with the age of 6-8 weeks as the basis of the model, takes the spinal columns of the backs of the rats and the mice as the central line, establishes a circular full-layer skin defect wound with the diameter of 8-12 mm, reserves a circular skin island with the diameter of 3-5 mm at the center of the wound, and sews a totally closed cylindrical plastic partition plate in the wound, thereby preventing peripheral cells from migrating into the wound window, and achieving the purpose of preventing the chronic wound of the rats and the mice from shrinking and providing wound edge seed cells. The establishment of the model completely isolates the interference of tissues around the wound surface, and is suitable for evaluating the effect of exogenous factors on the healing of the chronic wound surface.)
技术领域
本发明涉及动物实验模型技术领域，具体是一种建立大小鼠慢性创面模型的方法。
背景技术
皮肤作为人体最大的器官，在其日常及受损后的新陈代谢中，展现出较强的自我修复能力，其修复过程大致分为止血、炎症反应、增殖和重塑四个阶段。在皮肤受损最初的数小时中，伤口充血，局部红肿，有浆液渗出，渗出液中含有纤维蛋白原，可导致血凝块产生，与血管收缩、内外源凝血机制的启动协同达到止血的目的。在伤口产生的最初2-3天，局部组织缺血和坏死组织及致病微生物的存在，将引发炎症反应，又称清创阶段。该阶段主要由巨噬细胞参与吞噬溶解坏死组织。同期，在伤口边缘新生的肌纤维母细胞的牵引下，伤口边缘的整层皮肤及皮下组织将向伤口中心移动。大约于第3日，伤口边缘的基底细胞开始增生、迁移、分化，并刺激由血管内皮细胞和成纤维细胞组成的肉芽组织生成，最终覆盖于该组织表面。
随着各种慢性疾病患病率的逐年增加，包括糖尿病创面、压疮、下肢静脉性溃疡等慢性创面的发生也愈发常见，其将严重影响患者生活质量，若发生感染扩散，甚至将威胁患者生命。显然，其难治愈性、致残性、高发病率及高复发率，给各患者、家庭带来极大的精神压力与经济负担，也是社会医疗水平发展，资源合理分配的又一重大挑战。
因此，通过建立一个合理的慢性创面模型，对慢性创面的愈合展开深入探讨和研究显得极为有意义。大小鼠由于其经济及可操作性，被广泛的应用于慢性创面模型的构建。目前的创面模型主要有以下两种，一是直接构建圆形全层皮肤缺损，二是构建圆形全层皮肤缺损后，缝合一带有缺口的柱状硅胶支撑架，以形成创面窗。然而，大小鼠的主要通过创缘收缩进行创面修复，这与人类的伤口愈合模式有根本的不同。上述两种模型均不能判断伤口愈合是源于创缘细胞迁移或大小鼠创面皮肤收缩的缺陷。后者在使用缝线与创面缝合的过程中，更存在着经缝合加压后堵塞创面窗的可能，且由于模型设计缺陷，该方法构建的慢性创面在愈合过程中并不能均匀发展，不能很好的模拟人体慢性创面的愈合过程。
因此本发明提出一种建立大小鼠慢性创面模型的方法，通过建立直径为8mm-12mm圆形全层皮肤缺损创面，在创面内套一个完全封闭的圆柱体形的塑料隔板，以缝线固定，并在创面中心保留直径为3mm-5mm皮岛，达到隔绝创面周围组织的干扰、防止大小鼠慢性创面收缩的目的，同时为慢性创面的愈合提供种子细胞，使慢性创面离心性均匀愈合。上述过程更好地模拟了人类伤口愈合，消除了小鼠创面愈合过程中伤口收缩的因素，接近于人类创面修复过程中再上皮化和新组织形成的过程。该模型适用于评估外源性因素对慢性创面愈合的作用。
发明内容
本发明目的针对现有技术存在的上述不足，提供一种建立大小鼠慢性创面模型的方法，可阻挡周围细胞向创面窗口内迁移，隔绝创面周围组织的干扰，用该方法建立的大小鼠慢性创面模型成本低廉，易于复现，适合用于评估外源性细胞对创面的作用。
为实现此目的，本发明提供一种建立大小鼠慢性创面模型的方法，包括以下步骤：
步骤1)选择6-8周龄C57BL/6小鼠或SD大鼠作为模型的基础；
步骤2)异氟烷吸入麻醉；
步骤3)电推刀、脱毛膏脱去背部毛发；
步骤4)碘伏消毒后，以大小鼠背部脊柱为中线，建立圆形全层皮肤缺损创面，并在创面中心保留皮岛；
步骤5)在创面内缝合一个完全封闭的圆柱体形的塑料隔板；
步骤6)用纱布覆盖创面后，弹力绷带包扎固定，即得到所述慢性创面模型；
步骤7)模型建立后大小鼠单笼喂养，自由摄食与饮水，隔天换药，注意观察大小鼠创面状态及大小鼠状态。
进一步的，步骤1)中6-8周龄C57BL/6小鼠或SD大鼠于SPF级屏障系统喂养，在25℃±2℃温度、55％±5％湿度下交替12小时的光/暗循环，并为大小鼠提供无菌食物和水，大小鼠适应一周后进行实验。
进一步的，步骤4)建立的圆形全层皮肤缺损创面直径在8mm-12mm之间，皮岛直径在3mm-5mm之间。
进一步的，步骤4)建立的圆形全层皮肤缺损创面是包括肌腱膜在内的全层切除。
进一步的，步骤5)中缝合的圆柱体形的塑料隔板外直径为8mm-12mm，高度为3mm，厚度为1mm，使用酒精浸泡消毒。
本发明具有如下优点：
1、本发明所构建的建立大小鼠慢性创面模型，隔绝创面周围组织的干扰、防止了大小鼠慢性创面收缩，克服了以往模型中创面愈合不能判断伤口愈合是源于创缘细胞迁移或大小鼠创面皮肤收缩的缺陷，适用于评估外源性因素对慢性创面愈合的作用；
2、本发明更好地模拟了人类伤口愈合，消除了小鼠创面愈合过程中伤口收缩的因素，接近于人类创面修复过程中再上皮化和新组织形成的过程；
2、创面中心所保留的直径3mm-5mm圆形皮岛，为慢性创面的愈合提供种子细胞，并使慢性创面均匀愈合，与人体慢性创面愈合模式相类似；
3、本发明的大小鼠模型成本低廉，易于复现，大小鼠模型构建后存活率较高，为进一步深入探究慢性创面愈合提供了实用、可靠的途径。
附图说明
图1是本发明中完全封闭的圆柱体形的塑料隔板的结构示意图；
图2是本发明中小鼠慢性创面模型的创伤愈合情况图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例提供一种建立大小鼠慢性创面模型的方法，包括以下步骤：
动物的准备：取6周龄C57BL/6小鼠，于SPF级屏障系统喂养，在25℃温度、55％湿度下交替12小时的光/暗循环，并为小鼠提供无菌食物和水，小鼠适应一周后进行实验。
无菌完全封闭的圆柱体形的塑料隔板的制备：使用火焰加热后的刀片，于距离1.5毫升离心管管口3mm处将离心管切开，并去除离心管管盖。用火焰加热切口边缘，使其变得光滑。用火焰加热后的22号针，在切下的圆柱体形塑料隔板上均匀交错打出两层小洞，以便缝针缝线穿过。制备完毕后，对该塑料隔板进行酒精浸泡消毒。该完全封闭的圆柱体形的塑料隔板的结构如图1所示，其内径为8mm，高3mm，隔板厚度为1mm，小洞直径不超过1mm。
小鼠皮岛模型的建立：在异氟醚全麻下，使用电剃刀、脱毛膏脱去背部毛发。使用碘伏消毒小鼠背部皮肤3次后，使用直径为8mm的皮肤活检器蘸取印泥，于小鼠背部脊柱中线留下对应印记，使用相同方法，用直径为3mm的皮肤活检器于上述直径为8mm的印记中心，留下印记。使用剪刀沿上述印记切除小鼠皮肤和皮下组织，保留中心直径为3mm的皮岛。使用5-0的带线缝合针，将无菌完全封闭的圆柱体形的塑料隔板分层缝合于深筋膜和皮肤上，以确保固定。用纱布覆盖创面后，弹力绷带包扎固定。
观察小鼠创面状态及小鼠状态：模型建立后小鼠单笼喂养，自由摄食与饮水，隔天换药，注意观察小鼠创面状态及小鼠状态。模型制备后第0、7、21天创面及小鼠状态如图2所示。
实施例2
本发明实施例提供一种建立大小鼠慢性创面模型的方法，包括以下步骤：
动物的准备：取6周龄C57BL/6小鼠，于SPF级屏障系统喂养，在25℃温度、55％湿度下交替12小时的光/暗循环，并为小鼠提供无菌食物和水，小鼠适应一周后进行实验。
无菌完全封闭的圆柱体形的塑料隔板的制备：使用火焰加热后的刀片，于距离1.5毫升离心管管口3mm处将离心管切开，并去除离心管管盖。用火焰加热切口边缘，使其变得光滑。用火焰加热后的22号针，在切下的圆柱体形塑料隔板上均匀交错打出两层小洞，以便缝针缝线穿过。制备完毕后，对该塑料隔板进行酒精浸泡消毒。该完全封闭的圆柱体形的塑料隔板的结构如图1所示，其内径为8mm，高3mm，隔板厚度为1mm，小洞直径不超过1mm。
小鼠皮岛模型的建立：在异氟醚全麻下，使用电剃刀、脱毛膏脱去背部毛发。使用碘伏消毒小鼠背部皮肤3次后，使用直径为8mm的皮肤活检器蘸取印泥，于小鼠背部脊柱中线留下对应印记，使用相同方法，用直径为5mm的皮肤活检器于上述直径为8mm的印记中心，留下印记。使用剪刀沿上述印记切除小鼠皮肤和皮下组织，保留中心直径为5mm的皮岛。使用5-0的带线缝合针，将无菌完全封闭的圆柱体形的塑料隔板分层缝合于深筋膜和皮肤上，以确保固定。用纱布覆盖创面后，弹力绷带包扎固定。
观察小鼠创面状态及小鼠状态：模型建立后小鼠单笼喂养，自由摄食与饮水，隔天换药，注意观察小鼠创面状态及小鼠状态。模型制备后第0、7、21天创面及小鼠状态如图2所示。
实施例3
本发明实施例提供一种建立大小鼠慢性创面模型的方法，包括以下步骤：
动物的准备：取6周龄C57BL/6小鼠，于SPF级屏障系统喂养，在25℃温度、55％湿度下交替12小时的光/暗循环，并为小鼠提供无菌食物和水，小鼠适应一周后进行实验。
无菌完全封闭的圆柱体形的塑料隔板的制备：使用火焰加热后的刀片，于距离1.5毫升离心管管口3mm处将离心管切开，并去除离心管管盖。用火焰加热切口边缘，使其变得光滑。用火焰加热后的22号针，在切下的圆柱体形塑料隔板上均匀交错打出两层小洞，以便缝针缝线穿过。制备完毕后，对该塑料隔板进行酒精浸泡消毒。该完全封闭的圆柱体形的塑料隔板的结构如图1所示，其内径为10mm，高3mm，隔板厚度为1mm，小洞直径不超过1mm。
小鼠皮岛模型的建立：在异氟醚全麻下，使用电剃刀、脱毛膏脱去背部毛发。使用碘伏消毒小鼠背部皮肤3次后，使用直径为10mm的皮肤活检器蘸取印泥，于小鼠背部脊柱中线留下对应印记，使用相同方法，用直径为5mm的皮肤活检器于上述直径为10mm的印记中心，留下印记。使用剪刀沿上述印记切除小鼠皮肤和皮下组织，保留中心直径为5mm的皮岛。使用5-0的带线缝合针，将无菌完全封闭的圆柱体形的塑料隔板分层缝合于深筋膜和皮肤上，以确保固定。用纱布覆盖创面后，弹力绷带包扎固定。
观察小鼠创面状态及小鼠状态：模型建立后小鼠单笼喂养，自由摄食与饮水，隔天换药，注意观察小鼠创面状态及小鼠状态。模型制备后第0、7、21天创面及小鼠状态如图2所示。
皮肤创面愈合的实验硏究常用大小鼠作动物创面模型，由于大小鼠创面具有收缩的特点，该模型创面的愈合是创缘细胞的迁移还是大小鼠创面皮肤的收缩所致，一直是业内的争议的焦点。为解决实验研究这一模型难题，本发明提出一种建立大小鼠慢性创面模型的方法，属于实验模型领域。该方法选择6-8周龄C57BL/6小鼠或SD大鼠作为模型的基础，以大小鼠背部脊柱为中线，建立直径为8mm-12mm圆形全层皮肤缺损创面，并在创面中心保留直径为3mm-5mm的圆形皮岛。在创面内缝合一个完全封闭的圆柱体形塑料隔板，从而阻挡周围细胞向创面窗口内迁移，达到防止大小鼠慢性创面收缩同时提供创缘种子细胞的目的。
如图2所示，构建直径为8mm-10mm全层皮肤损伤创面模型或直径为8mm-10mm全层皮肤缺损创面并保留中央直径为3mm-5mm的皮岛模型，上述两种创面模型皆于第21天接近完全愈合，并伴有毛发生长，不能满足慢性创面的研究要求。若仅构建直径为8mm-10mm全层皮肤缺损创面并在创面内缝合一个完全封闭的圆柱体形塑料隔板，则未提供创面修复的种子细胞，同样无法满足慢性创面的研究要求。如图2所示，在小鼠背部脊柱中线构建本发明所述模型，在模型构建后第21天，创面未见明显愈合，中央皮岛少许回缩，数个模型中皮岛均血供充足，保持活性，可为创面修复提供创缘种子细胞，充分说明该模型的建立完全隔绝了创面周围组织的干扰，适合用于评估外源性因素对慢性创面愈合的作用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
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