具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

根据本发明的第一个方面，提供了一种软组织修复补片材料，包括海藻酸钠/石墨烯水凝胶和纤维蛋白/石墨烯水凝胶。

在本发明中，海藻酸钠/石墨烯水凝胶中的“/”表示“和”的意思，即海藻酸钠/石墨烯水凝胶同时包括海藻酸钠和石墨烯。纤维蛋白/石墨烯水凝胶中的“/”表示“和”的意思，即纤维蛋白/石墨烯水凝胶同时包括纤维蛋白和石墨烯。一般来说，作为软组织修复补片原材料的海藻酸钠/石墨烯水凝胶和纤维蛋白/石墨烯水凝胶在制成软组织修复补片之前分别独立制备保存。

纤维蛋白/石墨烯水凝胶主要是由纤维蛋白和石墨烯构成的水凝胶，也可以理解为将石墨烯添加到纤维蛋白水凝胶中所形成的物质。纤维蛋白/石墨烯水凝胶除了含有纤维蛋白和石墨烯，还可以含有水凝胶中常见的其他物质，此处不作具体限定。在制作软组织修复补片时，纤维蛋白/石墨烯水凝胶主要用于与细胞混合。纤维蛋白/石墨烯水凝胶中石墨烯的加入有利于提高细胞的存活率，对细胞的生长和增殖有促进作用。但是纤维蛋白/石墨烯水凝胶降解速率较快，可能在生物组织修复好之前就已经完全降解，同时纤维蛋白/石墨烯水凝胶的力学性能较差，制成软组织修复补片时容易卷曲或者破碎。

故本发明选用海藻酸钠/石墨烯水凝胶与纤维蛋白/石墨烯水凝胶协同配合使用。海藻酸钠/石墨烯水凝胶主要是由海藻酸钠和石墨烯构成的水凝胶，也可以理解为将石墨烯添加到海藻酸钠水凝胶中所形成的物质。海藻酸钠/石墨烯水凝胶除了含有海藻酸钠和石墨烯，还可以含有水凝胶中常见的其他物质，此处不作具体限定。海藻酸钠水凝胶具有良好的生物相容性和力学性能，且降解速率较慢，能够弥补纤维蛋白/石墨烯水凝胶力学性能的不足和降解速率过快的缺陷，从而为制得的软组织修复补片提供足够的力学支撑和组织修复时间，同时，纤维蛋白/石墨烯水凝胶具有良好的生物相容性，有利于细胞大量扩增繁殖，促进软组织快速修复。通过海藻酸钠/石墨烯水凝胶与纤维蛋白/石墨烯水凝胶协同配合使用，从而赋予采用该软组织修复补片材料制得的软组织修复补片具有适合临床使用的力学性能、与组织修复匹配的降解速率和良好的细胞相容性，具有广泛的临床应用前景。

对于海藻酸钠/石墨烯水凝胶和纤维蛋白/石墨烯水凝胶的制备方法不作具体限定，可采用本领域常用的制备方法制得。

海藻酸钠/石墨烯水凝胶和纤维蛋白/石墨烯水凝胶的具体用量需要根据待制作的软组织修复补片的结构进行限定。作为本发明的一种可选实施方式，海藻酸钠/石墨烯水凝胶和纤维蛋白/石墨烯水凝胶的质量比为(1-10)：1。海藻酸钠/石墨烯水凝胶和纤维蛋白/石墨烯水凝胶典型但非限制性的质量比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。

作为本发明的一种可选实施方式，海藻酸钠/石墨烯水凝胶包括以下组分：海藻酸钠、明胶、石墨烯和第一溶剂；

其中，海藻酸钠、明胶、石墨烯和第一溶剂的质量比为(10-30)：(10-30)：(0.01-0.3)：1000，优选为(11-28)：(11-28)：(0.1-0.3)：1000；海藻酸钠、明胶、石墨烯和第一溶剂典型但非限制性的质量比为10:10:0.01:1000、11:11:0.1:1000、20:10:0.01:1000、30:10:0.01:1000、10:20:0.01:1000、10:30:0.01:1000、20:20:0.01:1000、20:20:0.02:1000、20:20:0.2:1000、20:20:0.3:1000、20:30:0.01:1000、30:20:0.01:1000、28:28:0.3:1000、30:30:0.01:1000、10:10:0.1:1000、10:10:0.2:1000、10:10:0.3:1000、20:10:0.1:1000、30:10:0.2:1000、10:20:0.1:1000或30:20:0.3:1000。

本发明中所述的“包括”意指其除所述组份外，还可以包括其他组份，这些其他组份赋予所述海藻酸钠/石墨烯水凝胶不同的特性。除此之外，本发明所述的“包括”，还可以替换为封闭式的“为”或“由……组成”。

作为本发明的一种可选实施方式，第一溶剂包括磷酸缓冲盐溶液(PBS，PhosphateBuffer Saline)。

作为本发明的一种可选实施方式，海藻酸钠/石墨烯水凝胶的制备方法包括以下步骤：

提供海藻酸钠、明胶和部分的第一溶剂混合形成的凝胶A；

将石墨烯和剩余部分的第一溶剂混合后，再与凝胶A混合，得到海藻酸钠/石墨烯水凝胶。

优选地，海藻酸钠/石墨烯水凝胶的制备方法包括以下步骤：

将海藻酸钠搅拌溶解于部分的第一溶剂后，进行过滤灭菌，将辐照灭菌的明胶加入到过滤灭菌后的海藻酸钠中溶解混匀，得到凝胶A；

将石墨烯和剩余部分的第一溶剂混合后，再与凝胶A混合，得到海藻酸钠/石墨烯水凝胶。

该海藻酸钠/石墨烯水凝胶的制备方法操作简单、方便，所得到的海藻酸钠/石墨烯水凝胶稳定性好，适合于作为软组织修复补片材料使用。

作为本发明的一种可选实施方式，纤维蛋白/石墨烯水凝胶包括以下组分：纤维蛋白、明胶、石墨烯、透明质酸、甘油和第二溶剂；

其中，纤维蛋白、明胶、石墨烯、透明质酸、甘油和第二溶剂的质量比为(10-30)：(25-45)：(0.01-0.3)：(1-5)：(50-150)：1000，优选为(11-28)：(26-44)：(0.01-0.1)：(1.2-4.8)：(75-130)：1000；纤维蛋白、明胶、石墨烯、透明质酸、甘油和第二溶剂典型但非限制性的质量比为10:25:0.01:1:50:1000、11:26:0.01:1.3:75:1000、20:35:0.01:3:100:1000、28:44:0.1:4.8:130:1000、30：45：0.1：3：120：1000、30：45：0.2：3：120：1000、30：45：0.3：3：120：1000、30:45:0.3:5:150:1000、20:25:0.01:1:50:1000、30:26:0.01:1.3:75:1000、10:45:0.2:5:100:1000、25:25:0.2:3:130:1000或30:35:0.2:2:100:1000。

本发明中所述的“包括”意指其除所述组份外，还可以包括其他组份，这些其他组份赋予所述纤维蛋白/石墨烯水凝胶不同的特性。除此之外，本发明所述的“包括”，还可以替换为封闭式的“为”或“由……组成”。

作为本发明的一种可选实施方式，第二溶剂包括磷酸缓冲盐溶液。

作为本发明的一种可选实施方式，纤维蛋白/石墨烯水凝胶的制备方法包括以下步骤：

提供纤维蛋白、明胶、透明质酸、甘油和部分的第二溶剂混合形成的凝胶B；

将石墨烯和剩余部分的第二溶剂混合后，再与凝胶B混合，得到纤维蛋白/石墨烯水凝胶。

优选地，纤维蛋白/石墨烯水凝胶的制备方法包括以下步骤：

将透明质酸溶解于部分的第二溶剂中，然后再加入纤维蛋白、明胶和甘油溶解混匀，过滤，得到凝胶B；

将石墨烯和剩余部分的第二溶剂混合后，再加入到凝胶B混合，得到纤维蛋白/石墨烯水凝胶。

该纤维蛋白/石墨烯水凝胶的制备方法操作简单、方便，所得到的纤维蛋白/石墨烯水凝胶稳定性好，适合于作为软组织修复补片材料使用。

根据本发明的第二个方面，还提供了一种软组织修复补片，采用上述的软组织修复补片材料和细胞制成，细胞位于纤维蛋白/石墨烯水凝胶中。

软组织修复补片的作用主要是将其植入生物体后可用于填补受损部位的缺失组织，并在该材料的诱导下，人体自身修复功能能够在原来的位置逐渐生长出新的组织，替换生物材料，完成器官组织再生的过程。

根据待填补受损部位的不同，所采用的细胞以及软组织修复补片的种类也不同。例如，当待填补受损部位为尿道时，所采用的细胞可包括尿道上皮细胞和平滑肌细胞，所采用的软组织修复补片为尿道修复补片；当待填补受损部位为皮肤时，所采用的细胞可包括角质细胞和成纤维细胞，所采用的软组织修复补片为皮肤修复补片。

需要说明的是，通过对海藻酸钠水凝胶以及纤维蛋白水凝胶进行活死细胞染色，发现细胞在纤维蛋白水凝胶中会大量的增殖扩张，具体结果如图1-3所示。也就是说细胞在纤维蛋白水凝胶中具有更高的细胞活力和增殖能力，故本发明中选择纤维蛋白水凝胶中含有细胞，海藻酸钠水凝胶作为支撑结构。

本发明提供的软组织修复补片，采用特定的软组织修复补片材料和细胞制成，鉴于上述软组织修复补片材料所具有的特性，使得所制得的软组织修复补片具有良好的力学性能以及较高的细胞活性。

作为本发明的一种可选实施方式，软组织修复补片的结构包括底层、中层和顶层，底层、中层和顶层中的至少一层采用软组织修复补片材料和细胞制成。

采用底层、中层和顶层的结构设计，有利于模拟天然软组织的结构，获得多层次细胞结构，提供足够的营养通道，促进内外细胞的交流和营养输送，加快组织修复速度。

作为本发明的一种可选实施方式，细胞包括细胞Ⅰ和细胞Ⅱ；

软组织修复补片的结构包括底层1、中层2和顶层3，具体如图4和图5所示；

底层1包括采用海藻酸钠/石墨烯水凝胶制成的第一底层，第一底层内均不含孔隙；

中层2包括采用海藻酸钠/石墨烯水凝胶制成的第一中层，以及纤维蛋白/石墨烯水凝胶和细胞Ⅰ制成的第二中层，第一中层含有孔隙，第二中层设置于第一中层的孔隙内；

顶层3包括采用海藻酸钠/石墨烯水凝胶制成的第一顶层，以及纤维蛋白/石墨烯水凝胶和细胞Ⅱ制成的第二顶层，第一顶层含有孔隙，第二顶层设置于第一顶层的孔隙内。

在上述底层中，将海藻酸钠/石墨烯水凝胶形成的第一底层设计为不含孔隙的结构，可发挥其屏障作用，防止创面水分丢失和环境中的细菌侵入。需要说明的是，第一底层的层数不限于一层，可根据实际结构需要设置层数。

在中层中，将第二中层设置于第一中层的孔隙内，这相当于将含有细胞Ⅰ的纤维蛋白/石墨烯水凝胶镶嵌于海藻酸钠/石墨烯水凝胶中。需要说明的是，第一中层和第二中层的层数不限于一层，可根据实际结构需要设置层数。

在顶层中，将第二顶层设置于第一顶层的孔隙内，相当于将含有细胞Ⅱ的纤维蛋白/石墨烯水凝胶镶嵌于海藻酸钠/石墨烯水凝胶中。中层以及顶层的上述结构设计，利用了海藻酸钠/石墨烯水凝胶的力学特性和纤维蛋白/石墨烯水凝胶良好的生物相容性，从而提高软组织修复补片的力学性能，促进软组织尽快修复，并结合孔隙的设计利于营养物质的输送，从而进一步加快缺损组织的修复。需要说明的是，第一顶层和第二顶层的层数不限于一层，可根据实际结构需要设置层数。

作为本发明的一种可选实施方式，软组织修复补片包括尿道修复补片或皮肤修复补片。

作为本发明的一种可选实施方式，软组织修复补片为尿道修复补片，细胞Ⅰ包括尿道上皮细胞，细胞Ⅱ包括平滑肌细胞。

优选地，尿道上皮细胞在每毫升纤维蛋白/石墨烯水凝胶中的数量为1×10⁵-1×10⁷个，平滑肌细胞在每毫升纤维蛋白/石墨烯水凝胶中的数量为2×10⁵-2×10⁷个。

作为本发明的一种可选实施方式，软组织修复补片为皮肤修复补片，细胞Ⅰ包括角质细胞，细胞Ⅱ包括成纤维细胞。

优选地，角质细胞在每毫升纤维蛋白/石墨烯水凝胶中的数量为1×10⁵-1×10⁷个，成纤维细胞在每毫升纤维蛋白/石墨烯水凝胶中的数量为1×10⁵-1×10⁷个。

根据本发明的第三个方面，还提供了上述的软组织修复补片的制作方法，将软组织修复补片材料和细胞混合后采用3D打印方式制成。

本发明提供了上述软组织修复补片的制作方法，将上述软组织修复补片材料和细胞混合后采用3D打印方式制成，3D打印方式能够控制软组织修复补片的打印精度，满足软组织修复补片对复杂结构的需求，通过3D打印方式能够制备力学性能充足、细胞活性良好的三维立体软组织修复补片，解决传统支架所面临的细胞层次单一的问题，实现三维结构组织和器官的构建。

同时，该软组织修复补片的制作方法也印证了3D打印方式在生物组织修复领域应用的可行性，为软组织修复补片的体内研究奠定了研究基础。

作为本发明的一种可选实施方式，软组织修复补片的制作方法包括以下步骤：

将纤维蛋白/石墨烯水凝胶和细胞混合后注入一打印针筒；将海藻酸钠/石墨烯水凝胶注入另一打印针筒，按照底层、中层和顶层的结构逐层进行3D打印，打印过程中同时喷涂雾化后的第一交联剂，然后将打印完成后的产品置于第二交联剂中，得到软组织修复补片。

通过对软组织修复补片的制作方法的进一步限定，使得所制得的软组织修复补片的力学性能更好，细胞活性更高。

作为本发明的一种可选实施方式，海藻酸钠/石墨烯水凝胶与纤维蛋白/石墨烯水凝胶打印过程中，采用正交打印的方式。

作为本发明的一种可选实施方式，海藻酸钠/石墨烯水凝胶所采用的打印针筒的针头直径为100-600μm，丝距为150-600μm。典型但非限制性的针头直径为100μm、200μm、300μm、400μm，500μm或600μm，典型但非限制性的丝距为150μm、200μm、300μm、400μm、500μm或600μm。

优选地，纤维蛋白/石墨烯水凝胶所采用的打印针筒的针头直径为100-600μm，丝距为150-600μm。典型但非限制性的针头直径为100μm、200μm、300μm，400μm，500μm或600μm，典型但非限制性的丝距为150μm、200μm、300μm、400μm、500μm或600μm。

作为本发明的一种可选实施方式，第一交联剂包括氯化钙；

优选地，第二交联剂包括氯化钙和凝血酶。

根据本发明的第四个方面，还提供了上述软组织修复补片材料、软组织修复补片或采用软组织修复补片的制作方法制得的软组织修复补片在生物组织工程中的应用。

鉴于上述软组织修复补片材料、软组织修复补片或采用软组织修复补片的制作方法制得的软组织修复补片所具有的优势，使得其在生物组织工程领域具有良好的应用前景。

下面结合具体实施例和对比例，对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例提供一种软组织修复补片材料，包括分别独立地海藻酸钠/石墨烯水凝胶和纤维蛋白/石墨烯水凝胶，海藻酸钠/石墨烯水凝胶和纤维蛋白/石墨烯水凝胶的质量比为3:1。

其中，海藻酸钠/石墨烯水凝胶包括以下组分：海藻酸钠、明胶、石墨烯和PBS，海藻酸钠、明胶、石墨烯和PBS的质量比为20：20：0.02：1000。

海藻酸钠/石墨烯水凝胶的制备方法包括以下步骤：

称取100mg的明胶进行辐照灭菌后备用，称取100mg的海藻酸钠溶于PBS中，在室温下搅拌溶解2h，转速300转/min，用无菌过滤器进行过滤灭菌，将无菌的明胶加入到过滤灭菌后的海藻酸钠中，在37℃中摇晃2h溶解混匀，得到凝胶A；

将石墨烯超声分散在溶液中，再按照一定的比例加入到凝胶A中进行摇晃混匀，得到海藻酸钠/石墨烯水凝胶。

纤维蛋白/石墨烯水凝胶中包括以下组分：纤维蛋白、明胶、石墨烯、透明质酸、甘油和第二溶剂；纤维蛋白、明胶、石墨烯、透明质酸、甘油和第二溶剂的质量比为30：45：0.02：3：120：1000。

纤维蛋白/石墨烯水凝胶的制备方法包括以下步骤：

将15mg透明质酸溶于PBS中，在37℃搅拌4h，再加入150mg纤维蛋白原、225mg明胶和0.5mL甘油，在37℃中搅拌1h，用无菌过滤器进行过滤，得到凝胶B；

将石墨烯超声分散在溶液中，再按照一定的比例加入到凝胶B中进行摇晃混匀，得到纤维蛋白/石墨烯水凝胶。

实施例2

本实施例提供一种软组织修复补片材料，除了海藻酸钠/石墨烯水凝胶中海藻酸钠、明胶、石墨烯和PBS的质量比为20：20：0.1：1000，其余步骤与实施例1相同。

实施例3

本实施例提供一种软组织修复补片材料，除了海藻酸钠/石墨烯水凝胶中海藻酸钠、明胶、石墨烯和PBS的质量比为20：20：0.2：1000，其余步骤与实施例1相同。

实施例4

本实施例提供一种软组织修复补片材料，除了海藻酸钠/石墨烯水凝胶中海藻酸钠、明胶、石墨烯和PBS的质量比为20：20：0.3：1000，其余步骤与实施例1相同。

实施例5

本实施例提供一种软组织修复补片材料，除了海藻酸钠/石墨烯水凝胶中海藻酸钠、明胶、石墨烯和PBS的质量比为20：20：0.4：1000，其余步骤与实施例1相同。

实施例6

本实施例提供一种软组织修复补片材料，除了海藻酸钠/石墨烯水凝胶中海藻酸钠、明胶、石墨烯和PBS的质量比为20：20：0.005：1000，其余步骤与实施例1相同。

实施例7

本实施例提供一种软组织修复补片材料，除了纤维蛋白/石墨烯水凝胶中纤维蛋白、明胶、石墨烯、透明质酸、甘油和第二溶剂的质量比为30：45：0.05：3：120：1000，其余步骤与实施例1相同。

实施例8

本实施例提供一种软组织修复补片材料，除了纤维蛋白/石墨烯水凝胶中纤维蛋白、明胶、石墨烯、透明质酸、甘油和第二溶剂的质量比为30：45：0.1：3：120：1000，其余步骤与实施例1相同。

实施例9

本实施例提供一种软组织修复补片材料，除了纤维蛋白/石墨烯水凝胶中纤维蛋白、明胶、石墨烯、透明质酸、甘油和第二溶剂的质量比为30：45：0.2：3：120：1000，其余步骤与实施例1相同。

实施例10

本实施例提供一种软组织修复补片材料，除了纤维蛋白/石墨烯水凝胶中纤维蛋白、明胶、石墨烯、透明质酸、甘油和第二溶剂的质量比为30：45：0.3：3：120：1000，其余步骤与实施例1相同。

实施例11

本实施例提供一种软组织修复补片材料，包括分别独立地海藻酸钠/石墨烯水凝胶和纤维蛋白/石墨烯水凝胶，海藻酸钠/石墨烯水凝胶和纤维蛋白/石墨烯水凝胶的质量比为10：1。

其中，海藻酸钠/石墨烯水凝胶包括以下组分：海藻酸钠、明胶、石墨烯和PBS，海藻酸钠、明胶、石墨烯和PBS的质量比为30：10：0.1：1000。

海藻酸钠/石墨烯水凝胶的制备方法包括以下步骤：

称取50mg的明胶进行辐照灭菌后备用，称取150mg的海藻酸钠溶于PBS中，在室温下搅拌溶解2h，转速300转/min，用无菌过滤器进行过滤灭菌，将无菌的明胶加入到过滤灭菌后的海藻酸钠中，在37℃中摇晃1h溶解混匀，得到凝胶A；

将石墨烯超声分散在溶液中，再按照一定的比例加入到凝胶A中进行摇晃混匀，得到海藻酸钠/石墨烯水凝胶。

纤维蛋白/石墨烯水凝胶中包括以下组分：纤维蛋白、明胶、石墨烯、透明质酸、甘油和第二溶剂；纤维蛋白、明胶、石墨烯、透明质酸、甘油和第二溶剂的质量比为10：25：0.2：3：120：1000。

纤维蛋白/石墨烯水凝胶的制备方法包括以下步骤：

将15mg透明质酸溶于PBS中，在37℃搅拌4h，再加入50mg纤维蛋白原、125mg明胶和0.5mL甘油，在37℃中搅拌1h，用无菌过滤器进行过滤，得到凝胶B；

将石墨烯超声分散在溶液中，再按照一定的比例加入到凝胶B中进行摇晃混匀，得到纤维蛋白/石墨烯水凝胶。

对比例1

本对比例提供了一种软组织修复补片材料，除了将海藻酸钠/石墨烯水凝胶替换为海藻酸钠水凝胶，即海藻酸钠/石墨烯水凝胶中石墨烯的用量为0，相应的制备方法进行相应调整外，其余步骤与实施例1相同。

对比例2

本对比例提供了一种软组织修复补片材料，除了将纤维蛋白/石墨烯水凝胶替换为纤维蛋白水凝胶，即纤维蛋白/石墨烯水凝胶中石墨烯的用量为0，相应的制备方法进行相应调整外，其余步骤与实施例1相同。

对比例3

本对比例提供了一种软组织修复补片材料，除了将海藻酸钠/石墨烯水凝胶替换为海藻酸钠水凝胶，即海藻酸钠/石墨烯水凝胶中石墨烯的用量为0，将纤维蛋白/石墨烯水凝胶替换为纤维蛋白水凝胶，即纤维蛋白/石墨烯水凝胶中石墨烯的用量为0，相应的制备方法进行相应调整外，其余步骤与实施例1相同。

实施例12

本实施例提供一种软组织修复补片(尿道修复补片)，采用实施例1提供的软组织修复补片材料和细胞制成。

具体的，上述软组织修复补片的结构包括底层、中层和顶层；

底层包括采用海藻酸钠/石墨烯水凝胶制成的第一底层，第一底层内不含孔隙；

中层包括采用海藻酸钠/石墨烯水凝胶制成的第一中层，以及纤维蛋白/石墨烯水凝胶和尿道上皮细胞制成的第二中层，尿道上皮细胞在每毫升纤维蛋白/石墨烯水凝胶中的数量为1×10⁵个，第一中层含有孔隙，第二中层设置于第一中层的孔隙内；

顶层包括采用海藻酸钠/石墨烯水凝胶制成的第一顶层，以及纤维蛋白/石墨烯水凝胶和平滑肌细胞制成的第二顶层，平滑肌细胞在每毫升纤维蛋白/石墨烯水凝胶中的数量为2×10⁵个，第一顶层含有孔隙，第二顶层设置于第一顶层的孔隙内。

上述软组织修复补片的制作方法，包括以下步骤：

将配置好的海藻酸钠/石墨烯水凝胶装入到1号打印针筒中，将上皮细胞与纤维蛋白/石墨烯水凝胶均匀混合后装入到2号打印针筒中，将平滑肌细胞与纤维蛋白/石墨烯水凝胶均匀混合后装入到3号打印针筒。按照底层、中层和顶层的结构逐层进行3D打印，将配置好的5％氯化钙溶液(第一交联剂)装入到雾化器中，打印过程中实时雾化氯化钙溶液进行预交联，打印完成后将打印支架浸泡于氯化钙和凝血酶的混合溶液(第二交联剂)中交联30min，其中，氯化钙浓度为5％(W/V)，凝血酶的浓度为20IU/mL。打印大小为2cm×2cm，打印针头直径为300μm，孔隙为500μm。

实施例13-20

实施例13-20分别提供一种软组织修复补片(尿道修复补片)，分别采用实施例1-10提供的软组织修复补片材料和细胞制成，软组织修复补片的具体结构以及制作方法均与实施例12相同。

实施例21

本实施例提供一种软组织修复补片(皮肤修复补片)，采用实施例11提供的软组织修复补片材料和细胞制成。

具体的，上述软组织修复补片的结构包括底层、中层和顶层；

底层包括采用海藻酸钠/石墨烯水凝胶制成的第一底层，第一底层内不含孔隙；

中层包括采用海藻酸钠/石墨烯水凝胶制成的第一中层，以及纤维蛋白/石墨烯水凝胶和角质细胞制成的第二中层，角质细胞在每毫升纤维蛋白/石墨烯水凝胶中的数量为5×10⁵个，第一中层含有孔隙，第二中层设置于第一中层的孔隙内；

顶层包括采用海藻酸钠/石墨烯水凝胶制成的第一顶层，以及纤维蛋白/石墨烯水凝胶和成纤维细胞制成的第二顶层，成纤维细胞在每毫升纤维蛋白/石墨烯水凝胶中的数量为1×10⁶个，第一顶层含有孔隙，第二顶层设置于第一顶层的孔隙内。

上述软组织修复补片的制作方法，包括以下步骤：

将配置好的海藻酸钠/石墨烯水凝胶装入到1号打印针筒中，将角质细胞与纤维蛋白/石墨烯水凝胶均匀混合后装入到2号打印针筒中，将成纤维细胞与纤维蛋白/石墨烯水凝胶均匀混合后装入到3号打印针筒。按照底层、中层和顶层的结构逐层进行3D打印，将配置好的5％氯化钙溶液(第一交联剂)装入到雾化器中，打印过程中实时雾化氯化钙溶液进行预交联，打印完成后将打印支架浸泡于氯化钙和凝血酶的混合溶液(第二交联剂)中交联30min，其中，氯化钙浓度为5％(W/V)，凝血酶的浓度为20IU/mL。打印大小为2cm×2cm，打印针头直径为300μm，孔隙为500μm。

对比例4-6

对比例4-6分别提供一种软组织修复补片(尿道修复补片)，分别采用对比例1-3提供的软组织修复补片材料和细胞制成，软组织修复补片的具体结构以及制作方法均与实施例11相同。

对比例7

本对比例提供了一种软组织修复补片(尿道修复补片)，其中，中层和顶层的结构与实施例12不同；

具体的，中层包括采用海藻酸钠/石墨烯水凝胶和尿道上皮细胞制成的第一中层，尿道上皮细胞在每毫升海藻酸钠/石墨烯水凝胶中的数量为1×10⁵个，以及纤维蛋白/石墨烯水凝胶制成的第二中层，第一中层含有孔隙，第二中层设置于第一中层的孔隙内；

顶层包括采用海藻酸钠/石墨烯水凝胶和平滑肌细胞制成的第一顶层，平滑肌细胞在每毫升海藻酸钠/石墨烯水凝胶中的数量为2×10⁵个，以及纤维蛋白/石墨烯水凝胶制成的第二顶层，第一顶层含有孔隙，第二顶层设置于第一顶层的孔隙内。

软组织修复补片的其余结构与实施例12相同。

相应的，软组织修复补片的制作方法作相应的调整。

为了验证上述各实施例和对比例的技术效果，特设以下实验例。

实验例1

1、SEM测试

以实施例1-4、8-10和对比例1-2提供的软组织修复补片材料为例，分别将实施例1-4对应的海藻酸钠/石墨烯水凝胶、对比例1对应的海藻酸钠水凝胶、实施例1和实施例8-10对应的纤维蛋白/石墨烯水凝胶、对比例2对应的纤维蛋白水凝胶置于-80℃下预冻，然后在冷冻干燥机中干燥，喷金处理后，用扫描电镜(SEM)对样品的形貌进行表征，具体结果如图6-9所示。

从图中可以看出，与海藻酸钠水凝胶和纤维蛋白水凝胶不同，加入石墨烯的水凝胶(海藻酸钠/石墨烯水凝胶、纤维蛋白/石墨烯水凝胶)表面结构光滑，表观形态发生变化，这归因于石墨烯的存在以及在海藻酸钠和纤维蛋白水凝胶中均匀分散。在低浓度石墨烯下，海藻酸钠/石墨烯水凝胶以及纤维蛋白/石墨烯水凝胶其表面更平整光滑，随着石墨烯含量的增加，其表面出现褶皱，可能是因为石墨烯聚集而导致的。

2、溶胀性能测试

对实施例1-4提供的海藻酸钠/石墨烯水凝胶、对比例1提供的海藻酸钠水凝胶、实施例1和实施例8-10提供的纤维蛋白/石墨烯水凝胶以及对比例2提供的纤维蛋白水凝胶进行溶胀性能测试。

溶胀性能测试采用重量法研究了待测水凝胶(海藻酸钠/石墨烯水凝胶、海藻酸钠水凝胶、纤维蛋白/石墨烯水凝胶和纤维蛋白水凝胶)在去离子水中的溶胀行为，具体步骤包括：将待测水凝胶分别冷冻干燥，室温下浸泡在去离子水中。在定期间隔内，滤纸去除表面残余水之后对样品进行称重。溶胀比(SR)公式如下：

SR(％)＝(Mt-M0)/M0×100％

式中，M0和Mt分别代表待测水凝胶的初始和不同时刻的重量。

实施例1-4提供的海藻酸钠/石墨烯水凝胶和对比例1提供的海藻酸钠水凝胶溶胀性能测试结果如图10所示。从图中可以看出，在溶胀初始的60min内，实施例1-4提供的海藻酸钠/石墨烯水凝胶的溶胀速率迅速增加，之后其速率增加缓慢。与对比例1提供的海藻酸钠水凝胶相比，随着石墨烯的量增加到0.3mg/mL，海藻酸钠/石墨烯水凝胶的溶胀率最大，这可能是因为水分子与海藻酸钠中的-COOH基团形成氢键，石墨烯掺杂进去后，使水凝胶中的孔径结构变大。

实施例1、实施例8-10提供的纤维蛋白/石墨烯水凝胶和对比例2提供的纤维蛋白水凝胶溶胀性能测试结果如图11所示。从图中可以看出，在溶胀初始的1h中，实施例1、实施例8-10提供的纤维蛋白/石墨烯水凝胶的溶胀速率迅速增加，之后其速率增加缓慢。与对比例2提供的纤维蛋白水凝胶相比，随着石墨烯含量的增加，其溶胀速率减小，这可能是因为与纤维蛋白的性质有关，石墨烯作为物理交联剂，交联密度高使得水凝胶的孔径变小，抑制了水的吸收。

3、CCK-8测试

为了验证石墨烯的加入对于海藻酸钠/石墨烯水凝胶以及纤维蛋白/石墨烯水凝胶对细胞是否有毒性，特进行CCK-8实验，具体结果如图12和图13所示。从图中可以看出，在本发明所使用的石墨烯的浓度范围内，石墨烯对细胞没有大的毒性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。