一种壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶及其制备方法
阅读说明：本技术 一种壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶及其制备方法 (Chitosan-graphene oxide composite gel and preparation method thereof ) 是由 胡堃 胡苗苗 杨桂娟 王海波 李路海 危岩 于 2020-12-23 设计创作，主要内容包括：本发明开发了一种壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶及其制备方法。本发明制备的壳聚糖-矿化胶原-氧化石墨烯复合水凝胶具有成胶迅速,自愈合等特点,且具有生物3D打印适性。复合水凝胶在加入氧化石墨烯后机械性能得到增强,且多孔结构有利于细胞的粘附、生长；生物打印适性得到提高。有望作为组织工程支架材料。且制备的复合水凝胶,具备剪切变稀特性和良好的粘弹性,37℃条件下可通过生物3D打印技术构建组织工程支架。(The invention discloses a chitosan-graphene oxide composite gel and a preparation method thereof. The chitosan-mineralized collagen-graphene oxide composite hydrogel prepared by the invention has the characteristics of quick gelling, self-healing and the like, and has biological 3D printing adaptability. The mechanical property of the composite hydrogel is enhanced after the graphene oxide is added, and the porous structure is favorable for the adhesion and growth of cells; the bioprintability is improved. Is expected to be used as a tissue engineering scaffold material. The prepared composite hydrogel has shear thinning characteristic and good viscoelasticity, and the tissue engineering scaffold can be constructed by a biological 3D printing technology at 37 ℃.)
技术领域
本发明属于材料的技术领域，具体涉及一种壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶及其制备方法。
背景技术
放眼整个世界，在骨修复领域，由创伤、炎症、肿瘤等各种原因造成的骨不连、骨缺损一直是骨科治疗领域的难题，传统临床最为常见的方法便是对患者进行外科手术，但是外科手术所产生的后遗症也是难以解决的一大难题。人体的组织器官具有的多功能性是人工制造的替代品无法实现的，而移植其他人的骨组织往往也会产生自身免疫。在这些手段都存在适用性和并发症等缺陷情况下，组织工程学便起到了至关重要的作用，采取何种材料进行骨移植术一直是研究领域的重点。
具体到软骨修复领域，长期以来，临床医生和研究人员对软骨损伤的手术治疗进行了大量研究，但到目前为止，还没有办法将受损的软骨在形态学，生物化学和生物力学方面可靠地恢复正常。所以我们想到了通过组织工程学来尝试解决这个问题，其中，壳聚糖水凝胶便是一个比较好的载体。
由于水凝胶的各种可能的定义，水凝胶通常分为三类，取决于其网络的性质，即纠缠网络，共价交联网络和由二次交互作用形成的网络。后一类包含除另外两个类的所有中间情况。然而，就壳聚糖水凝胶而言，这种分类并不完全合适。当然，这些类别之间存在着不同的界限，包括纠缠的壳聚糖水凝胶共价交联的壳聚糖水凝胶。因此，对壳聚糖水凝胶进行了以下改进的分类，即化学和物理的分离水凝胶。化学水凝胶是不可逆的共价连接，如在共价交联的壳聚糖水凝胶。物理水凝胶由形成各种可逆连接。这些可以是离子相互作用离子交联的水凝胶和聚电解质复合物(PEC)，或壳聚糖中的二次相互作用/聚(乙烯醇)(PVA)络合水凝胶。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶及其制备方法。本发明是将壳聚糖用于组织工程支架材料，因为与许多合成聚合物相反，壳聚糖具有亲水性，促进细胞粘附和增殖的表面且其降解产物是无毒的，所以壳聚糖作为骨支架材料特别有吸引力。此外，研究表明改性壳聚糖支架在手术中产生的骨缺陷中表现出骨传导性。很少有化合物被分类为生物活性，可生物降解和骨传导性。壳聚糖是一种易于加工的材料用于生产各种不同孔结构的三维支架的方法骨组织工程。它也可以与各种材料如氧化石墨烯等结合，以产生具有优越机械和生物的复合支架属性。
本发明目的是通过以下方案实现的：
本发明保护一种壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、室温下，称取0.3g壳聚糖，溶解于9.2g含量为体积分数为2％稀醋酸溶液中，放置于恒温水浴锅中搅拌溶解后，得壳聚糖溶液；
S2、矿化胶原粉末的制备：胶原溶液中缓慢滴加0.055mol的PO4 3-的溶液；并将其25℃条件下进行搅拌，同时滴加钙离子水溶液；滴加结束后在搅拌的过程中滴加氢氧化钠水溶液；将其静置4小时后去上清液，洗涤过滤，冷冻干燥研磨后得到矿化胶原粉末；
S3、壳聚糖-矿化胶原复合溶液的制备：将步骤(2)制备的矿化胶原粉末分次加入步骤S1制备的壳聚糖溶液中，充分搅拌溶解；接着，向上述溶液中加入6mL浓度为0.02g/mL的氧化石墨烯分散液充分搅拌使其分散均匀；得壳聚糖-矿化胶原复合溶液；
S4、称取双端苯甲醛基聚乙二醇粉末0.3g,溶解于1.2g的去离子水中得到DF-PEG交联剂溶液；
S5、将步骤S3制备的壳聚糖-矿化胶原复合溶液和步骤S4制备的DF-PEG交联剂溶液混合在一起，搅拌均匀，得壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶。
进一步的，所述步骤S3中矿化胶原粉末与壳聚糖溶液的质量比为1％-4％。
进一步的，所述步骤S1中恒温水浴锅温度为20℃-30℃。
进一步的，所述步骤S1的搅拌时间为1-2小时。
进一步的，所述步骤S2中滴加氢氧化钠水溶液使溶液的pH值为6-8。
进一步的，所述PO4 3-溶液和钙离子水溶液的钙磷摩尔数之比为1.66。
进一步的，所述步骤S3中PO4 3-溶液为磷酸溶液。
进一步的，所述步骤S3中钙离子水溶液为氯化钙溶液。
本发明还包括一种制备方法制备的壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶。
本发明的有益效果：
写出本申请的有益效果和原理。
对本发明制备的复合水凝胶进行了一系列测试后，得出如下结论及原理解释：
(1)通过SEM扫描电镜的微观观测，在微观形态下，冻干的水凝胶保持着交联形态，各个孔隙大小都比较均匀，形成稳定且连续的三维网状结构。同时，复合水凝胶内部均形成相互贯通的多孔结构，孔径范围适宜骨细胞生长，孔径随着氧化石墨烯的加入逐渐减小。原因可能是：水凝胶多孔结构主要是由席夫碱键和内部氢键所形成，氧化石墨能与水凝胶的基体之间形成强的分子间作用力，起到物理交联点的作用，使水凝胶具有更为良好的机械性能和更加稳定的结构。这些复合水凝胶孔径的存在利于细胞的粘附、生长及营养物质的输送，是用于软骨修复的理想材料。
(2)通过流变性测试，知道了复合凝胶是非牛顿流体。随着氧化石墨烯浓度的增加，复合水凝胶的粘度会先变大后减小，在氧化石墨烯浓度为2％时达到顶峰，且复合水凝胶保持剪切变稀的特性。可用于生物3D打印构建组织工程支架。而复合水凝胶的储存模量和损耗模量在应变为2％条件下测试，角速度变化范围为0.1到100rad/s时,水凝胶的弹性模量较为稳定，不依赖于角速度变化而变化，且远高于损耗模量，证明材料性能稳定。而且，由于氧化石墨烯和矿化胶原的加入，水凝胶的弹性模量增加、机械强度增强。
(3)通过复合凝胶3D打印性能测试，得知氧化石墨烯含量为0％、1％、2％、4％时均可以成功打印出支架。但经高清图片对比之后会发现，未加入氧化石墨烯的一组3D打印支架的边框明显不是十分规整，在部分框架中还出现断裂情况，部分应出现的空隙消失。其余三个加入氧化石墨烯的打印支架成品效果明显好于氧化石墨烯含量为0％的支架，支架框架线条轮廓清晰，尤其是氧化石墨烯含量为1％的支架，成功的呈现出了各个孔隙，框架粗细均匀，各个网格大小基本一致，是四个含量中最优秀的一组。证明氧化石墨烯的加入提高了复合水凝胶的打印适性。
(4)通过复合凝胶自愈性实验，以明胶作为对照组来看，复合水凝胶的自愈性十分良好，在基于其良好的生物相容性上，我们预计这种自我修复水凝胶可能提供多样化在生物医学领域的应用，并可用于软骨修复，良好适应在体内可能出现的撕裂、断裂等情况。
综上所述，可以得到的结论是：壳聚糖-矿化胶原-氧化石墨烯复合水凝胶具有成胶迅速，自愈合等特点，且具有生物3D打印适性。复合水凝胶在加入氧化石墨烯后机械性能得到增强，且多孔结构有利于细胞的粘附、生长；生物打印适性得到提高。有望作为组织工程支架材料。且制备的复合水凝胶，具备剪切变稀特性和良好的粘弹性，37℃条件下可通过生物3D打印技术构建组织工程支架。
附图说明
图1为实施例1-实施例4CS/GO复合水凝胶的SEM图像:a)CS/GO；b)、c)、d)CS/GO/nHAC:1％,2％,4％。
图2a)壳聚糖/氧化石墨烯复合水凝胶的粘度-剪切速率曲线；b)、c)分别为壳聚糖复合水凝胶在频率范围(0.1-100rad/s)内的弹性模量(G′)和损耗模量(G″)。
图3为CS/GO复合水凝胶的溶胀率-时间的变化曲线。
图4为L929细胞与CS/nHAC复合水凝胶的OD值a)和细胞内蛋白含量b)。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面通过实施例对本发明进一步说明，实施例只用于解释本发明，并不会对本发明构成任何限定。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。所述胶原溶液采购自天津宝坻紫荆创新研究院。
实施例1
一种壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、室温下，称取0.3g壳聚糖，溶解于9.2g含量为体积分数为2％稀醋酸溶液中，放置于恒温水浴锅中搅拌1.5小时溶解后，得壳聚糖溶液；所述恒温水浴锅温度为25℃
S2、矿化胶原粉末的制备：胶原溶液中缓慢滴加0.055mol的磷酸溶液；并将其25℃条件下进行搅拌，同时滴加氯化钙溶液；滴加结束后在搅拌的过程中滴加氢氧化钠水溶液，使溶液的pH值为7；将其静置4小时后去上清液，洗涤过滤，冷冻干燥研磨后得到矿化胶原粉末；所述PO4 3-溶液和钙离子水溶液的钙磷摩尔数之比为1.66；
S3、壳聚糖-矿化胶原复合溶液的制备：将步骤(2)制备的矿化胶原粉末分次加入步骤S1制备的壳聚糖溶液中，充分搅拌溶解；接着，向上述溶液中加入6mL浓度为0.02g/mL的氧化石墨烯分散液充分搅拌使其分散均匀；得壳聚糖-矿化胶原复合溶液；所述矿化胶原粉末与壳聚糖溶液的质量比为0％；
S4、称取双端苯甲醛基聚乙二醇粉末0.3g,溶解于1.2g的去离子水中得到DF-PEG交联剂溶液；
S5、将步骤S3制备的壳聚糖-矿化胶原复合溶液和步骤S4制备的DF-PEG交联剂溶液混合在一起，搅拌均匀，得壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶。
实施例2
一种壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、室温下，称取0.3g壳聚糖，溶解于9.2g含量为体积分数为2％稀醋酸溶液中，放置于恒温水浴锅中搅拌1.5小时溶解后，得壳聚糖溶液；所述恒温水浴锅温度为25℃
S2、矿化胶原粉末的制备：胶原溶液中缓慢滴加0.055mol的磷酸溶液；并将其25℃条件下进行搅拌，同时滴加氯化钙溶液；滴加结束后在搅拌的过程中滴加氢氧化钠水溶液，使溶液的pH值为7；将其静置4小时后去上清液，洗涤过滤，冷冻干燥研磨后得到矿化胶原粉末；所述PO4 3-溶液和钙离子水溶液的钙磷摩尔数之比为1.66；
S3、壳聚糖-矿化胶原复合溶液的制备：将步骤(2)制备的矿化胶原粉末分次加入步骤S1制备的壳聚糖溶液中，充分搅拌溶解；接着，向上述溶液中加入6mL浓度为0.02g/mL的氧化石墨烯分散液充分搅拌使其分散均匀；得壳聚糖-矿化胶原复合溶液；所述矿化胶原粉末与壳聚糖溶液的质量比为1％；
S4、称取双端苯甲醛基聚乙二醇粉末0.3g,溶解于1.2g的去离子水中得到DF-PEG交联剂溶液；
S5、将步骤S3制备的壳聚糖-矿化胶原复合溶液和步骤S4制备的DF-PEG交联剂溶液混合在一起，搅拌均匀，得壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶。
实施例3
一种壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、室温下，称取0.3g壳聚糖，溶解于9.2g含量为体积分数为2％稀醋酸溶液中，放置于恒温水浴锅中搅拌1.5小时溶解后，得壳聚糖溶液；所述恒温水浴锅温度为25℃。
S2、矿化胶原粉末的制备：胶原溶液中缓慢滴加0.055mol的磷酸溶液；并将其25℃条件下进行搅拌，同时滴加氯化钙溶液；滴加结束后在搅拌的过程中滴加氢氧化钠水溶液，使溶液的pH值为7；将其静置4小时后去上清液，洗涤过滤，冷冻干燥研磨后得到矿化胶原粉末；所述PO4 3-溶液和钙离子水溶液的钙磷摩尔数之比为1.66；
S3、壳聚糖-矿化胶原复合溶液的制备：将步骤(2)制备的矿化胶原粉末分次加入步骤S1制备的壳聚糖溶液中，充分搅拌溶解；接着，向上述溶液中加入6mL浓度为0.02g/mL的氧化石墨烯分散液充分搅拌使其分散均匀；得壳聚糖-矿化胶原复合溶液；所述矿化胶原粉末与壳聚糖溶液的质量比为2％；
S4、称取双端苯甲醛基聚乙二醇粉末0.3g,溶解于1.2g的去离子水中得到DF-PEG交联剂溶液；
S5、将步骤S3制备的壳聚糖-矿化胶原复合溶液和步骤S4制备的DF-PEG交联剂溶液混合在一起，搅拌均匀，得壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶。
实施例4
一种壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、室温下，称取0.3g壳聚糖，溶解于9.2g含量为体积分数为2％稀醋酸溶液中，放置于恒温水浴锅中搅拌1.5小时溶解后，得壳聚糖溶液；所述恒温水浴锅温度为25℃
S2、矿化胶原粉末的制备：胶原溶液中缓慢滴加0.055mol的磷酸溶液；并将其25℃条件下进行搅拌，同时滴加氯化钙溶液；滴加结束后在搅拌的过程中滴加氢氧化钠水溶液，使溶液的pH值为7；将其静置4小时后去上清液，洗涤过滤，冷冻干燥研磨后得到矿化胶原粉末；所述PO4 3-溶液和钙离子水溶液的钙磷摩尔数之比为1.66；
S3、壳聚糖-矿化胶原复合溶液的制备：将步骤(2)制备的矿化胶原粉末分次加入步骤S1制备的壳聚糖溶液中，充分搅拌溶解；接着，向上述溶液中加入6mL浓度为0.02g/mL的氧化石墨烯分散液充分搅拌使其分散均匀；得壳聚糖-矿化胶原复合溶液；所述矿化胶原粉末与壳聚糖溶液的质量比为4％；
S4、称取双端苯甲醛基聚乙二醇粉末0.3g,溶解于1.2g的去离子水中得到DF-PEG交联剂溶液；
S5、将步骤S3制备的壳聚糖-矿化胶原复合溶液和步骤S4制备的DF-PEG交联剂溶液混合在一起，搅拌均匀，得壳聚糖-氧化石墨烯复合凝胶。
表征和性能测试
测试：
1、SEM(测试方法：通过SEM(Hitachi SU-8010，5KV)观察水凝胶的微孔形态。在进行SEM观察之前，将在-55℃下冷冻过夜冻干的复合水凝胶切成合适的大小，为了观察，用导电胶带将横切面朝上固定在样品台上，然后通过真空镀膜仪在横截面上喷金240s，并用SEM观察水凝胶的内部形态。通过分析相应的SEM图像来确定支架的平均孔径。
2、图2图3的测试方法：使用在受控应力下运行的旋转流变仪(AR-G2)对CS/GR复合水凝胶进行流变学测量。该仪器配有直径为25mm的不锈钢平行板几何形状和集水器，以保持水凝胶的水分恒定并最大程度地减少水的蒸发。在室温下(25℃)，所有样品的厚度约为5μm。施加的应变为1％。剪切频率从0.1到100rad/s不等，加热速率为2℃/min。粘度曲线是通过对数剪切速率扫描确定的，剪切速率为0.1s-1-100s-1。将CS/GR复合水凝胶均匀铺展在样品台上，去除凝胶中的气泡得到平整均匀厚度的表面，将平行板的上板与样品凝胶接触，随后进行数据采集。
3、测试方法：使用酶标仪，在测定其在562nm光波下的参数。
结果：
1、由图1可知，通过SEM证实了CS/GO复合水凝胶中的三维交联网络(如图1)，表明凝胶具有相互连接的多孔结构。这些相互连接的孔可以使细胞在水凝胶中生长。a-d显示出的孔径分别为245±50.75μm、232±28.51μm、178±42.63μm和156±19.17μm。随着nHAC复合量的增加，微孔孔径下降，其原因是水凝胶内部的交联密度增加。
2、如图2a)所示，CS/GO复合水凝胶都出现了表观粘度随着剪切速率的增加而减小的剪切变稀现象。在低剪切速率下，四组凝胶均有较高的表观粘度：其中矿化胶原含量为2％增强了与氧化石墨烯羧基产生的静电作用力，体系粘度最高。在高剪切速率时，剪切速率达到1s-1以上后，凝胶样品粘度值均趋于零，在高剪切速率时破坏凝胶网络，导致体系粘度降低。为了表征复合水凝胶的粘弹性能，对复合水凝胶的模量对频率的动态流变进行了表征.如图2b)、c)所示，CS/GR复合水凝胶的储能模量G′和损耗模量G″，G′远高于G″，这是典型的凝胶流变行为。说明水凝胶表现为明显的类固体行为。复合水凝胶的G′较为稳定，不依赖于角速度的变化而变化，而且加入石墨烯的复合水凝胶的G′储能模量增加、机械强度增强。以上现象都说明了壳聚糖与氧化石墨烯之间存在着交联网络体系，从而构成了稳定的复合水凝胶。。
3、由图3可知，水凝胶的溶胀随着矿化胶原含量的增加先增加后略降低，最大平衡溶胀率为4.24。这是由于水凝胶表面上存在较大的孔，这导致溶剂的快速填充。降低可以归因于nHAC大量分散在CS水凝胶孔中，从而降低了溶胀能力。
4、由图4可知，通过BCA和cck-8检测细胞内蛋白含量和细胞OD值。由图4可知，L929细胞的OD值和细胞内蛋白浓度均随时间增而增高.培养1d时，浓度不同对细胞的增殖具有一定的影响，OD值最大为1.9983。这表明CS/GO复合水凝胶在和L929细胞共培养的情况下，可以较好的促进细胞的增殖分化,具有良好的生物相容性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
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