具体实施方式

将参考附图更详细地描述本发明的优选实施例，但是为了简明起见，将省略或压缩已经众所周知的技术部分。

应当注意，在本说明书中提及的本发明的“一个”或“一种”实施例不一定是相同的实施例，但至少是指一个。

以下实施例中，第1、第2等术语的使用不是限定其意义，而是为了区别一个技术特征和其他技术特征而使用的。

以下实施例中，除非上下文另有明确说明，否则单数表达包括复数表达。

以下实施例中，‘包括’或‘具有’等术语是指存在说明书上描述的特征或技术

特征，不是提前排除一个以上的其他特征或技术特征的附加可能性。

当某个实施例可以不同地实现时，特定的工序顺序的执行有可能与描述的顺序不同。 例如，连续说明的两个工序实际上可以同时执行，也可以与说明的顺序相反的顺序执行。即，本说明书中描述的方法在各个步骤中，除非说明书中另有提及或与上下文明显矛盾，否则可以以任何顺序适当地实施。

按照图1所示的流程图说明按照本发明的一个实施例的填充剂制备方法，并参考其余附图进行说明。为了方便，将在前面加顺序说明。

1.可生物降解高分子溶液准备步骤 <S101>。

本步骤中，可将可生物降解高分子与碱性溶液混合制成可生物降解高分子溶液。在一个实施例中，可生物降解高分子可以是透明质酸及其盐中的至少任何一种。 例如，透明质酸盐可包括透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌、透明质酸钴等无机盐和透明质酸四丁基铵等有机盐。根据实施方法，透明质酸盐可以是前述种类的两个或多个组合。在一个实施例中，可生物降解高分子的重均分子量可以是100000~15000000g/mol，但并不限于此。

在一个实施例中，碱溶液可以使用氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，但是也可以使用能够溶解透明质酸的其他种类碱溶液。

在一个具体实施例中，可将透明质酸钠与0.5~1N氢氧化钠溶液混合制成10w/v％浓度的透明质酸钠，然后搅拌3-4小时，制备可生物降解高分子溶液。 此时，如果将搅拌温度保持在高温（例如60℃），可缩短搅拌时间。

2.胶束制造步骤 <S102>。

本步骤中，可将可生物降解高分子溶液与油混合，高速搅拌，制造高分子胶束。即，在本步骤中，可生物降解高分子围绕球性状的油粒子，吸附于油粒子上，形成高分子胶束。在一个实施例中，油可以使用矿物油，但不限于此，也可以使用其他种类的油。

在一个具体实施例中，可生物降解高分子溶液与矿物油可以以1：5的体积比混合。混合时，若是矿物油相比可生物降解高分子溶液的量多（例如，体积比为1:6），则在后述的微珠制造步骤中难以高产率地得到50-500μm的微珠。若是矿物油相比可生物降解高分子溶液的量少（例如，体积比为1:4），则在搅拌时发生可生物降解高分子的凝聚，微珠直径超过500μm，难以制造所需的适当尺寸的微珠。

另外，在本步骤中，叶轮可以1000~2000rpm旋转30分钟~15小时高速搅拌可生物降解高分子溶液与矿物油的混合溶液。通过叶轮的搅拌，高分子胶束的粒子尺寸可以微细化。图2是概略的显示了按照本发明的一个实施例在胶束制造步骤中使用的叶轮结构的透视图。 如图2所示，叶轮（100）可以包括单方向旋转的旋转轴(110)； 及与旋转轴（110）一起旋转的多根钢丝。

在一个实施例中，两根或三根钢丝可以一定角度相互交叉的状态固定在旋转轴（110）上。第1钢丝（121）的中央部弯曲，形成相互面向对面钢丝的形状。第1钢丝（121）的一端和另一端可以固定在旋转轴（110）上。 第1钢丝（121）具有从一端往下侧方向越来越宽的结构，因此容易搅拌溶液的下层部。 第2钢丝（122）或第3钢丝（123）的结构可以与第1钢丝（121）的结构相同。

组成叶轮（100）的钢丝数少于2根时，搅拌时分散性降低，难以形成微细尺寸的高分子胶束。钢丝多于4根时，搅拌时发生凝聚形成结块，结块粘附在相邻的钢丝之间的缝隙中，难以形成微细的高分子胶束。因此，最好把钢丝数控制在前述范围内。

3. 微珠制造步骤<S103>。

本步骤中，可通过将步骤S102中制作的的高分子胶束交联，制作内部填充了油的水凝胶微珠。 即，在本步骤中，可在步骤S102中搅拌的搅拌物中加入交联剂，按一定速度(例如，1000~2000rpm)搅拌，交联高分子胶束。另外，本步骤可在常温中进行24~72小时。

在一个具体实施例中，交联剂的含量可以是可生物降解高分子溶液与矿物油的混合物总量的2体积％。 如果交联剂的含量少于2体积％，则水凝胶微珠的形状难以做成球形，而且耐冲击性降低，即使受到一点冲击，微珠也会容易破碎。如果交联剂的含量超过2体积％ ，则水凝胶微珠的颜色会变黄或微珠的流动性降低，微珠在水合过程中体积膨胀受到限制, 而且因残留在微珠中的交联剂，有可能在人体中产生副作用。因此，交联剂的含量最好适用前述含量。

在一个实施例中，交联剂可以是从1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，N，N'-二环己基碳二亚胺，丁二醇二缩水甘油基醚，聚乙二醇二缩水甘油基醚，N-羟基琥珀酰亚胺， N-羟基磺酸琥珀酰亚胺及由它们组合而成的群中选择的至少任何一种，但并不限于此，也可以使用其他公知的交联剂。

4.空心微珠制造步骤<S104>。

本步骤中，可以把在步骤S103交联制备的水凝胶微珠中所含的油去除，制备空心微珠。此时，空心微珠指去除了微珠中所含的油后的空心状态的微珠。

在一个具体实施例中，用精制水清洗3次以上水凝胶微珠，去除微珠中所含的油，然后把用精制水清洗的水凝胶微珠放入乙醇中反应30分钟。 用精制水和乙醇重复清洗3次，可将水凝胶微珠中所含的油和水凝胶微珠中残留的交联剂、碱性盐类、未反应的交联副产物和杂质一并去除。

5. 添加剂填充步骤<S105>。

本步骤中，可在步骤S104中制备的空心状态的微珠内添加剂填充。在一个实施例中，添加剂可以是从地塞米松、抗炎剂、维生素（例如，B1、B2、B12）、抗氧化剂（例如，钙、锌等）、局部麻醉剂（例如，利多卡因）、皮肤再生因子（例如，由增强皮肤再生的精氨酸（R）-甘氨酸（G）-天冬氨酸（D）组成的RGD肽）、胶原蛋白、明胶及由它们组合而成的群中选择的至少任何一种。

另外，根据实施方法，添加剂还可以是从透明质酸、变形淀粉、普鲁兰多糖 、葡萄聚糖、聚γ谷氨酸衍生物（例如，聚γ谷氨酸的末端部位置换了1~2个 C1-C6烷基、芳基、乙酰基、置换了C1-C6烷基或芳基的乙酰基或置换了C1-C6烷基或芳基的磺酰基等的聚γ谷氨酸衍生物）、聚氨基酸衍生物（例如，聚（2-羟乙基天冬酰胺）、聚琥珀酰亚胺等）、甲基纤维素、胶原蛋白、明胶、海藻酸、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯、膳食纤维（例如，葡甘露聚糖、瓜尔胶、难消化麦芽糖糊精、大豆膳食纤维、小麦膳食纤维、大麦膳食纤维、燕麦、阿拉伯树胶、菊粉、聚葡萄糖等)、泊洛沙姆、泊洛沙姆衍生物及由它们组合而成的群中选择的至少任何一种。

按照一个具体实施例，可以把空心状态的微珠浸泡在与添加剂混合的缓冲溶液（例如，磷酸盐缓冲生理盐水、硼酸盐缓冲液、生理盐水等）中2~3小时进行水合。 在水合过程中，添加剂会渗透到水凝胶微珠内部，从而实现添加剂的填充。

6. 分类步骤<S106>。

本步骤中，可以使用具有一定尺寸孔径的筛子或打孔网，按直径分类填充了添加剂的水凝胶微珠。在一个具体实施例中，从缓冲溶液中回收水凝胶微珠后，可以筛选分类具有50~500μm直径的水凝胶微珠。

7. 混合步骤<S107>。

本步骤中，可将未交联的可生物降解高分子溶液与步骤S106中分类的微珠混合。可生物降解高分子可使用与前述种类相同的。在一个具体实施例中，可将透明质酸钠与溶剂（例如，精制水、磷酸盐缓冲生理盐水等）混合制成浓度为1-15w/v%的透明质酸钠，并在60°C中搅拌，制备未交联的可生物降解高分子溶液。在这里，未交联可生物降解高分子溶液是指由于没有在溶液中添加交联剂，因此不会发生交联剂的交联反应的溶液。

本步骤中，可将交联的水凝胶微珠和未交联的可生物降解高分子溶液以8:2的重量比混合。当使用注射器将填充剂注入到体内时，未交联的可生物降解高分子溶液可起到润滑油作用，减少挤压力。

按照一个实施例的水凝胶微珠由于是球形粒子，相比多面体（例如，立方体）形状的填充剂，即使未交联可生物降解高分子溶液的含量比其少，注入体内时，也可以与现有填充剂相同或更低的挤压力注入填充剂。因此，在注入填充剂时，具有施术方便、可减少引起疼痛可能性的优点。

而且，在本步骤中，交联的水凝胶微珠与未交联的可生物降解高分子溶液混合而成的混合溶液中还可以加入局部麻醉剂（例如，盐酸利多卡因）和功能性药物进行混合。 另一方面，按照实施方式，本步骤可比步骤S106先进行。

8. 混合物填充步骤<S108>。

本步骤中，可将混合了交联的水凝胶微珠与未交联的可生物降解高分子溶液的混合物填充到注射器中。 在一个实施例中，注射器可使用预充注射器(Prefilled syringe)。

9. 灭菌步骤<S109>。

本步骤中，可实现对填充到注射器内部的内容物的灭菌。 例如，可将注射器放进高压蒸汽灭菌器内，在110~130°C中灭菌20~40分钟。

在下文中，将通过具体实施例更详细地描述本发明。以下实施例仅为帮助理解本发明的一个实施例，本发明的权利范围并不限于此。

填充剂制造例。

将重均分子量为110万道尔顿的透明质酸钠与1N氢氧化钠溶液混合制成10w/v%浓度的透明质酸钠，然后搅拌3~4小时，制备可生物降解高分子溶液。将制备的1ml可生物降解高分子溶液与5ml矿物油混合，然后用叶轮以1000~2000rpm旋转30分钟~15小时，高速搅拌可生物降解高分子溶液与矿物油的混合溶液。搅拌时使用的叶轮结构与图2相同，使用了三根钢丝以一定角度相互交叉并固定在旋转轴上的叶轮。之后，在搅拌物中加入交联剂(丁二醇二缩水甘油醚)，以1000rpm搅拌后，

在常温中24小时交联高分子胶束。 此时，交联剂的含量为可生物降解高分子溶液与矿物油

的混合物总量的2体积％。 交联反应完成后，把制成的水凝胶微珠用精制水清洗3次，然后

把用精制水清洗过的水凝胶微珠浸泡在乙醇中反映30分钟，用精制水和乙醇反复清洗3次。

之后，把水凝胶微珠浸泡在混合了添加剂（地塞米松）的磷酸盐缓冲生理盐水中3小时，填

充添加剂。 回收填充了添加剂的水凝胶微珠后，使用筛子筛选分类50~500㎛直径的水凝胶

微珠。

将分类的水凝胶微珠与未交联的可生物降解高分子溶液（即，未交联的可生物降解高分子溶液是重均分子量为110万道尔顿的透明质酸钠以1.5 w/v%的浓度溶解在精制水中的溶液）以8:2的重量比混合。之后，在混合液中加入利多卡因盐酸盐直至浓度为0.3 w/v%，然后将混合物填充到注射器中。填充的注射器在高压蒸汽灭菌器中，以120°C灭菌40分钟，从而完成填充剂的制备。

水凝胶微珠的制造。

<实施例1, 比较例 1~4>。

将透明质酸钠与1N氢氧化钠溶液混合，使透明质酸钠的浓度达到10w/v%后，搅拌3~4小时，制备可生物降解高分子溶液。将制备的可生物降解高分子溶液与矿物油混合，用叶轮以1000~2000rpm旋转30分钟~15小时，高速搅拌可生物降解高分子溶液与矿物油的混合溶液。将可生物降解高分子溶液与矿物油混合时，含量设定为下表1中记载的数值。搅拌时使用的叶轮结构与图2相同，使用了三根钢丝以一定角度相互交叉并固定在旋转轴上的叶轮。

之后，在搅拌物中加入交联剂(丁二醇二缩水甘油醚)，以1000rpm搅拌后，在常温中24小时交联高分子胶束。此时，交联剂的含量为可生物降解高分子溶液与矿物油的混合物总量的2体积％。交联反应完成后，将制成的水凝胶微珠用精制水清洗3次，然后把用精制水清洗过的水凝胶微珠浸泡在乙醇中反映30分钟，用精制水和乙醇反复清洗3次。 之后，把水凝胶微珠浸泡在混合了添加剂（地塞米松）的磷酸盐缓冲生理盐水中3小时，填充添加剂。回收填充了添加剂的水凝胶微珠后，使用筛子筛选分类50~500㎛直径的水凝胶微珠。

【表 1】

。

<实施例 2, 比较例 5~8>。

除了按下表2中记载的内容设定了交联剂的含量，以及把按50-500μm直径分类的水凝胶微珠放进真空烘箱中，在60°C以20mmHg真空干燥1小时之外，制备水凝胶微珠时的其他事项的设定与实施例1相同。

【表 2】

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<实施例 3~4, 比较例 9~11>。

除了按下表3中记载的数值设定了叶轮的钢丝数外，制备水凝胶微珠时的其他事项的设定与实施例1相同。

【表 3】

。

水凝胶微珠的生产率评价。

为确认不同的可生物降解高分子溶液与矿物油体积比的生产率，进行了以下实验。在各实施例和比较例的制造过程中，回收填充了添加剂的水凝胶微珠后，使用筛子按尺寸对水凝胶微珠进行了分类。在制成的全部水凝胶微珠中具有50~500㎛直径的微珠所占比例超过80%时，评价为生产率优秀，低于80%时，评价为生产率不良。结果如下表4所示。

【表 4】

。

如表4所示，在实施例1中，直径为50～500μm的微珠所占比例为80％以上，可以确认特定尺寸微珠的生产率为优秀水准。 另外，把实施例1的水凝胶微珠用扫描电子显微镜（倍数×100）拍摄确认的结果，如图3所示，可以看出形成了像球一样圆且光滑的球形水凝胶微珠。

然后，在比较例1和2中，矿物油的量相比可生物降解高分子溶液的量少时，在搅拌过程中发生可生物降解高分子的凝聚和结块现象，制成的微珠的直径超过500㎛，确认具有特定尺寸微珠的生产率低。在比较例3和4 中，矿物油的量相比可生物降解高分子溶液的量多时，形成多个粒子尺寸小于50㎛ 的微珠，确认具有特定尺寸微珠的生产率低。

水凝胶微珠的物理性能评价。

为确认根据不同的交联剂含量的水凝胶微珠的物理性能，进行了以下实验。用扫描电子显微镜（x40）观察每个实施例和比较例的水凝胶微珠，确认微珠的形状，如果微珠形状是球形，评价为形状良好，如果微珠外观变形或不均匀，评价为形状不良。另外，在搅拌物中加入交联剂，确认在搅拌过程中是否发生变色，如果不发生变色，评价为良好，如果发生变色，评价为不良。然后，将每个实施例和比较例的水凝胶微珠浸泡在在37°C恒温水槽中放置了2小时的磷酸盐缓冲生理盐水中24小时，进行水合，然后用显微红外光谱仪测量水凝胶微珠的面积。比较水合前的水凝胶珠微面积与水合后的水凝胶微珠面积（㎛2），如果面积增加20倍以上，评价为微珠的膨胀性良好，如果面积增加少于20倍，评价为不良。每个测试结果如下表5所示。

【表 5】

。

如表5所示，实施例2确认微珠形状良好，未发生变色，微珠膨胀性良好，而比较例5如图4所示，形成变形的外观。比较例6 如图5所示，微珠的表面凹凸不平或变形，未能形成像球一样圆的圆形形状。比较例7如图6所示，在搅拌物中加入交联剂搅拌的过程中，颜色变黄。比较例8也确认颜色变成淡黄色。此外，在比较例7和8中，确认随着交联剂的投入量增加，微珠的交联度会增加，而膨胀性会降低。

根据叶轮结构的水凝胶微珠的物理性能评价。

为确认叶轮结构对水凝胶微珠物理性能的影响，进行了以下实验。 在各实施例和比较例的制造过程中，回收填充了添加剂的水凝胶微珠后，用筛子将水凝胶微珠按尺寸分类，若所有微珠中具有50~500㎛直径的微珠所占比例为80%以上，评价为生产率优秀，若小于80％，评价为生产率不良。结果如下表6所示。

【表 6】

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如表6所示，实施例3和4中，具有50～500μm直径的微珠所占比例为80％以上，可确认特定尺寸微珠的生产率为优秀水准。比较例9中，在使用叶轮搅拌过程中未能顺利进行粒子的微细化，确认水凝胶微珠的生产率低。比较例10和11中，搅拌时发生凝聚，形成结块，结块粘附在相邻的钢丝之间的缝隙中，确认具有50~500㎛直径的微珠的生产率低。

如上所述，按照本发明的各种实施例，由于在胶束制造步骤中通过叶轮(100)的搅拌制备了大量的具有50~250㎛直径的高分子胶束，因此可以简化按直径分类水凝胶微珠的工序，缩短工序时间，提高工作效率和生产率。而且，即使在胶束制造步骤中把可生物降解高分子溶液和油的量设定为大量，也可以以一定的产量生产50-250μm直径的水凝胶微珠。因此，可以大规模的生产具有特定尺寸的微珠。

如果水凝胶微珠的直径小于50㎛，注入体内时，组织修复效果降低，会被巨噬细胞的巨噬功能迅速被分解，微珠有可能被吸收到真皮层或移动到血液中产生副作用。直径超过250μm的微珠注入到体内时，会增加挤压力，给患者带来疼痛，施术者难以注射，注入后也难以形成精致自然的形状。而在本发明的各种实施例中，可以容易且高产率地生产具有50~250㎛直径的水凝胶微珠。

而且，按照本发明的各种实施例，可以大量制备具有像球一样圆且表面光滑的球形水凝胶微珠。同时，水凝胶微珠的表面经过交联，具有一定的强度，在体内不易变形，可长时间保持其形状。

制作水凝胶后，通过机械加工形成微珠形状的现有微珠，由于在微珠内部含有与表面成分相同的交联的水凝胶，因此在结构上难以装入有用物质或实现缓释功能。但是，按照本发明的各种实施例，通过制造空心形状的微珠，在微珠内部填充各种功能性添加剂，可以实现随着时间的推移，添加剂从微珠中持续释放的缓释功能。

并且，按照本发明的各种实施例，可通过调节交联剂的含量，防止交联剂引起的副作用。 此外，与制作水凝胶后通过机械加工形成微珠形状的现有微珠相比，即使使用相同含量的交联剂，按照本发明的各种实施例的水凝胶微珠，由于在微珠的表面部集中发生交联反应，因此表面层的交联度高，相比在微珠内外部发生交联反应的现有微珠，可在人体内更长时间保持其形状。

还有，与现有的填充剂产品相比，按照本发明的各种实施例的填充剂含有少量的未交联透明质酸，相对含有高含量的交联透明质酸，因此具有在人体内持续时间更长的优势。

如上所述，对本发明的具体描述是通过参照附图的实施例进行的。但是，上述实施例只是描述了本发明的优选实施例，不应被理解为本发明局限于上述实施例。本发明的权利范围应被理解为是后述的权利要求及其均等概念。

符号说明

100 : 叶轮；

110 : 旋转轴；

121 : 第1钢丝；

122 : 第2钢丝；

123 : 第3钢丝。