化学免疫联合治疗纳米药物的制备方法及应用
阅读说明：本技术 化学免疫联合治疗纳米药物的制备方法及应用 (Preparation method and application of nano-drug for chemo-immune combination therapy ) 是由 邹艳 刘艳杰 师冰洋 郑蒙 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了化学免疫联合治疗纳米药物的制备方法及应用,涉及医药技术领域。本发明将TMZ和BET溴结构域抑制剂共装载的血红细胞膜伪装仿生纳米药物。仿生纳米药物作为一种多功能纳米平台,不仅可以增强血液循环时间和BBB的通透性,共递送的BET溴结构域抑制剂可通过提高TMZ敏感性降低癌细胞的增殖。BET溴结构域抑制剂可以抑制GBM肿瘤细胞DNA损伤修复,从而增强TMZ的药效。TMZ化疗和OTX均能能刺激体内免疫系统被激活,BET溴结构域抑制剂能破坏免疫抑制性PD-L1/PD-1轴,招募T细胞攻击肿瘤,诱导抗肿瘤免疫应激反应,达到化疗与免疫联合治疗的效果。(The invention discloses a preparation method and application of a chemo-immune combination therapy nano-drug, and relates to the technical field of medicines. The invention discloses a red blood cell membrane camouflage bionic nano-drug co-loaded with a TMZ (Tetramethylbenzidine) and BET (BET bromodomain inhibitor). The bionic nano-drug serving as a multifunctional nano-platform can enhance the blood circulation time and the permeability of BBB, and the co-delivered BET bromodomain inhibitor can reduce the proliferation of cancer cells by improving the TMZ sensitivity. The BET bromodomain inhibitor can inhibit the DNA damage repair of GBM tumor cells, thereby enhancing the drug effect of TMZ. TMZ chemotherapy and OTX can stimulate the immune system in vivo to be activated, and the BET bromodomain inhibitor can destroy the axis of immunosuppressive PD-L1/PD-1, recruit T cells to attack tumors, induce anti-tumor immune stress response, and achieve the effect of chemotherapy and immune combined treatment.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及化学免疫联合治疗纳米药物的制备方法及应用。
背景技术
替莫唑胺(TMZ)是目前治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)的一线化疗药物。虽然TMZ常规化疗在一定程度上能改善疗效，但由于GBM肿瘤细胞DNA自我修复机制的存在，导致GBM患者对TMZ极易产生耐药，这使得TMZ的药效大打折扣。因此，通过抑制肿瘤细胞DNA修复从而降低GBM对TMZ的耐药，对提高GBM的化疗疗效起着举足轻重的作用。
最近，利用免疫调节来治疗肿瘤引起了研究者们广泛关注。免疫疗法，如肿瘤疫苗、免疫检查点阻断疗法和CAR-T，在治疗不同类型的癌症(包括黑色素瘤、白血病和GBM)方面显示出令人鼓舞的临床结果。免疫治疗策略中，基于PD1/PD-L1免疫检查点抑制剂的阻断疗法，为癌症治疗的治疗带来了新的希望。然而，商业PD1抗体(如：纳武单抗，派姆单抗)对GBM患者的治疗效果有限，只有不到10％的患者长期有响应。主要原因归结于GBM的肿瘤微环境中免疫抑制细胞因子水平较高，T细胞浸润性较差，因此，将“冷”的免疫抑制性GBM转化为T细胞炎症性的“热”肿瘤在逆转免疫抑制及GBM免疫治疗中起着关键作用。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供化学免疫联合治疗纳米药物的制备方法及应用以解决上述技术问题。
溴结构域蛋白4(Brd4)是溴区结构域和超末端家族蛋白家族中最重要的功能蛋白。有研究发现，Brd4与DNA修复密切相关，抑制Brd4能够降低多种细胞对DNA损伤修复的反应。此外，Brd4能够降低肿瘤细胞表面PD-L1的表达。多种Brd4抑制剂(如JQ1，OTX015等)因为细胞水平上展示出良好的抗肿瘤效果，已经被用于GBM临床研究。但由于裸露的Brd4抑制剂的药代动力学短和疏水性强等原因，临床实验效果并不理想。
基于Brd4抑制剂，发明人利用纳米药物装载BET溴结构域抑制剂，抑制GBM肿瘤细胞DNA损伤修复，从而增强TMZ的药效。我们开发了一种将TMZ和BET溴结构域抑制剂共装载的血红细胞膜伪装仿生纳米药物([email protected]/OTX)。该仿生纳米药物作为一种多功能纳米平台，不仅可以增强血液循环时间和BBB的通透性，共递送的BET溴结构域抑制剂可通过提高TMZ敏感性降低癌细胞的增殖。此外，TMZ化疗和BET溴结构域抑制剂均能刺激体内免疫系统被激活，BET溴结构域抑制剂能破坏免疫抑制性PD-L1/PD-1轴，招募T细胞攻击肿瘤，诱导抗肿瘤免疫应激反应，达到化疗与免疫联合治疗的效果。在荷原位GL261脑肿瘤的小鼠中，[email protected]/OTX的治疗显著抑制了肿瘤生长并显著延长了小鼠的存活期，且副作用小。
具体地，本发明是这样实现的：
本发明提供了一种仿生纳米药物，其包括内核和包覆于内核外的外壳，内核包括第一组分、第二组分和载体，第一组分包括替莫唑胺，第二组分包括BET溴结构域抑制剂，载体为pH敏感纳米粒子；
外壳包括红细胞膜、癌细胞膜、免疫细胞膜或血小板，生物膜上修饰有靶向剂，以使仿生纳米药物能够靶向目标细胞。
利用第一组分(TMZ)化疗能激活体内免疫反应，第二组分(BET溴结构域抑制剂)不仅干扰细胞增殖，而且可以阻止DNA修复从而增加肿瘤对TMZ的敏感性，增强TMZ药效。此外，BET溴结构域抑制剂能抑制PD-L1的表达，招募T细胞攻击肿瘤，诱导抗肿瘤免疫应激反应，达到化疗与免疫联合治疗的效果。
上述载体可以满足仿生纳米药物在特定pH环境下实现药物的释放。
外壳上采用红细胞膜，具有无免疫原性的特性，在生物膜上修饰靶向剂可以靶向目标细胞，实现药物的精准靶向。在其他实施方式中，生物膜可以选自细胞膜、细菌膜和病毒膜中的一种以上。
本发明提供的仿生纳米药物能够改善BBB渗透性，增加肿瘤积累和血液滞留，实现肿瘤微环境响应的药物释放，共递送的BET溴结构域抑制剂可通过提高TMZ敏感性降低癌细胞的增殖。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述BET溴结构域抑制剂是指选自如下至少一种蛋白的抑制剂：BRD2、BRD3、BRD4和BRDT；
优选地，BET溴结构域抑制剂为BRD4的抑制剂；
优选地，BRD4的抑制剂选自如下至少一种的抑制剂或如下任一种抑制剂的可药用的盐或溶剂化物：植物多酚-白藜芦醇的衍生物、异恶唑结构BRD4抑制剂、苯并氮卓类BRD抑制剂、吡啶酮类BRD4靶向抑制剂、JQ1、CeMMEC2、PF-1、bromosporine、OTX-015、TEN-010、BI2536、TG101348和LY294002。
优选地，异恶唑结构BRD4抑制剂选自CPI-203或CPI-0610；苯并氮卓类BRD抑制剂选自I-BET 151或I-BET 762；植物多酚-白藜芦醇的衍生物选自RVX-208；吡啶酮类BRD4靶向抑制剂选自ABBV-075。
此外，在其他实施方式中，只要能实现BET家族成员蛋白的表达失调均在本发明的发明构思范围内，可以作为上述BET溴结构域抑制剂，而不限于上述列举的几种抑制剂的选择。
本发明的范围包括根据本发明使用的化合物的所有可药用的盐形式，其可以例如通过带有易于质子化的孤电子对的原子的质子化，如氨基与无机或有机酸形成，或作为酸基团(如羧酸基团)与生理学上可接受的阳离子形成的盐。示例性的碱加成盐包括，例如：碱金属盐，如钠盐或钾盐；碱土金属盐，如钙盐或镁盐；锌盐；铵盐；脂肪胺盐，如三甲胺、三乙胺、二环己胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、普鲁卡因盐、葡甲胺盐、乙二胺盐或胆碱盐；芳烷基胺盐，如N，N-二苄基乙二胺盐、苄星青霉素盐、苯乙苄胺盐；杂环芳香胺盐，如吡啶盐、甲基吡啶盐、喹啉盐或异喹啉盐；季铵盐，如四甲基铵盐、四乙基铵盐、苄基三甲基铵盐、苄基三乙基铵盐、苄基三丁基铵盐、甲基三辛基铵盐或四丁基铵盐；和碱性氨基酸盐，如精氨酸盐、赖氨酸盐或组氨酸盐。示例性的酸加成盐包括，例如：无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐(如硫酸盐或硫酸氢盐)、硝酸盐、磷酸盐(如磷酸盐、磷酸氢盐、或二氢磷酸盐)、碳酸盐、碳酸氢盐、高氯酸盐、硼酸盐或硫氰酸盐；有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、戊酸盐、己酸盐、庚酸盐、辛酸盐、环戊烷丙酸盐、癸酸盐、十一酸盐、油酸盐、硬脂酸盐、乳酸盐、马来酸盐、草酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、己二酸盐、葡糖酸盐、乙醇酸盐、烟酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、抗坏血酸盐、双羟萘酸盐(embonate)、樟脑酸盐(camphorate)、葡庚酸盐(glucoheptanoate)或新戊酸盐；磺酸盐如甲磺酸盐(甲磺酸盐)、乙磺酸盐(乙磺酸盐)、2-羟基乙磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、苯磺酸盐(苯磺酸盐)、对甲苯磺酸盐(甲苯磺酸盐)、2-萘磺酸盐(萘磺酸盐)、3-苯磺酸盐、或樟脑磺酸盐；甘油磷酸盐；和酸性氨基酸盐，如天冬氨酸盐或谷氨酸盐。
此外，本发明的范围包括任何溶剂化物形式的根据本发明使用的化合物，包括例如用水的溶剂化物(即，作为水合物)或用有机溶剂的溶剂化物，如，例如甲醇、乙醇或乙腈(即，作为甲醇化物、乙醇化物或乙腈化物)，或任何结晶形式(即，作为任何多晶型物)或无定形形式的根据本发明使用的化合物。应理解，根据本发明使用的化合物的这些溶剂化物还包括各化合物的可药用盐的溶剂化物。
此外，根据本发明使用的化合物可以以不同异构体的形式存在，特别是立体异构体(包括例如几何异构体(或顺式/反式异构体)、对映异构体和非对映异构体)或互变异构体。本说明书中提到的化合物的所有这些异构体都被认为是本发明的一部分，其可以是混合物、也可以是纯的或基本上纯的形式。关于立体异构体，本发明包括根据本发明使用的化合物的分离的光学异构体及其任何混合物(包括，特别是外消旋混合物/外消旋体)。外消旋体可通过物理方法解析，如，例如分步结晶、非对映异构衍生物的分离或结晶、或通过手性柱色谱法分离。也可以通过与光学活性酸形成盐然后结晶从外消旋体获得各个光学异构体。本发明还包括本文提供的化合物的任何互变异构体。
本发明的范围还包括根据本发明使用的化合物，其中一个或多个原子被相应原子的特定同位素取代。例如，本发明包括本说明书中提及的化合物的用途，其中一个或多个氢原子(或例如所有氢原子)被氘原子(即，2H；也称为“D”)取代。因此，本发明还包括根据本发明使用的富含氘的化合物。天然存在的氢是同位素混合物，其包含约99.98mol％的氢-1(1H)和约0.0156mol％的氘(2H或D)。使用本领域已知的氘化技术可以增加根据本发明使用的化合物中一个或多个氢位置中的氘含量。例如，本说明书中提及的化合物或用于合成相应化合物的反应物或前体可以使用例如重水(D2O)进行H/D交换反应。其他合适的氘化技术描述于：Atzrodt J等人,Bioorg Med Chem,20(18),5658-5667,2012；William JS等人,Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals,53(11-12),635-644,2010；Modvig A等人,J Org Chem,79,5861-5868,2014。可以例如使用质谱法或NMR光谱法测定氘的含量。除非另外特别指出，否则优选根据本发明使用的化合物不富含氘。因此，优选在根据本发明使用的化合物中存在天然存在的氢原子或1H氢原子。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述目标细胞为胶质母细胞瘤细胞。
在一种实施方式中，上述的靶向剂为DSPE-PEG-ApoE，靶向剂是通过DSPE与生物膜共价连接，DSPE-PEG-ApoE是由DSPE-PEG-Mal与载脂蛋白E多肽反应制得。
DSPE-PEG-Mal(磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺)，载脂蛋白E多肽均选自市售的产品。在其他实施方式中，PEG的分子量可以根据需要进行自适应调整，例如可以是2000，5000，10000等。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述仿生纳米药物中第一组分的理论载药量为1-40wt.％，仿生纳米药物中第二组分的理论载药量为1-40wt.％。可选的，第一组分的理论载药量为5-30wt.％，仿生纳米药物中第二组分的理论载药量为5-30wt.％。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述pH敏感纳米粒子为a-葡聚糖、碱木质素或木质素大分子衍生物；
优选地，木质素大分子衍生物通过物理化学方法将高分子引入木质素大分子中所得到的木质素大分子衍生物中的一种或多种。
在一种实施方式中，通过物理化学法等引入木质素大分子中的高分子，包括聚乙二醇，聚甘油，聚乙烯醇，聚丙烯酸，聚乳酸，聚羟基乳酸、聚己酸丙酯、乳酸乙醇酸共聚物、聚羟基丁酸酯中的一种或多种。
在一种实施方式中，上述pH敏感纳米粒子也可以是一种pH敏感性的纳米复合水凝胶，其材料是以碱木质素或其衍生物为原料制备纳米粒子，随后与传统水凝胶材料混合，制备得到pH敏感性的纳米复合水凝胶。
本发明提供了一种仿生纳米药物的制备方法，其包括在内核外包覆生物膜以制备仿生纳米药物。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法包括分别制备内核和在内核外周包覆生物膜以形成外壳；
内核的制备是将第一组分、第二组分和载体混合，制得内核；生物膜的修饰是指，将生物膜与靶向剂混合制得修饰有靶向剂的生物膜；
优选地，内核制备时，待第一组分、第二组分和载体混合后，蒸发载体的溶剂，透析去除未包载的第一组分和第二组分；
生物膜的修饰是指，先将DSPE-PEG-Mal与载脂蛋白E多肽反应制得靶向剂DSPE-PEG-ApoE，然后将靶向剂DSPE-PEG-ApoE与生物膜混合孵育。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述内核与具有修饰剂的生物膜混合，用滤膜挤压；
优选地，采用100-200nm的滤膜挤压。
本发明提供了一种仿生纳米药物在如下至少一种情形的应用：
(1)制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用；(2)在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用；
优选地，应用为仿生纳米药物制备肿瘤多药耐药逆转剂、制备抗肿瘤药物增敏剂、或制备复发肿瘤治疗剂中的应用；
优选地，应用为仿生纳米药物作为肿瘤多药耐药逆转剂或抗肿瘤药物增敏剂在制备用于联合治疗耐药肿瘤的药物中的应用。
优选地，肿瘤细胞为人脑胶质瘤。
本发明提供了一种化学免疫联合治疗制剂，其包括仿生纳米药物。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种将TMZ和BET溴结构域抑制剂共装载的血红细胞膜伪装仿生纳米药物。该仿生纳米药物作为一种多功能纳米平台，不仅可以增强血液循环时间和BBB的通透性，共递送的BET溴结构域抑制剂可通过提高TMZ敏感性降低癌细胞的增殖。BET溴结构域抑制剂可以抑制GBM肿瘤细胞DNA损伤修复，从而增强TMZ的药效。
此外，TMZ化疗和OTX均能刺激体内免疫系统被激活，BET溴结构域抑制剂能破坏免疫抑制性PD-L1/PD-1轴，招募T细胞攻击肿瘤，诱导抗肿瘤免疫应激反应，达到化疗与免疫联合治疗的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为[email protected]/OTX对GL261诱导的抗肿瘤免疫反应和增强的TMZ化学免疫疗法的示意图；
图2为仿生纳米粒子的表征图；
图3为通过WB测定GL261和正常HA1800星形胶质细胞中LRP1和LDLR的蛋白表达量；
图4为[email protected]/OTX在37℃的pH 5.0和pH 6.5醋酸缓冲液或pH 7.4磷酸盐缓冲液中(a)TMZ和(b)OTX累积释放的比例；
图5为细胞中γH2AX DNA损伤病灶的免疫荧光图像以及协同效果验证实验结果图；
图6流式细胞术分析[email protected]下调GL261细胞膜上PD-L1的表达(OTX:400nM)；
图7CLSM分析TMZ诱导的钙网蛋白在GL261细胞的转位(OTX:400nM,TMZ:150μM),标尺＝10μm；
图8为流式细胞术检测结果和细胞中纳米粒子定位图；
图9为荷原位GL261-Luc肿瘤C57BL/6小鼠在注射[email protected]、[email protected]和[email protected](DiR剂量:0.2mg/kg)后不同时间点的体内荧光成像以及各器官的荧光成像图；
图10单剂量注射[email protected]/OTX后小鼠血清中(a)IFN-γ、(b)TNF-α、(c)和IL-6的浓度；
图11单次注射[email protected]/OTX、[email protected]、[email protected]、自由TMZ/OTX、自由的TMZ(TMZ:5mg/kg,OTX:5mg/kg)和PBS至原位荷瘤GL261-Luc小鼠中免疫细胞的含量(a)成熟的DC细胞(CD11c+CD80+CD86+)。(b)肿瘤和(c)血液中T细胞(CD3+CD4+CD8+)的含量；
图12为抗肿瘤疗效研究时间表示意图和生物荧光定性的结果图；
图13为经治疗后各组小鼠生物发光的定量结果和小鼠的体重变化、小鼠存活率数据；
图14经治疗后各组小鼠生物发光的全脑H&切片；
图15TUNEL分析和免疫组织化学染色，用于分析经过治疗后的小鼠肿瘤切片中γH2AX、凋亡(CC3)、增殖(Ki67)、PD-L1、CD4+和CD8+的含量，标尺＝200μm；
图[email protected]/OTX、[email protected]、[email protected]、自由TMZ/OTX、自由TMZ或PBS治疗治疗后的第22天，对GL261小鼠的切片进行H&E染色图片，标尺：200μm；
图17复发GL261-luc荷瘤小鼠模型的建立及治疗示意图和不同处理后带有原位GL261-Luc肿瘤的小鼠的生物荧光成像；
图18(a)小鼠原位GL261-Luc肿瘤负荷的定量发光水平，(b)体重变化(n＝8，数据表示为平均标准差，**p<0.01)，(c)存活率；
图19小鼠脾脏中产生记忆T细胞的(a)流式分析图和(b)比例统计、血液中T细胞的流式分析图(c)和(d)比例统计以及肿瘤中T细胞的流式分析图(e)和(f)比例统计；
图[email protected]/OTX的体内生物相容性评估。(a-i)血生化血常规检查。肝脏(j-l)和肾脏(m-o)中促炎症因子Il-1β、Il-6和TNF-α的表达。数据表示为平均标准差(n＝3)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
本发明实施例以及实验例所使用的实验材料如下：
载脂蛋白E多肽[ApoE，(LRKLRKRLL)2C]购自中国肽股份有限公司(中国苏州)。OTX015购自APExBIO(美国休斯顿)。RIPAy裂解液、蛋白酶抑制剂、红细胞裂解液购自碧云天。FITC-葡聚糖购自sigma。流式抗体anti-CD11c-FITC、anti-CD80-PE，anti-CD86-APC、anti-CD3-PerCP-Cy5.5、anti-CD4-FITC、anti-CD8-PE、anti-CD3-FITC、anti-CD8-PerCP-Cy5.5、anti-CD62L-APC和anti-CD44-PE均购自eBioscience公司。LRP1,LDLR、PD-L1、同型对照IgG和β-actin抗体购自Abcam公司，γH2AX抗体购自EMD Millipore公司。钙网蛋白抗体，Alexafluor二抗和抗淬灭剂购自赛默飞。GL261-luc细胞由陕西师范大学张磊教授馈赠。BALB/c、C57BL/6动物小鼠购自斯贝福公司。TMZ和OTX的含量由高效液相色谱(安捷伦，1260)检测，选用瑞士布鲁克的核磁共振波谱仪(400MHz)对化合物进行核磁共振氢谱(1HNMR)测定、纳米颗粒的形貌由透射电子显微镜(TEM)在120kV的加速电压下测得。将10μL纳米药物溶液滴加到铜网上，10min后向铜网中加入一滴1％醋酸铀酰染色剂，染色后水洗5次，样品干燥后使用TEM测试。高速流式细胞分选仪(FACS)均购买于美国赛默飞、观察细胞内的荧光图片主要通过激光扫描共聚焦显微镜(CLSM，German Zeiss)拍摄。
实施例1
本实施例提供了一种仿生纳米药物，由内核和外壳组成，内核包括第一组分、第二组分和载体，第一组分为替莫唑胺，第二组分为BRD4蛋白的抑制剂(本实施例为OTX-015)，载体为a-葡聚糖，外壳为红细胞膜，且在红细胞膜上修饰有靶向剂以使仿生纳米药物靶向目标细胞。靶向剂为DSPE-PEG-ApoE。
仿生纳米药物的制备方法如下：
(1)内核(NM)的制备：
将1mg的a-dextran(即为acetal-dextran(acetal-葡聚糖))溶于200μL THF中，分别按照10％、20％的理论载药量(DLC(wt.％)＝(药量/药和聚合物的总量)×100)分别加入OTX015和TMZ。混匀后逐滴滴加到pH为8的水溶液中，将溶液在室温下搅拌3h，使THF完全挥发，透析除去未载上的OTX和TMZ，即可获得酸敏感载药的纳米药物[email protected]/OTX。
TMZ和OTX的DLC的定量方法如下：将载药纳米粒冷冻干燥或是直接溶解在DMSO中，然后由高效液相色谱(吸收260nm)测定。基于已知浓度的TMZ/DMSO、OTX/DMSO绘制的标准曲线可计算TMZ和OTX的DLC。
a-dextran的反应需要在无水无氧条件下进行，具体过程如下：将1g葡聚糖加入10mL DMSO中搅拌至其完全溶解，再加入37mmol二乙氧基丙烯充分混合后，加入15.6mgPPTS催化该反应。在常温下反应30min后，加入1mL三乙胺终止该化学反应，将溶液逐滴滴加到冷的去离子水中(pH＝8)进行沉淀反应，离心收集沉淀(8000rpm，10min)，反复洗涤3次后冷冻干燥。
(2)DSPE-PEG-ApoE的制备方法如下：将DSPE-PEG-Mal与巯基ApoE(摩尔比1:3)在PBS缓冲液中搅拌24h，透析除去未反应上的游离多肽并冷冻干燥得到产物DSPE-PEG-ApoE。
(3)红细胞膜的提取方法参照(Yan Zou,Effective and Targeted HumanOrthotopic Glioblastoma Xenografts Therapy via a Multifunctional BiomimeticNanomedicine.Advanced Materials,2018,30,e1803717.)，我们将提取好的红细胞膜(100μL血液得到的细胞膜)和靶向剂DSPE-PEG-ApoE(40μg)混匀后放在摇床中(200rpm)孵育30min，然后将其水浴超声5min，分别过400nm和200nm滤膜得到ApoE靶向修饰的RBCm(AB)。
(4)将[email protected]/OTX(1mg)与ApoE靶向修饰的RBCm(AB)混合后，在200nm滤膜下反复挤压7次最终得到仿生纳米药物[email protected]/OTX，其粒径和形貌可由DLS、TEM测定。制得的仿生纳米药物[email protected]/OTX参照图1所示。
实验例1
本实验例对实施例1制备的仿生纳米粒子进行DLS测定以及TEM观察。
α-dextran装载TMZ和OTX通过自组装得到酸敏感纳米药物内核([email protected]/OTX)。TMZ和OTX通过HPLC测定载药能力。[email protected]/OTX中TMZ和OTX的实际载药量(DLC)分别为6.7％和7.6％。
通过引入ApoE作为靶向配体，来修饰RBCm囊泡，得到功能化ApoE-RBCm。ApoE多肽可以与肿瘤细胞上存在的LDLR和LRP1特异结合，从而增强肿瘤摄取。采用超声的方法在[email protected]/OTX的表面上包覆ApoE-RBCm，得到最终的仿生纳米药物[email protected]/OTX。仿生纳米药物的尺寸为186nm(图2(a))，比未包裹前的纳米药物(168nm)大18nm，与报道的细胞膜的厚度一致，进一步使用透射电子显微镜观察到[email protected]/OTX核壳结构的完整性(图2(b))，NM(左)和ABNM(右)，标尺：50nm。
实验例2
为了研究低密度脂蛋白受体家族(即低密度脂蛋白受体(LDLR)和LRP1)是否在GL261细胞中过度表达，我们在GL261肿瘤细胞和正常的HA1800星形胶质细胞中进行了WB分析。具体地，本实验例对GL261细胞表面受体进行检测。
通过蛋白质印迹法(Western blot,WB)测定LRP1和LDLR在GL261胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞(HA1800)上的表达水平。将GL261和HA1800细胞裂解液后，离心后取上清，然后通过BCA进行蛋白定量。然后将等量的不同细胞的总蛋白样品与样品装载缓冲液(5×)混合，100℃变性5min，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳。电泳结束后，电转1h将凝胶转移到聚乙烯膜上，随后用5％脱脂牛奶封闭，然后用一抗孵育过夜(LRP1或LDLR)，接着孵育二抗，上述每个过程用含吐温-20的TBST洗涤三次。在Bio-Rad ChemiDocMP系统上使用ECL发光液以获得目的条带的信号。
结果表明GL261肿瘤细胞过度表达LRP1和LDLR，而正常的星形胶质细胞(HA 1800)的表达则相对较弱(图3)。据文献报道，ApoE可特异识别LDLR及LRP1蛋白。因此，使用ApoE修饰纳米药物可以与LDLR和LRP1高表达的GL261细胞特异性识别，对GL261具有高效的主动靶向能力。
实验例3
本实验例进行[email protected]/OTX的体外药物释放和细胞毒性实验。
[email protected]/OTX体外释放实验在37℃摇床中进行，在避光条件下进行，将600μL的[email protected]/OTX加入透析袋(Spectra/Pore，MWCO 12000)内，然后将透析袋放到50mL的圆底离心管中，接着分别向管内加入相同体积的(25mL)的PBS缓冲液(pH 7.4)和醋酸钠缓冲溶液(pH 5.0和6.5)，在37℃，200rpm/min的摇床中模拟体内生理环境。在规定的时间点，从离心管中取出5mL的溶液，并补加相同体积的新鲜缓冲液。
释放介质中TMZ和OTX的量由高效液相色谱测定。释放结果为三个平行样的平均值。
细胞毒性实验中，将GL261铺在96孔板内(5×103细胞/孔)中培养24h，然后加入含有10μL空载体[email protected]的DMEM(100μL)溶液，孵育48h后，检测细胞存活度。
为了评估TMZ与OTX的协同效果，我们将含不同浓度的TMZ(0-160μM)和OTX(0-1.6μM)纳米粒子和自由药物加入GL261细胞中，在5％的CO2、37℃条件下孵育72h后，加入MTT，测细胞存活度。
[email protected]/OTX体外药物释放结果显示，TMZ和OTX的释放是pH响应的，在pH 5.0的条件下，24h内分别有67％和72％的药物释放(TMZ和OTX分别对应图4(a)和(b))，结果以平均标准偏差(n＝3)表示。但在pH 7.4的条件下，[email protected]/OTX药物释放速度(小于20％)受到显著抑制，表明该纳米药物释放的pH响应性，同时也说明RBCm的修饰对TMZ和OTX释放几乎没有影响。
实验例4
本实验例进行细胞协同实验，目前GBM化疗的金标准是使用可以诱导DNA损伤的烷化剂TMZ。研究发现，Brd4抑制剂可以在细胞水平调节多种癌细胞系的DNA损伤反应。由于胶质瘤对TMZ极易产生耐药性，我们假设使用Brd4抑制剂会干扰DNA损伤后的自我修复，从而增加胶质瘤对TMZ的敏感性。通过如下实验证明GL261胶质瘤细胞系对Brd4抑制剂的敏感性。
将GL261细胞在6孔板内(1×106细胞/孔)培养24h后，加入100μL的FITC标记的[email protected]、[email protected]和NM(FITC浓度：0.5μg/mL)的PBS溶液孵育4h，吸走样品洗涤后用胰酶消化细胞，然后将GL261细胞分散在500μL PBS中，进行流式细胞仪检测，用FlowJo软件分析数据。
为了研究[email protected]的细胞定位，将GL261细胞铺于共聚焦培养皿里(1×105细胞/孔)培养24h后，加入50μL的[email protected]、[email protected]和NM(FITC浓度：0.5μg/mL)，孵育4h后。将培养基移除用PBS清洗两遍。用4％的多聚甲醛固定15min后清洗2次，然后用DAPI染细胞核10min，再清洗两次。荧光图片由激光共聚焦显微镜拍摄获得。
我们在用400nM自由的OTX处理GL261细胞72h后，观察到细胞中γH2AX DNA损伤灶的形成(图5(a))。图5a为[email protected]/OTX、[email protected]、[email protected]、自由的TMZ/OTX、自由的OTX和自由的TMZ对GL261处理72h后的细胞中γH2AX DNA损伤病灶的免疫荧光图像(OTX:400nM，TMZ:150μM)，比例尺＝10μm。结果表明：在使用150μM自由的TMZ处理的细胞中也观察到了DNA损伤病灶，当用自由的OTX和TMZ处理细胞时，观察到细胞中DNA的损伤显著增加(图5(a))。TMZ和OTX共载的纳米药物[email protected]/OTX处理的GL261细胞DNA损伤效果远远强于单载的[email protected]、[email protected]和自由的药物，证实了[email protected]/OTX仿生纳米药物共递送引起更强的DNA损伤，提高TMZ药效。
为了进一步探索TMZ和OTX共装载的协同效应，我们在GL261细胞中进行了细胞毒性测定。图5b为[email protected]/OTX、[email protected]、[email protected]对GL261处理72h细胞的存活率,TMZ浓度:0-160μM，OTX浓度：0-1.6μM。图5c为[email protected]/OTX、[email protected]、[email protected]处理72h后细胞的Fa-CI图。图5d为自由的TMZ/OTX、自由的TMZ和自由的OTX对GL261处理72h后的细胞的存活率,TMZ浓度:0-160μM，OTX浓度：0-1.6μM。图5e为自由的TMZ/OTX、自由的TMZ和自由的OTX对GL261处理72h后细胞的Fa-CI图。
结果显示，与单独载药的纳米药物相比(图5(d))，[email protected]/OTX在GL261细胞中表现出增强的细胞毒性(图5(b))，使用Chou-Talalay方法计算[email protected]/OTX、[email protected]、[email protected]处理后的协同指数(CI)，在不同的抑制率(Fa,Fa＝1-细胞存活率)下，其CI值在0.2-0.8之间(图5(c))，表明[email protected]/OTX的TMZ和OTX联合给药实现了抗肿瘤活性的增强(CI＜I协同，CI＝I相加，CI＞I拮抗)。由于自由药物TMZ与OTX物理混合联合用药在Fa较低的时协同作用明显，随着Fa的增加，两种自由药物具有协同作用逐渐减弱，表现出轻微的协同作用(图5(e))。以上数据表明单一药物OTX或TMZ治疗在胶质瘤细胞中能抑制细胞增值，但抑制程度有限，但OTX和TMZ的共递送可提高细胞损伤效果，纳米药物装载后协同效果增强，这可能与纳米药物缓慢释放的性质有关。该数据与图5(a)结果一致，即OTX和TMZ的联用比使用单一药物效果显著，这主要归结于共递送的OTX能抑制DNA修复，进而增强TMZ药效。
实验例5
本实验例进行PD-L1抑制实验和钙网蛋白检测。
为了研究OTX诱导的PD-L1在GL261细胞膜上的表达情况，将GL261细胞种在6孔板内(1×106细胞/孔)培养24h后，加入[email protected]/OTX或自由OTX在400nM浓度下孵育72h。收集细胞孵育PD-L1抗体和同型对照IgG的抗体，30min后洗涤，然后用流式细胞术检测PD-L1细胞表面在GL261细胞上的表达情况。
结果显示，在OTX浓度为400nM的时候，仿生纳米药物[email protected]通过递送Brd4抑制剂OTX，完全抑制了GL261细胞中PD-L1表达(图6)，其效果与自由的OTX类似，表明[email protected]/OTX具有高效的PD-L1抑制效果，这为体内免疫治疗奠定了坚实的基础。
采用细胞免疫荧光技术研究TMZ和OTX引发的钙网蛋白转位。步骤如下：将GL261铺在CLSM培养皿中(1×105细胞/孔)，然后加入[email protected]/OTX,[email protected],[email protected]，游离TMZ，游离OTX以及游离TMZ和OTX(TMZ和OTX的浓度分别为150μM和400nM)。孵育72h后，去除培养基，加入4％多聚甲醛固定细胞，然后用Triton X-100通透处理10min，接着用山羊血清封闭1h，随后加入钙网蛋白一抗4℃孵育过夜，然后孵育Alexa 488二抗和细胞核染料，室温下孵育1h。上述过程均用PBS洗涤3次。在载玻片加入5μL抗淬灭剂，将盖玻片扣在载玻片上，图像用CLSM拍摄。
钙网蛋白是体内免疫反应的重要信号，通过细胞免疫荧光技术检测，其结果显示，与自由药物和单载TMZ及OTX的纳米药物相比，[email protected]/OTX引起钙网蛋白转位的程度最高(图7)，说明TMZ和OTX具有激活体内免疫反应并进行胶质瘤治疗的潜力。
实验例6
[email protected]/OTX引发的DNA损伤实验
我们采用CLSM来观察[email protected]/OTX对GL261细胞DNA的损伤情况。将GL261细胞铺在CLSM培养皿中(1×105细胞/孔)，培养24h。加入100μL [email protected]/OTX,[email protected],[email protected]，游离TMZ，游离OTX以及游离TMZ/OTX孵育72h，上述过程中TMZ和OTX的浓度分别为150μM和400nM。孵育72h后，去除培养基，接下来免疫荧光的操作同骤同实验例5，唯一不同的是将其中的一抗换成γH2AX抗体。
用FITC标记的m-dextran用于研究ABNM在GL261细胞的摄取和细胞内药物释放情况。流式细胞实验结果证明[email protected]能够被细胞有效摄取，其荧光强度分别是无靶向组[email protected]和裸露纳米粒子NM的2.3和2.8倍(图8(a))。图8a为用ABNM、BNM、NM孵育4h后，对GL261细胞进行流式细胞术检测(FITC浓度：0.5μg/mL)。
此外，在与ABNM孵育4h后，在GL261细胞的细胞质中观察到明显的FITC荧光，其强度远远强于BN或NM(图8(b))，证实了仿生纳米药物修饰上ApoE多肽后，对GL261细胞具有受体介导的高效内吞和主动靶向能力。图8b为用ABNM、BNM、NM处理4h的GL261细胞中纳米粒子的细胞内定位，标尺＝10μm。
实验例7
为了评估仿生纳米药物的体内肿瘤靶向能力，将近红外染料DiR装载到纳米药物中，以监测纳米药物的体内分布。
将近红外染料DiR装载到纳米药物中，得到[email protected]。将200μL的[email protected]、无靶向对照组[email protected]或无膜修饰组[email protected](DiR剂量均为0.2mg/kg)纳米粒子尾静脉注射GL261-Luc荷瘤小鼠体内。用小动物成像仪跟踪DiR在体内不同时间点的分布情况(激发747nm，发射774nm)。为了探究小鼠的离体成像效果，在纳米药物4h后，取部分小鼠解剖，观察在主要器官中的聚集情况。
将200μL [email protected]、[email protected]和[email protected](DiR剂量:0.2mg/kg)静脉注射到原位荷GL261-Luc肿瘤的C57BL/6小鼠体内。注射4h后，[email protected]组可在大脑中观察到强DiR荧光，荧光强度在8h达到最大，强荧光持续维持到24h(图9(a))。重要的是，DiR荧光与肿瘤生物发光共定位程度高，证明纳米药物可特异靶向肿瘤部位，而在正常脑部积累量小。相比之下，无靶向组[email protected]则显示出较少的肿瘤积累，这表明ApoE在促进BBB穿越、主动靶向和肿瘤积累方面的重要作用，而无细胞膜修饰的裸露[email protected]因为血液循环时间较短，在脑肿瘤的积累更少。
为了进一步证实ApoE的靶向作用，荷原位GL261-Luc肿瘤小鼠注射[email protected]、[email protected]和[email protected](DiR剂量:0.2mg/kg)8h后，将小鼠解剖，小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾和脑)中的DiR荧光成像。成像结果显示(图9(b))，注射[email protected]后的小鼠在原位肿瘤中具有显著增强的DiR荧光，而血红细胞膜伪装无靶向[email protected]和裸露[email protected]处理的小鼠肿瘤中，检测到较弱的DiR荧光。此外，[email protected]的脑部积累高于[email protected],说明血红细胞膜的伪装有利于延长体内循环时间以增加纳米药物的肿瘤积累(图9(b))。以上结果均说明了ApoE修饰的仿生纳米药物能够增加纳米药物的BBB穿越，实现肿瘤特异靶向，并长时间在肿瘤中积累和滞留。
实验例8
进行[email protected]/OTX免疫反应检测。荧光素酶稳定表达的GL261(GL261-Luc)用于检测小鼠肿瘤的大小和位置。将200μL [email protected]/OTX或PBS(TMZ:5mg/kg、OTX:5mg/kg)静脉注射C57BL/6荷瘤(GL261-Luc)小鼠体内(n＝3)。使用在注射纳米药物后的1、3或7天收集小鼠血液。将血液以1000rpm/min的速度离心10min以收集血清。根据酶联免疫试剂盒(ELISA)产品说明书，将小鼠血清进行ELISA实验，检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(INF-γ)和白细胞介素-6(IL-6)。
单次注射[email protected]/OTX纳米药物72h后，在小鼠外周血清中检测到高水平的INF-γ、TNF-α和IL-6，分别是PBS组的3.2倍、2.1倍和2.8倍(图10)，证明了仿生纳米药物能在短期内有效刺激免疫系统。
为了进一步研究[email protected]/OTX是否能加速树突状细胞(DC)的成熟，我们将[email protected]/OTX、[email protected]、[email protected]、游离TMZ、游离TMZ和OTX混合物(TMZ:5mg/kg、OTX:5mg/kg)或PBS静脉注射GL261-Luc荷瘤小鼠体内。注射后3天，处死小鼠取淋巴结，轻轻匀浆成单个细胞悬液，根据产品说明书推荐的用量，加入对应量的CD11c-FITC、CD80-PE和CD86-APC抗体，4℃避光染色30min(免疫实验的染色过程中，溶液体积不能超过100μL)，PBS洗涤后，将细胞重悬在PBS缓冲溶液中，用于流式细胞术测定。
单次注射[email protected]/OTX，[email protected]，[email protected]，自由TMZ/OTX混合物或者自由的TMZ72h后，收集各组小鼠的淋巴结。然后我们使用流式细胞术定量CD80和CD86的表达来研究[email protected]/OTX注射后对DC细胞的免疫调节作用。结果表明，注射[email protected]/OTX纳米药物的小鼠的淋巴结中CD80和CD86的表达最高(25.40％)与[email protected](21.09％)相似，显著高于[email protected](13.13％)对照组(图11(a))。图11a为小鼠中成熟的DC细胞(CD11c+CD80+CD86+)的含量。
有趣的是，游离TMZ/OTX混合物或游离TMZ几乎不会诱导DC的成熟，可能是由于自由药物体内被快速代谢，难以发挥作用。[email protected]/OTX仿生纳米药物处理后的小鼠DC成熟水平较高，表明诱导了强免疫反应，具有免疫治疗的潜力。
为了探究仿生纳米药物[email protected](TMZ/OTX)能否诱导体内免疫反应，在注射3天后收集小鼠血液，离心(1000rpm,10min)后去除血清，将血细胞与红细胞裂解缓冲液按照体积比1：3的量混合后，在4℃孵育3min，离心(1000rpm,10min)收集淋巴细胞。用PBS洗涤2次，然后根据产品说明书推荐的用量，加入对应量的CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC和CD8-PE抗体，4℃避光染色30min，PBS洗涤后，将细胞重悬在PBS缓冲溶液中，用于流式细胞术测定。
为了检测纳米药物[email protected](TMZ/OTX)能否激活体内的抗肿瘤免疫反应，在注射3天后收集小鼠的脑部肿瘤，在注射纳米药物3天后收集各组中小鼠的肿瘤，将其匀浆成单个细胞悬浮液，离心(1000rpm,3min)。根据产品说明书推荐的用量，加入对应量的CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC和CD8-PE抗体，4℃避光染色30min，PBS洗涤后，将细胞重悬在PBS缓冲溶液中，用于流式细胞术测定。
流式细胞术测定结果显示：细胞毒性CD8+T细胞和CD4+辅助T细胞在免疫过程中发挥关键作用，CD8+和CD4+T细胞的增加会促进抗肿瘤免疫反应。我们观察到，与其他给药组相比，用[email protected]/OTX治疗的小鼠肿瘤中CD8+和CD4+T细胞的总百分比为25.36％(图11(b))，是用游离TMZ/OTX治疗的小鼠的2.1倍。定量结果进一步显示，在给药组的血液中，[email protected]/OTX治疗诱导的CD8+和CD4+水平最高，这与肿瘤中结果一致(图11(c))。这些结果表明我们的纳米药物递送策略，成功的引起了体内抗肿瘤免疫反应。
实验例9
原位荷GL261肿瘤C57BL/6小鼠模型构建成功后，每两天尾静脉注射200μL的[email protected]/OTX、[email protected]、[email protected]、自由的TMZ和OTX混合物、自由的TMZ(TMZ:5mg/kg、OTX:5mg/kg)和PBS。用小动物成像仪和体重秤分别记录小鼠的肿瘤大小和体重。治疗结束后，每组随机选取一只小鼠取脑等主要器官，用于H&E组织学分析，并进行CD4+、CD8+、PD-L1、Ki-67、Caspase 3免疫组化染色，TUNEL实验根据TUNEL产品说明书进行操作，进而分析在治疗过程中仿生纳米药物对荷GL261-Luc小鼠的系统毒性、抗肿瘤活性及抗肿瘤免疫激活效果。其余小鼠用于观察生存周期。
[email protected]/OTX的抗肿瘤效果评估是在原位荷GL261-Luc脑胶质瘤的C57BL/6小鼠进行的。肿瘤种植成功后的第12天，通过静脉注射200μL [email protected]/OTX、[email protected]、[email protected]、自由药物混合物TMZ/OTX、自由的TMZ(TMZ:5mg/kg,OTX:5mg/kg)和PBS进行治疗，每两天给药一次，共给5次(图12(a))。生物荧光定性和定量的结果表明，经[email protected]/OTX治疗后能有效延缓肿瘤的生长，是六个治疗组中肿瘤最小的(图12(b),图13(a))。此外，纳米药物的治疗效果优于自由药物，说明纳米药物在肿瘤治疗方面的优越性。
尽管自由药物混合物TMZ/OTX治疗组在一定程度上延缓了神经胶质瘤的生长，但体重下降急剧，表明存在全身毒性(图13(b)，(n＝8,数据表示为平均标准差，*p<0.05))。用PBS治疗的小鼠也显示出显著的体重下降，反映出随着疾病的进展，脑损伤增加。相比之下，[email protected]/OTX治疗后的小鼠体重几乎没有下降(图13(b))，这表明这种治疗有效的抑制了脑肿瘤的生长而没有引起副作用。有趣的是，与用游离药物或单一药物负载的纳米药物对照组相比，[email protected]/OTX能显著延长GL261小鼠的存活时间(图13(c))。[email protected]/OTX处理后小鼠的生存中位值45d明显长于[email protected](33天)、[email protected](28天)、自由TMZ/OTX(25天)、自由TMZ(24天)或PBS(22天)。
经治疗后各组小鼠生物发光的全脑H&切片参照图14所示。
免疫荧光和免疫组织化学图像结果表明，与单载的纳米药物组[email protected]、[email protected]相比，[email protected]/OTX表现出最高水平的DNA损伤(γH2AX)和肿瘤细胞凋亡(TUNEL，CC3)信号(图15)。有趣的是，和自由药物混合物TMZ/OTX及自由药物TMZ组相比，纳米药物的凋亡信号更加明显(图15)。同时，在经过纳米药物[email protected]/OTX治疗后的小鼠中，肿瘤细胞增殖标记物(Ki67)的信号最低(图15)。重要的是，仿生纳米药物治疗的小鼠的肿瘤切片中观察到PD-L1的表达显著降低，这证明了通过纳米药物共递送的OTX能有效抑制PD-L1的表达。此外，[email protected]/OTX治疗后小鼠肿瘤中的CD8+T细胞和CD4+T辅助细胞的数量与其他治疗相比显著增加，进一步证实了仿生纳米药物[email protected]/OTX化疗免疫联合治疗的效果显著，展示了纳米药物优异的免疫激活能力。
[email protected]/OTX、[email protected]、[email protected]、自由TMZ/OTX、自由TMZ或PBS治疗治疗后的第22天，对各组分别取一只小鼠，对其心、肝、脾、肺、肾切片进行H&E染色，结果表明，在给予[email protected]/OTX治疗后，对小鼠的主要器官无毒副作用，而自由药物混合物TMZ/OTX及自由药物TMZ组则会引起肾脏毒性(图16)，说明仿生纳米药物[email protected]/OTX良好的生物安全性。
实验例10
GBM患者的肿瘤在术后易复发是导致GBM难以治愈的主要原因，本实验例进一步评估了仿生纳米药物[email protected]/OTX在复发肿瘤模型中的化学免疫联合治疗效果。本实验例进行[email protected](TMZ/OTX)在复发脑瘤模型中的联合治疗和生物安全性评估。
为了模拟胶质瘤临床易复发的情况，我们构建了GL261-Luc胶质瘤复发模型(参照图17a所示)。具体如下：在GL261-Luc种植成功后的第7天，对小鼠肿瘤进行外科手术切除，操作在10倍显微镜下进行。操作时间约为20min，整体死亡率低于5％。小鼠手术后，称重并随机分为6组(n＝8)。在植入后第10天和第13天，尾静脉注射[email protected]/OTX、[email protected]、[email protected]、自由的TMZ和OTX混合物、自由的TMZ(TMZ:5mg/kg、OTX:5mg/kg)和PBS。并用活体生物发光Lumina IVIS III系统进行光学成像记录肿瘤增殖情况。为探讨其抗肿瘤机制，我们对复发肿瘤中的免疫细胞进行了分析。荷瘤小鼠治疗后，根据实验例8的方法收集肿瘤和血液，获得单细胞悬液，然后用CD3-FITC、CD4-PE和CD8-APC抗体染色。经流式细胞仪测定后，并用FlowJo软件分析。为了分析记忆性T细胞，在第18天从存活的小鼠中收获脾脏，并用CD3-FITC、CD8-PerCP-Cy5.5、CD62L-APC和CD44-PE抗体染色。小鼠淋巴结DC细胞的检测与实验例8中方法一致。测试后使用FlowJo软件进行数据分析。
与用自由药物(自由TMZ/OTX混合物或自由TMZ)治疗的小鼠相比，单一载药纳米药物[email protected]和[email protected]可以部分延缓肿瘤的复发，而[email protected]/OTX显示了显著的治疗效果(图17(b)，图18(a))。通过跟踪小鼠体重发现[email protected]/OTX纳米药物治疗后小鼠体重变化不大，证明其良好的抗肿瘤活性及较小的毒性。相比之下，用游离药物或单一药物包封的纳米药物治疗的小鼠体重明显减轻(图18(b))，这可能是由于GL261肿瘤持续增长导致的小鼠状态变差。用[email protected]/OTX治疗后的小鼠中位生存期延长至52天，明显长于分别接受[email protected](38天)、[email protected](32天)、自由的TMZ和OTX混合(25天)、自由的TMZ(25天)或PBS(20天)治疗的小鼠(图18(c))。
由于免疫记忆在抗肿瘤免疫反应中起着重要的作用，因此我们研究了治疗后第18天小鼠脾脏中记忆T细胞的含量。结果表明，与接受单一药物的小鼠相比，接受[email protected]/OTX的小鼠脾脏中记忆T细胞(CD3+CD8a+CD44+CD62L+)的数量显著增加(图19(a)和(b))，表明[email protected]/OTX引发了强烈的免疫记忆效应，这解释了其在复发模型中良好的抗肿瘤活性。图19(c)和(d)进一步证实了[email protected]/OTX纳米药物显著增加了血液中活化的CD8+和CD4+T细胞(CD3+CD4+CD8+)的百分比，肿瘤浸润淋巴细胞中CD8+和CD4+T细胞的含量(图20(e)和(f))也显著增加，说明仿生纳米药物[email protected]/OTX可以通过激活抗肿瘤反应实现了原位脑瘤的免疫治疗，具有较强的免疫激活和记忆能力。
为了评价[email protected]/OTX的生物安全性，将其单剂量注射至健康小鼠体内，在规定的时间点取小鼠血液，检测血常规和血生化(图20(a-i))。选取健康Balb/c小鼠，随机分为两组(n＝6)。[email protected](TMZ/OTX)(TMZ:5mg/kg,OTX:5mg/kg)或PBS通过尾静脉注射至小鼠体内。在第0、2、4、7和14天，对小鼠进行眼球采血。全血800g离心5min获得血清，血浆中的ALT、AST、ALP、血浆尿素(BUN)、尿酸(UA)、肌酐(CR)由日本东京富士胶片公司的Dri-Chem7000IZ检测。全血进行血常规检测，检测项目包括：血小板(PLT)、红细胞(RBC)、白细胞(WBC)。
为了评估纳米药物治疗对潜在炎症过程的诱导作用，在第0、2天，杀死小鼠，收集器官(肾和肝)检测炎症因子(白介素-1β(Il-1β)、Il-6和TNF-α)的变化(图20(j-o))。结果表明，在注射后两周的时间内，PBS和[email protected]/OTX组的各项指标之间均没有显著差异，表明其具有较低的系统毒性和良好的生物相容性。
综上，本发明提供了TMZ及Brd4抑制剂OTX共载的仿生纳米药物，以促进TMZ和OTX的联合给药，实现化疗和免疫治疗联合治疗脑肿瘤。[email protected]/OTX能够改善BBB渗透性，增加肿瘤积累和滞留，实现肿瘤微环境响应的药物释放。TMZ和OTX释放引起的化疗可以激活体内免疫反应，而OTX不仅干扰细胞增殖，而且可以阻止DNA修复从而增加肿瘤对TMZ的敏感性，增强TMZ药效。此外，OTX还可以抑制PD-L1的表达，以产生强有力的抗肿瘤免疫反应。[email protected]/OTX在血清中诱导了高水平的细胞因子，促进了DC的成熟，增加了CD4+CD8+T细胞在肿瘤和血液中的表达，以进一步增强脑肿瘤免疫治疗的效果。[email protected]/OTX在原发性和复发性原位胶质瘤小鼠模型中，均证明了化疗免疫联合治疗，可以提供比单一治疗更有效的胶质瘤治疗效果。值得注意的是，这些仿生纳米药物对正常组织的损伤很小，在体内安全性高。该智能仿生纳米药物提供了用于免疫抑制性微环境的调控和治疗易产生耐药的肿瘤治疗的多功能平台。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种含粘膜微粒的肠溶、结肠溶胶囊及其制备方法