一种人工角膜
阅读说明：本技术 一种人工角膜 (Artificial cornea ) 是由 陈百华 韩凯 彭立 马巍 彭晗晗 闫滨 于 2021-06-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种人工角膜,包括中央光学部位与裙边；所述中央光学部位包括相连接的圆柱体与伞状部位；所述伞状部位的直径大于圆柱体；所述裙边套于所述圆柱体外；所述裙边由复合材料制备得到；所述复合材料包括氧化石墨烯与碳化二铌。与现有技术相比,本发明以氧化石墨烯与碳化二铌复合材料制备裙边,其具有良好的亲水性、生物相容性、较好的孔隙率、易于修饰和功能化,并且也具有高强度的韧性与耐腐蚀性,使人工角膜与受体角膜组织具有良好的相容性,减少了人工角膜相关并发症的发生,提高了其应用安全性,降低了角膜疾病的致盲率。(The invention provides an artificial cornea, which comprises a central optical part and a skirt edge; the central optical part comprises a cylinder and an umbrella-shaped part which are connected; the diameter of the umbrella-shaped part is larger than that of the cylinder; the skirt edge is sleeved outside the cylinder; the skirt is prepared from a composite material; the composite material comprises graphene oxide and niobium carbide. Compared with the prior art, the skirt edge is prepared from the graphene oxide and niobium carbide composite material, has good hydrophilicity, biocompatibility and porosity, is easy to modify and functionalize, and also has high-strength toughness and corrosion resistance, so that the artificial cornea has good compatibility with receptor corneal tissues, the occurrence of complications related to the artificial cornea is reduced, the application safety of the artificial cornea is improved, and the blindness rate of corneal diseases is reduced.)
技术领域
本发明属于医疗器械技术领域，尤其涉及一种人工角膜。
背景技术
角膜盲是仅次于白内障的第二大致盲眼病，中国目前角膜盲约为400万 名，并且每年新增10万多病例，而每年获得角膜移植手术的患者大约为5000 余人，角膜供体极其短缺。另外，角膜盲患者中有很大一部分患者同时伴有 严重干眼、严重烧伤、严重免疫性疾病、多次角膜移植手术失败等病变，对 于此类患者，即使移植千辛万苦等来的常规新鲜角膜供体也无济于事，往往 因严重排斥反应而失败，而人工角膜移植是这些患者复明的唯一有效途径。
但目前国内尚无任何该类产品，国外虽有一些人工角膜产品，如波士顿 人工角膜(又称Dohlman-duane)、骨-齿型人工角膜、俄罗斯Moroz人工角 膜等，但由于这些产品均需要利用供体角膜做裙边，对中国这样角膜供体严 重短缺的国家来说很不实用，况且该类角膜同样存在大量严重并发症，如眼 内炎，伤口漏，青光眼，晶体后膜等，导致其远期效果不理想，从而并未被 广泛推广应用。
人工角膜均由两部分构成，中央光学部位及与受体组织连接的裙边，而 导致其应用受限及并发症多的主要原因在于其裙边材料与中央镜柱及受体组 织的生物相容性不足，材料的亲水性及孔隙率等存在缺陷。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种生物相容性较好的人 工角膜。
本发明提供了一种人工角膜，其特征在于，包括中央光学部位与裙边； 所述中央光学部位包括相连接的圆柱体与伞状部位；所述伞状部位的直径大 于圆柱体；所述裙边套于所述圆柱体外；
所述裙边由复合材料制备得到；所述复合材料包括氧化石墨烯与碳化二 铌。
优选的，所述碳化二铌由铌碳化铝经氢氟酸刻蚀除去铝原子得到。
优选的，所述碳化二铌按照以下方法制备得到：
将铌碳化铝与氢氟酸反应，洗涤离心，超声剥离后，得到碳化二铌。
优选的，所述氧化石墨烯与碳化二铌的质量比为1：(1.5～2.5)。
优选的，所述氧化石墨烯与碳化二铌的质量比为1：2。
优选的，所述裙边与伞状部位相对的一面涂覆有纳米涂层。
优选的，所述纳米涂层的厚度为100～300nm。
优选的，所述裙边与伞状部位不相对的一面设置有血管内皮生长因子涂 层。
优选的，所述血管内皮生长因子涂层的厚度为100～300nm。
优选的，所述圆柱体上设置有螺纹；所述裙边通过螺纹套于圆柱体外。
本发明提供了一种人工角膜，包括中央光学部位与裙边；所述中央光学 部位包括相连接的圆柱体与伞状部位；所述伞状部位的直径大于圆柱体；所 述裙边套于所述圆柱体外；所述裙边由复合材料制备得到；所述复合材料包 括氧化石墨烯与碳化二铌。与现有技术相比，本发明以氧化石墨烯与碳化二 铌复合材料制备裙边，其具有良好的亲水性、生物相容性、较好的孔隙率、 易于修饰和功能化，并且也具有高强度的韧性与耐腐蚀性，使人工角膜与受 体角膜组织具有良好的相容性，减少了人工角膜相关并发症的发生，提高了 其应用安全性，降低了角膜疾病的致盲率。
附图说明
图1为本发明提供的人工角膜的中央光学部位的结构示意图；
图2为本发明提供的人工角膜的裙边的结构示意图；
图3为本发明实施例1中Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测结果图；
图4为本发明实施例1中凋亡检测结果图；
图5为本发明实施例1中EdU-488细胞增殖检测结果图；
图6为本发明实施例1中得到的圆盘即人工角膜裙边的扫描电镜图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部 的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性 劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种人工角膜，包括中央光学部位与裙边；所述中央光学 部位包括相连接的圆柱体与伞状部位；所述伞状部位的直径大于圆柱体；所 述裙边套于所述圆柱体外；所述裙边由复合材料制备得到；所述复合材料包 括氧化石墨烯与碳化二铌。
参见图1与图2，图1为本发明提供的人工角膜的中央光学部位的结构示 意图，其中1为伞状部位，2为圆柱体，3为螺纹结构；图2为本发明提供的 人工角膜的裙边的结构示意图。
本发明提供的人工角膜，包括中央光学部位；所述中央光学部位包括相 连接的圆柱体与伞状部位；所述圆柱体的直径优选为2～4mm，更优选为 2.5～3.5mm，再优选为3mm；所述伞状部位的直径大于圆柱体，其直径优选 为6～10mm；所述伞状部位中央的厚度优选为0.5mm～1.5mm；所述伞状部位 边缘的厚度优选为0.5mm～1mm；所述中央光学部位的材料优选为聚甲基丙烯 酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟甲酯、聚乙烯醇、硅胶多聚体与聚乙二醇二丙烯 酸酯中的一种或多种。
所述圆柱体外套有裙边；所述圆柱体及裙边与圆柱体相接触的面优选均 设置有螺纹；所述裙边通过螺纹套于圆柱体外；所述裙边的厚度优选为2～6 mm，更优选为2.5～5.5mm，再优选为5mm。
在本发明中，所述裙边由复合材料制备得到；所述复合材料包括氧化石 墨烯与碳化二铌。
其中，所述氧化石墨烯优选为经改性的Hummers法制备得到，更优选按 照以下步骤进行：将石墨进行预氧化，深度氧化后，离心洗涤，超声剥离后， 得到氧化石墨烯；所述预氧化采用过硫酸钾与五氧化二磷；其与石墨的质量 比为2.5:2.5:3.0；预氧化的温度为35度，时长为4小时；所述深度氧化的氧 化剂为过硫酸钾与五氧化二磷；其添加量与石墨的质量比为2.5：2.5：3；深 度氧化的温度优选为80℃，时长为1小时；所述离心的转速为2500r·min-1， 时间为30分钟；所述洗涤所采用的溶剂为1:10的HCl溶液；超声剥离的功 率及时间分别为150W和40分钟。
所述碳化二铌优选由铌碳化铝经氢氟酸刻蚀除去铝原子得到，更优选按 照以下步骤制备：将铌碳化铝与氢氟酸反应，洗涤离心，超声剥离后，得到 碳化二铌；所述铌碳化铝的粒径优选为0.01～0.1mm，更优选为0.01～0.08mm， 再优选为0.01～0.06mm，再优选为0.02～0.05mm，最优选为0.02mm；所述氢 氟酸的浓度优选为1～1.5g/mL，更优选为1～1.3g/mL，再优选为1～1.2g/mL， 最优选为1.15g/mL；所述铌碳化铝与氢氟酸的质量比优选为1：(1～5)，更 优选为1：(1～3)，再优选为1:2；所述反应的温度优选为70℃～90℃；所述反应的时间优选为1～3小时；所述洗涤所用的溶剂为乙醇；所述离心的转速 为2000～3000r·min-1，更优选为2500r·min-1；离心的时间优选为20～40min， 更优选为30min；所述超声剥离的功率优选为100～200W，更优选为150W； 所述超声剥离的时间为30～50min，更优选为35～45min，再优选为40min。
所述复合材料中氧化石墨烯与碳化二铌的质量比优选为1：(1.5～2.5)， 更优选为1：2；所述复合材料优选按照以下步骤制备：将氧化石墨烯与碳化 二铌在水中混合，超声，得到复合材料；所述氧化石墨烯与水的质量比优选 为1:2；所述超声的功率优选为100～200W，更优选为150W；所述超声的时 间优选为30～60min，更优选为40～50min。
将所述复合材料在模具中滤水成型，煅烧后即可得到裙边；所述煅烧的 温度优选为150℃～250℃，更优选为200℃；所述煅烧的时间优选为0.5～2h， 更优选为0.5～1.5h，再优选为1h。
按照本发明，所述裙边与伞状部位相对的一面涂覆有纳米涂层；所述纳 米涂层的厚度优选为100～300nm，更优选为150～250nm，再优选为200nm。
按照本发明，所述裙边与伞状部位不相对的一面优选设置有血管内皮生 长因子涂层；所述血管内皮生长因子涂层的厚度优选为100～300nm，更优选 为150～250nm，再优选为200nm。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种人工角膜 进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
实施例1
1.1改进的Hummers法，预氧化、深度氧化、离心洗涤和超声剥离制备 氧化石墨烯。所述预氧化采用过硫酸钾与五氧化二磷；其与石墨的质量比为 2.5:2.5:3.0；预氧化的温度为35℃，时长为4小时；所述深度氧化的氧化剂为 过硫酸钾与五氧化二磷；其添加量与石墨的质量比为2.5：2.5：3；深度氧化 的条件80℃，时长为1小时；所述离心的转速为2500r·min-1，时间为30分 钟；所述洗涤所采用的溶剂为1:10的HCl溶液；超声剥离的功率及时间分别 为150W和40分钟
1.2以粒径为0.02mm的铌碳化铝为原料，按照质量比为1：2的比例将 其与浓度1.15g/mL氢氟酸反应2h去除铝原子，乙醇洗涤2500r·min-1离心 30min、150W超声剥离40min制备二维碳化二铌。
1.3将氧化石墨烯(50wt％)、碳化二铌悬浮液(50wt％)按照质量比 1:2的比例混合150W超声50min，得到复合材料。
1.4制备参数：将混合材料注入到模具中，滤水成型，200℃煅烧1h，得 到三种规格圆盘，100μm厚直径4-8mm圆盘；200μm厚直径4-8mm圆盘； 300μm厚直径4-8mm圆盘。
表面修饰构建人工角膜裙边复合材料。
分别在人工角膜裙边复合材料的前表面修饰涂层VEGF200nm(lug/mL 的VEGF粉末用双蒸水稀释至20.0mL,配置成浓度为50ng/mL的VEGF溶液 制成涂层)，后表面修饰涂层TA200nm(曲安奈德粉末、聚乙醇酸－聚羟基 乙酸PLLGA，将上述成分磨碎制作成细小颗粒形状，按200mg曲安奈德粉 末，800mg的聚乙醇酸－聚羟基乙酸PLLGA比例与曲安奈德粉末溶于共同溶 剂20ml的四氢呋喃(THF)里面)涂层的意义为：前涂层减少细胞的增殖， 后涂层减少纤维膜的增生。
将1.4中制备得到的圆盘覆盖涂层后在乙醇中浸泡24h，真空烤干，然后 将其作为样品进行细胞实验证明样品细胞毒性低，对细胞增殖和凋亡无影响。
细胞培养条件以及分组
1)细胞培养：人角膜基质细胞(HK)分别培养于专用完全培养基和 10％FBS+1％双抗的DMEM培养基中，37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中培 养。
2)样品组将样品置入24孔板中，取对数生长的HK细胞以2*105个细胞 接种。
3)对照组：HK细胞不做任何处理。
Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试步骤
①洗涤：吸除培养液，PBS清洗2遍；
②染色:加入适当体积的Calcein AM/PI检测工作液，37℃避光孵育30min；
③检测：孵育结束后，用荧光酶标仪检测(Calcein AM为绿色荧光， Ex/Em＝494/517nm；PI为红色荧光，Ex/Em＝535/617nm)。通过对比对照组与 处理组的RFU(Relativefluorescence values)，可以得出死细胞与活细胞数量的 变化。
④去掉染液，PBS清洗3遍后于显微镜下拍照，得到显微镜照片如图3 所示。
凋亡检测步骤
①以上处理的细胞用不含EDTA的胰酶消化收集；
②用PBS洗涤细胞2次，每次1000g离心5min，收集细胞；
③加入195ul的Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；
④加入5ul Annexin V-FITC混匀后，加入10ul碘化丙啶染色液，轻轻混 匀；
⑤室温、避光，反应10min；
⑥1h内，在流式细胞仪观察检测，得到图片如图4所示。
EdU-488细胞增殖检测
1.EdU标记
1.1用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量 50μM EdU培养基。
1.2每孔加入100μL 50μM EDU培养基孵育过夜，弃培养基；
1.3PBS清洗细胞1～2次，每次5分钟。
2.细胞固定化
2.1每孔加入50μL细胞固定液(4％多聚甲醛)室温孵育30分钟，弃固 定液；
2.2每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨 酸溶液；
2.3每孔加入100μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；
2.4每孔加入100μL渗透剂脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5 分钟。
3.Apollo染色
3.1每孔加入100μL的1x染色反应液，避光、室温、脱色摇 床孵育30分钟后，弃染色反应液；
3.2加入100μL渗透剂脱色摇床清洗2～3次，每次10分钟，弃渗透剂；
3.3每孔每次加入100μL甲醇清洗1～2次，每次5分钟；PBS清洗1 次，每次5分钟。
4.DNA染色
4.1用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1x Hoechst33342 反应液，避光保存；
4.2每孔加入100μL 1x Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床 孵育30分钟后，弃染色反应液；
4.3每孔每次加入100μL PBS清洗1～3次；
5.图像获取及分析：染色完成后立即进行观测，得到染色图如图5所示。
利用电子扫描显微镜对1.4中得到的圆盘进行分析，得到其扫描电镜照片 如图6所示。