分离混合物的调节方法
阅读说明：本技术 分离混合物的调节方法 (Method for conditioning a separation mixture ) 是由 塞德里克·普里厄 埃里克·瓦莱里 于 2018-11-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种在包括多个色谱柱的系统中分离混合物的方法,该方法以循环的方式在系统的给定部分中依次包括：收集提余液的步骤,注入待分离混合物的步骤,收集提取物的步骤和注入流动相的步骤；该方法进一步包括：在系统节点中确定代表待分离混合物中含有的一种或多种物质的浓度的变量的时间相关曲线；在时间相关曲线内检测位于收集提取物的步骤的起点与随后的收集提余液的步骤的终点之间的特征点；将所述特征点位置与目标位置进行比较；调节特征点的承载体积,改变所述特征点的位置以使所述特征点的位置更接近目标位置；每个周期注入的流动相的体积保持大于或等于最小阈值和/或小于或等于最大阈值。本发明还涉及用于执行这种方法的步骤的计算机程序,记录有所述程序的存储介质和包括处理器的系统,所述处理器偶联到存储器,所述存储器记录了所述的程序。(The invention relates to a method for separating a mixture in a system comprising a plurality of chromatography columns, which method comprises, in succession in a given part of the system, in a cyclic manner: a step of collecting the raffinate, a step of injecting the mixture to be separated, a step of collecting the extract and a step of injecting the mobile phase; the method further comprises the following steps: determining in the system node a time-dependent curve of a variable representative of the concentration of one or more substances contained in the mixture to be separated; detecting characteristic points within the time-dependent curve between the start of the step of collecting the extract and the end of the subsequent step of collecting the raffinate; comparing the feature point locations to a target location; adjusting the bearing volume of the characteristic point, and changing the position of the characteristic point to enable the position of the characteristic point to be closer to a target position; the volume of mobile phase injected per cycle remains greater than or equal to a minimum threshold and/or less than or equal to a maximum threshold. The invention also relates to a computer program for performing the steps of such a method, a storage medium having said program recorded thereon and a system comprising a processor coupled to a memory having said program recorded thereon.)
技术领域
本发明涉及一种分离混合物的色谱方法。
背景技术
色谱法是一种基于混合物中的化合物在流动相和固定相之间的分布差异的分离技术。通过在填充有固定相的装置(称为柱或池)中渗滤包含液态，气态或超临界溶剂的流动相来分离化合物，其中，当全部或部分化合物与其余物质相比具有不同的渗滤速度时，实现分离。该方法作为一种分析技术使用，以识别和定量混合物中的化合物。它也可以用作纯化技术。
根据需要，使用各种色谱方法来进行分子的纯化。一些色谱方法描述在文献LargeScale Adsorption and Chromatography，P.C.Wankat，CRC press，Boca-Raton，1986，Adsorption and Ion Exchange，M.D.Le Van等，Perry's Chemical Engineers'Handbook第7版，第16部分，Mac Graw-Hill，N-1，1997，以及文献Choice and optimization ofoperating mode in industrial chromatography，R.M.Nicoud等人，Proceeding of the9th International Symposium on preparative and industrial chromatography，PREP92，1992年4月，Nancy，第205-220页中。这些方法可以根据几个标准进行分类：该方法可以是不连续的或连续的，该系统可以具有一个或多个色谱柱，洗脱液的组成可以是等梯度的，或者可以使用梯度。
已经描述了用于调节这些方法的几种方法，特别是在文献FR2699917，US5457260，FR2762793，DE19842550，US2005/0107895和论文Optimal operation of simulatedmoving bed chromatography methods by means of simple feedback control，H.Schramm等人，Journal of Chromatography A，2003，1006卷，第3-13页中。
文献EP0878222描述了一种SMB设备，该SMB设备包括位于流体循环通道中的至少一个浓度检测器，位于出口管线中的用于测量提取物和/或提余液中的化合物浓度的装置，以及用于根据来自浓度检测器和位于出口管线中的装置的浓度数据确定控制设备运行的条件的操作控制器。
文献WO2007/101944描述了一种色谱方法，其中检测器确定色谱设备的节点处的变量的时间相关曲线(history)。在该时间相关曲线上检测：包括待分离混合物的注入的位于在提余液收集物和连续提取物收集物之间的区域中的特征点，位于吸附前沿的特征点，位于解吸前沿的特征点，其中将这些点的位置与目标位置进行比较。然后调整带有这些特征点的区域中的流动相的量，以使特征点的位置与其目标位置一致。
该方法特别使得可以最大化所处理的混合物的量，但是缺点在于不能控制所注入的流动相的量。然而，在某些应用中，能够尽可能准确地控制用于分离混合物中化合物的流动相的体积是有用的，特别是为了控制洗脱液的消耗或浓缩纯化产品的所需能量的量。另外，如果注入的洗脱液的量太低，则收集的馏分的粘度可能变得太高，这对于它们的后续处理，特别是它们通过蒸发器而言可能是不利的。
因此，需要提供一种调节色谱分离的方法，其中优化操作参数以满足纯度或收率的限制，同时允许精确控制注入的流动相的体积，而无需使用分离模型或复杂算法。
另外，在多柱循环色谱法中以及在色谱系统中的任一点，物质的浓度都会周期性地不断变化。但是，色谱系统中可能存在不对称性，从而导致从一个色谱柱到另一个色谱柱收集的馏分的成分存在差异。
因此，通常需要使用离线样品收集装置来获得所收集馏分的精确纯度，所述离线样品收集装置至少在一定时期内(优选一个周期)采集离开色谱系统的流体(即出口管线中的流体)的样品。该离线设备允许存储代表性流体，该流体被隔离并随后分析，其中该分析的执行需要一定的时间。在每次分析之间，对离线样品收集装置进行吹扫、清洁并准备进行新的测量。除了使分析装置更加复杂之外，这些吹扫、清洁和准备步骤还可能会妨碍在每个周期内进行测量。
因此，需要提供一种用于测量所收集馏分的纯度的简化方法，从而可以省去专门用于分析从出口管线中采集的样品的离线收集装置。
发明内容
本发明首先涉及一种在包括多个色谱柱的系统中分离混合物的方法，该方法以循环的方式在系统的给定部分中依次包括：
收集提余液的步骤，注入待分离混合物的步骤，收集提取物的步骤和注入流动相的步骤；
该方法进一步包括：
-在系统节点中确定代表待分离混合物中含有的一种或多种物质的浓度的变量的时间相关曲线；
-在所述时间相关曲线上检测位于收集提取物的步骤的起点与随后的收集提余液的步骤的终点之间的特征点；
-将所述特征点位置与目标位置进行比较；
-调节承载特征点的体积，改变所述特征点的位置以使所述特征点的位置更接近目标位置；
-每个周期注入的流动相的体积保持大于或等于最小极限和/或小于或等于最大极限。
根据实施方案，该系统包括区域1、2、3和4，区域1位于流动相注入管线和提取物收集管线之间，区域2位于提取物收集管线和待分离混合物注入管线之间，区域3位于所述待分离混合物的注入管线和提余液收集管线之间，区域4位于所述提余液收集管线和所述流动相注入管线之间，以及承载特征点的体积是区域1的承载量或区域4的承载量。
根据实施方案，每个周期注入的流动相的体积保持为恒定值。
根据实施方案，相对于注入流动相的步骤的位置和/或相对于收集提取物的步骤的位置和/或相对于收集提余液的步骤的位置来定义特征点的目标位置。
根据实施方案，代表待分离混合物中包含的一种或多种物质的浓度的变量选自旋光度，吸光度，光谱辐射的发射，折射率，密度，电导率，pH及其组合。
根据实施方案，特征点选自时间相关曲线的局部最小值，时间相关曲线具有确定值的点，以及时间相关曲线的对应于绝对或相对限定的值的两个点的重心。
根据实施方案，该方法还包括以下步骤：
-检测选自提取物和提余液的至少一种收集馏分的纯度和/或收率；
-将测得的纯度和/或测得的收率与目标纯度和/或目标收率进行比较。
根据实施方案，该方法包括以下步骤：
-检测提余液的纯度和/或收率以及提取物的纯度和/或收率；
-将各个馏分的测得的纯度和/或测得的收率分别与目标纯度和/或目标收率进行比较。
根据实施方案，该方法进一步包括根据测得的纯度和/或收率和目标纯度和/或收率之间的差异，改变每周期注入的待分离混合物的体积的步骤。
根据实施方案，该方法进一步包括：根据所测得的纯度和/或收率和目标纯度和/或收率之间的差异，改变每周期注入的流动相的体积的步骤。
根据实施方案，该方法进一步包括：根据测得的纯度和/或收率与目标纯度和/或收率之间的差异，共同改变每周期注入的混合物的体积和每周期注入的流动相的体积。
根据实施方案，该方法还包括根据测得的纯度和/或收率与目标纯度和/或收率之间的差异，定义目标位置的步骤。
根据实施方案，该方法还包括：
-在系统节点中确定变量的时间相关曲线，该变量代表待分离混合物中所含一种或多种物质的浓度；
-在所述时间相关曲线上检测位于提余液收集步骤的起点与随后的提取物收集步骤的终点之间的另一个特征点；
-将所述另一个特征点的位置与目标位置进行比较；
-调整承载所述另一个特征点的体积，改变所述另一个特征点的位置，以使它更接近其目标位置。
根据实施方案，待分离混合物的注入是连续流。
根据实施方案，该方法是模拟移动床方法。
根据实施方案，待分离混合物的注入是不连续的。
根据实施方案，该方法是顺序模拟移动床方法。
根据实施方案，待分离混合物包含一种或多种单糖，优选葡萄糖和果糖，并且提取物和提余液富含不同的单糖。
根据实施方案，每个周期注入的流动相的体积保持大于或等于最小极限和/或小于或等于最大极限，并且该方法包括：
-在系统节点中确定变量的时间相关曲线，该变量代表待分离混合物中所含一种或多种物质的浓度；
该方法如下：
-只要每个周期注入的流动相的体积大于或等于所述最小极限，或者小于或等于所述最大极限，则该方法包括：
·在所述时间相关曲线上检测在收集提取物的步骤的起点与随后的注入流动相的步骤的终点之间的第一特征点；
·在所述时间相关曲线上检测在注入流动相的步骤的起点与随后的提余液收集步骤的终点之间的第二特征点；
·将每个特征点的位置与各自的目标位置进行比较；
·调整承载第一特征点的体积和承载第二特征点的体积，修改第一特征点和第二特征点的位置，以使它们更接近其各自的目标位置；
-当每个周期注入的流动相的体积达到最大或最小极限时，该方法包括：
·在所述时间相关曲线上检测在收集提取物的步骤的起点到随后的收集提余液的步骤的终点之间的特征点；
·将特征点的位置与目标位置进行比较；
·调整承载特征点的体积，修改特征点的位置，使特征点的位置更接近目标位置。
本发明还涉及一种包括程序代码指令的计算机程序，当所述程序在计算机上执行时，所述程序代码指令用于执行如上所述的方法的步骤。
本发明还涉及记录有如上所述的计算机程序的计算机可读存储介质。
本发明还涉及一种系统，该系统包括偶联到存储器的处理器，所述存储器记录了如上所述的计算机程序。
本发明能够克服现有技术的缺点。
根据第一方面，其基于色谱分离系统的调节，使得可以优化操作参数，例如流速或阶段，并具有以下特性中的一个或多个有利特性：
-该方法使得可以满足所收集馏分的纯度和/或收率的要求，
-该方法通过支持色谱系统固有的惯性和/或通过支持潜在的分析时间延迟，特别是在纯度和收率分析中，使得可以适应色谱条件的变化，
-该方法使得可以满足对注入的流动相的体积的约束，无论是不超过的最大体积还是要遵守的最小体积。
本发明基于：
-使用一个称为“低浓度”的特征点，该特征点位于在收集提取物的步骤的起点与随后的收集提余液的步骤之间的代表性变量的时间相关曲线上，通过调节承载所述特征点的体积使其位置回到目标位置；以及
-为每周期注入的流动相体积设置最小限制和/或最大限制。
在文献WO2007/101944中，控制了分别指示吸附和解吸的时间相关曲线的两个特征点(参见图22和23以及相应的说明书段落)。根据本发明，控制单个特征点，而不是这两个特征点。与文献WO2007/101944的教导相比，这种不完美地限定两个吸附和解吸前沿的位置的单个特征点的位置的控制，使得有可能反过来以精确的方式控制要每个周期中注入的流动相的量，并且特别是确保了在注入的流动相的最大和/或最小量之间的可控变化。
根据第二方面，本发明基于一种或多种所收集馏分的纯度(和/或收率)的测量，该测量不需要专用于分析所收集馏分的纯度的离线收集装置。它具有以下一项或多项有利属性：该方法允许快速简单地测量所收集馏分的纯度，该方法可以节省清洁事项，该方法可以简化进行纯度测量所需的设备，并还使得可以提高测量频率，因为省去了周期性收集代表性样品、清洁和准备设备的步骤。
这通过使用至少一个在线检测器并通过该检测器确定代表待分离混合物中所含的至少两种物质的浓度的至少两个变量的时间相关曲线来实现。诸如光谱仪的检测器可用于测量几个代表性变量。该纯度测量可用于装置监控，或与各种控制算法的使用相结合。
根据第三方面，本发明基于一种或多种所收集馏分的纯度(和/或收率)的测量，该测量不需要专用于分析所收集馏分的纯度的离线收集装置。本发明具有以下中的一个或多个优点：该方法适合于使用慢速检测器，并且可以在不能使用快速检测器时实施，该方法可以在常规装置中实施，在该常规装置中存在在诸如浓缩装置的另一系统之前的储罐，该方法不需要在每次纯度分析之间都需要清洗和清洁的设备。
这是通过测量存在于收集馏分的出口管线上的中间罐中收集的馏分的物质的浓度而实现的。该纯度测量设备可用于装置监控，或与不同的控制算法的使用相结合。
在一些实施方案中，结合本发明的第二方面来实施本发明的第一方面。
在一些实施方案中，结合本发明的第三方面来实施本发明的第一方面。
附图说明
下列图是通过累积色谱法，尤其是通过SMB或SSMB方法获得的。
图1呈现密度时间相关曲线，在其上描绘了低浓度特征点的三个示例。横坐标轴对应于体积指数，该体积指数表示在观察节点处观察到的体积与在一个周期内在观察节点处观察到的总体积的比例。纵轴对应于密度。
图2呈现旋光时间相关曲线，在其上描绘了低浓度特征点的三个示例。横坐标轴对应于体积指数，该体积指数表示在观察节点处观察到的体积与在一个周期内在观察节点处观察到的总体积的比例。纵轴对应于极性。
图3和图4示出了在实施根据本发明的方法期间获得的密度时间相关曲线，其中施加了最大洗脱液体积(图3)或最小洗脱液体积(图4)的约束。在此时间相关曲线上，描绘了洗脱液进样(PM)的位置，吸附的特征点(图右侧的符号“O”)及其目标位置(图右侧的符号“+”)，解吸的特征点(图左侧的符号“O”)及其目标位置(图左侧的符号“+”)，低浓度的特征点(符号“◇”)及其目标位置(符号“x”)。横坐标轴表示在观察节点处观察到的体积与在一个周期内在观察节点处观察到的总体积的比例。纵坐标轴对应于密度。提取物的收集物表示为E，提余液的收集物表示为R。
图5.A、5.B和5.C呈现待分离物质的浓度图(以g/L计)，它是进料量与装填树脂量(床体积{BV})之比的函数，用各种进样量通过根据以下实施例部分的色谱模拟模型获得。所监测的物质是葡聚糖(DPn{聚合度}大于1)(菱形的曲线)、葡萄糖(正方形的曲线)和果糖(三角形的曲线)的混合物。图5.A表示在脉冲加载期间获得的浓度图，图5.B表示在高浓度下饱和期间获得的浓度图，而图5.C代表在低浓度下饱和过程中获得的浓度图。
图6、7、8显示了在执行实施例1中描述的方法期间解吸(图6)、吸附(图7)、低浓度(图8)的测量特征点位置，以及这些特征点中每个特征点的各自目标位置(作为相对于周期体积的体积比，相对于洗脱液注入的平均位置的比例)作为周期数量的函数的变化。特征点的目标位置由符号“o”表示，在执行采用吸附和解吸的两个特征点但没有限制洗脱液体积的控制方法中测量的特征点的位置用符号“+”表示，而在执行采用低浓度特征点并具有最大洗脱液体积限制的调节方法中测量的特征点的位置用符号“x”表示。
图9和13呈现在执行实施例1和2中所述方法期间每个周期的洗脱液消耗量(床体积{BV})作为周期数的函数的变化。施加的最大洗脱液量(图9)或最小洗脱液量(图13)的约束值用符号“o”表示，在执行采用吸附和解吸两个特征点且没有洗脱液体积限制的调节方法期间每个周期的实际洗脱液消耗量用符号“+”表示，而在执行采用低浓度特征点且具有洗脱液体积限制的调节方法期间，每个周期的实际洗脱液消耗量用符号“x”表示。
图10、11和12呈现与图6、7和8相同的数据(以相同的方式表示)，但是在执行实施例2中所述方法期间获得，符号“x”表示在执行采用低浓度特征点和最小洗脱液体积限制调节的方法期间检测的特征点的位置。
图14、15、16、17、18和21显示了在执行实施例3(图14)、实施例4(图15)、实施例5(图16、17和18)和实施例7(图21)中所述方法期间，纯度和收率(左侧的纵坐标，以百分比表示)以及洗脱液和进样混合物体积(右侧的纵坐标，作为与柱体积(床体积{BV})相比的体积比)作为周期数的函数的变化。目标纯度由灰色“□”符号表示(曲线1)，目标收率由灰色“o”符号表示(曲线2)，测得的纯度由灰色“■”符号表示(曲线3)，测得的收率由灰色“·”符号表示(曲线4)，每个周期的洗脱液注入量由黑色的“x”符号表示(曲线5)，而每个周期待分离混合物的注入量由符号“+”表示(曲线6)。
图19和20显示了在校准实施例6的旋光仪期间获得的葡萄糖(图19)和果糖(图20)的旋光度作为温度和葡萄糖(图19)和果糖(图20)的浓度的函数的变化。横坐标轴对应于以g/L计的物质(葡萄糖或果糖)的浓度。纵坐标轴对应于旋光度。在20℃(符号“◆”)、35℃(符号“■”)、45℃(符号“▲”)、55℃(符号“x”)和65℃(符号“ж”)的温度下测量旋光度。
具体实施方式
现在在以下描述中以非限制性方式更详细地描述本发明。
色谱分离方法的一般介绍
本发明(在其三个方面)涉及一种在包括一组包含固定相的数个色谱柱的系统中分离混合物的方法，其中该方法包括以循环方式在所述系统的给定部分中连续进行：
-收集提余液的步骤，注入待分离混合物的步骤，收集提取物的步骤和注入流动相的步骤。
上面的不同步骤在所述系统的这一部分中相互衔接。所讨论的系统的部分优选地位于一个色谱柱的出口与下一个色谱柱的入口之间。或者，所讨论的系统的部分可以包括色谱柱或色谱柱的部分。
在给定时刻，可以在所述系统的一个或多个部分中同时实施一个或多个上述步骤。例如，可以在所述系统的各个部分中同时执行所有这些步骤。
“待分离混合物”是指含有至少两种物质，例如至少一种关注的物质和至少一种杂质的多种物质(或化合物，尤其包括分子)的混合物。待分离混合物当由两种物质组成时，可以是二元的；当由大于两种的物质组成时，可以是复杂的。可以将待分离混合物稀释在液相中，优选在色谱法中使用的流动相中。
根据实施方案，待分离混合物包含一种或多种选自以下的物质：
-单糖类糖，例如葡萄糖，果糖，脱氧核糖，核糖，***糖，木糖，来苏糖，核酮糖，木酮糖，阿洛糖，阿卓糖，半乳糖，古洛糖，艾杜糖，甘露糖，塔罗糖，阿洛酮糖，山梨糖或塔格糖，和/或多糖类糖，例如低聚半乳糖，低聚果糖或木材水解物(wood hydrolyzate)，和/或
-蛋白质，和/或
-氨基酸，和/或
-有机酸，例如柠檬酸，和/或
-矿物盐，和/或
-离子化物质，和/或
-醇类和/或二醇类，和/或
-来自天然或酶或发酵介质的有机酸。
该列表不是穷举式的，本发明在整体上可以在任何形式的任何待分离的化学物质上进行。
在某些实施方案中，待分离混合物包含一种或多种单糖。优选地，提取物和提余液富含不同的单糖。有利地，单糖具有5或6个碳原子。优选地，单糖选自葡萄糖，果糖，脱氧核糖，核糖，***糖，木糖，来苏糖，核酮糖，木酮糖，阿洛糖，阿卓糖，半乳糖，古洛糖，艾杜糖，甘露糖，塔罗糖，阿洛酮糖，山梨糖，塔格糖及其混合物。在某些特别有利的实施方案中，待分离混合物包含葡萄糖和果糖。
在这种情况下，根据本发明的第一方面的方法是特别有利的，因为洗脱液的消耗在这些单糖的分离中占主要成本。
在本申请中，术语“待分离混合物”，“进料”，“待处理混合物”，“待纯化产品”和“初始混合物”表示相同的意思。术语“流动相”和“洗脱液”在本申请中应理解为相同的意思。
“提余液(raffinate)”是指富含被固定相较少保留的物质的馏分。在初始二元混合物的情况下，这是富含最少保留物质的馏分。
“提取物(extract)”是指富含被固定相最多保留的物质的馏分。在初始二元混合物的情况下，这是富含最多保留物质的馏分。
色谱柱优选地以串联方式且以环路方式布置，一个色谱柱的出口连接到下一个色谱柱的入口，最后一个色谱柱的出口连接到第一色谱柱的入口。
这些色谱柱也可以称为色谱“池”。它们可以以轮盘系统(carousel system)方式使用，布置成一个接一个，或者甚至布置成在一个或两个塔内一个在另一个上方，以限制占地面积。
色谱柱可以包含液体或固体固定相。洗脱液可以是气态、液态甚至是超临界状态的流体。在不同色谱柱的入口处设置用于待分离混合物和洗脱液的注入管线，而在这些色谱柱的出口处设有用于收集提取物和提余液的管线。优选地，注入和收集管线通过两个连续色谱柱之间的连接管线连接。
在某些有利的实施方案中，该系统还包括用于对注入和收集管线进行排序的构件。特别是，这些注入和收集管线的排序是在系统运行周期内进行的。在本申请中，“操作周期”或“周期”表示注入和收集管线已被排序直到它们返回到系统中的初始位置为止的时间。在周期结束时，系统再次处于初始配置。一个周期通常具有与分离环路中的色谱柱一样多的阶段。因此，在8个色谱柱系统上执行的方法的周期由8个阶段组成。
在本说明书中，系统中收集管线(提取物和提余液)和注入管线(负载相和流动相)的移位也称为管线切换。
我们通常可以在系统中定义四个区域(尤其是当执行的方法是SMB方法时，如下所述)：
-位于洗脱液注入管线和提取物收集管线之间的区域1，
-位于提取物收集管线和待分离混合物的注入管线之间的区域2，
-位于待分离混合物的注入管线和提余液收集管线之间的区域3，以及
-位于提余液收集管线和洗脱液注入管线之间的区域4。
根据本发明的方法有利地是周期性色谱存储方法。
“累积方法”指的是这样一种色谱方法，其中将待分离混合物的注入***或添加到从色谱柱的出口到入口的非零浓度分布中。
这种累积方法的示例是SMB方法，VariCol方法，Powerfeed方法，ModiCon方法，iSMB方法或SSMB方法。
模拟移动床方法(或SMB)是一种连续的多色谱柱方法，待分离混合物的注入在整个周期内进行。
SMB方法尤其可以是具有四个区域的SMB方法。在这种情况下，该系统包括一组以串联方式并以环路方式安装的色谱柱，一个色谱柱的出口连接到下一个色谱柱的入口。该系统包括至少一条用于注入待分离混合物的管线，一条用于收集富含几乎没有被固定相保留的物质的馏分(提余液)的管线，一条用于注入洗脱液的管线以及一个用于收集富含更能被固定相保留的物质的馏分(提取物)的管线。注入管线(待分离混合物和洗脱液)和馏分收集管线在环路内沿流经环路的流体流动方向周期性且同步地移动(同步排序)。一个色谱柱的所有注入和收集管线的两次移位之间的持续时间对应于一个阶段；在周期结束时，所有点都将返回其初始位置，系统将进行循环操作。一个周期具有与色谱柱一样多的阶段。
根据本发明的方法可以是连续注入待分离混合物的方法(即，其中待分离混合物的注入是连续流的方法)。然后在整个周期中都进行待分离混合物的注入。根据本发明的方法也可以是准连续注入待分离混合物的方法。在某些特别有利的实施方案中，根据本发明的方法是SMB方法，优选是具有四个区域的SMB方法。
或者，根据本发明的方法可以是其中不连续注入待分离混合物的方法。在这些方法中，待分离混合物的注入不是在整个周期中都进行的，而是总持续时间少于一个周期。如文献EP0342629和US5,064,539中所述，已提及称为iSMB方法(改进的模拟移动床)的不连续注入分离方法。在这种方法中，系统在闭合环路中一步运行，而无需注入或收集产品。我们还可以引用SSMB方法(顺序模拟移动床)，其例如在文献WO2015/104464中描述为顺序多色谱柱方法。优选地，涉及不连续注入待分离混合物的根据本发明的方法为SSMB方法。
调节方法
根据本发明的第一方面的方法包括：
-在系统节点中确定变量的时间相关曲线，该变量代表了待分离混合物中包含的一种或多种物质的浓度；
-在所述时间相关曲线上检测在收集提取物的步骤的起点与随后的收集提余液的步骤的终点之间的特征点；
-比较特征点位置与目标位置；
-调节承载特征点的体积，调整特征点的位置以使特征点的位置更接近目标位置；
-使每个周期注入的流动相的体积保持在最小极限以上和/或最大极限以下。
“系统节点”或“观察节点”是指可以自由选择的色谱系统的物理点。
在一些实施方案中，观察节点位于系统中的一个色谱柱的出口与下一个色谱柱的入口之间。
我们称“时间相关曲线(history)”为表示系统中待运动分离的混合物中所含一种或多种物质的浓度的变量的状态或变化，该状态在观察节点处被考虑确定的持续期间或时间。因此，我们可以测量代表观察节点处流动的待分离混合物中所含一种或多种物质的浓度的变量的变化。所述时间相关曲线可以表示为：
-作为时间的函数的变化，例如但不限于以总时间表示，或以相对于周期起点所经过的时间或对总周期时间的对比时间表示；
-作为液体流体，优选在观察节点处流动的流体，随时间的积分的函数的变化，例如，非限制性地，以总体积表示，或以与周期起点相比流动的体积或对另一体积(色谱柱的体积或总周期体积)的对比体积表示，这种方法在阶段或周期过程中流速可变的情况下特别有利；
-作为周期中的进展指标的更一般的变化。
因此，时间相关曲线可以是时间上的、体积上的或取决于方法周期的设置。
时间相关曲线与浓度曲线不同。在系统中流动的流体的馏分的浓度曲线被称为“浓度曲线”，该状态在整个系统上的一个给定瞬间被考虑。在本说明书的开头引用的文献FR2699917描述了使得可以重构浓度曲线的步骤。
在其间确定变量状态的持续时间，即在其间确定时间相关曲线的持续时间，例如可以是一个操作周期。在该周期结束时，时间相关曲线可以重置并重启。持续时间也可以短于操作周期。
如上所述，时间相关曲线的横坐标可以非限制性地以不同单位表示：
-总时间：则坐标轴从0开始并在周期时间的有效终点处结束；
-对比时间(reduced time)，用总时间除以周期时间来定义：在这种情况下，时间相关曲线的坐标轴始终在0和1之间；
-周期中的进展指数：这是总时间除以周期时间的泛化；在存在有计划的洗脱速率停止的情况(其持续时间可以变化)下，这很有意义；
-对应于在系统节点处观察到的体积除以在观察节点处观察到的总体积的体积指数。
在有利的实施方案中，色谱系统包括检测器，并且可能包括多个检测器，所述检测器位于获得代表待分离混合物中所包含的一种或多种物质的浓度的变量的时间相关曲线的系统节点处。
该检测器可以是例如密度仪，旋光仪，电导仪，折光仪，红外、近红外、拉曼或紫外/可见光谱仪或在线核磁共振设备。
检测器可以位于系统上，即位于系统本身的管线上。在这种情况下，我们可以认为流体循环通过检测器。这对于系统中的低流体流速是有利的。为了获得更高的流速，可能最好重新放置管线检测器，其中检测器放置在旁路管线上。
根据本发明的方法包括在系统节点处确定表示待分离混合物中包含的一种或多种物质的浓度的变量的时间相关曲线的步骤。因此，借助于一个或多个如上所述的检测器确定代表一种或多种物质的浓度的变量的状态。
如果检测器允许，此变量可以是混合物中一种或多种物质的浓度。在其他实施方案中，在该步骤期间，代表一种或多种物质的浓度的变量不是浓度本身，也不是馏分的纯度本身。与必须测量浓度或纯度(这种测量可能很复杂，因此需要很长时间)相比，这样的优点是可以更快地调节操作。此外，由于不需要测量纯度或浓度，因此没有必要校准检测器，因此根据本发明的方法可以容许所使用的检测器的漂移。
不必物理地产生时间相关曲线，例如通过查看或打印时间相关曲线。无需记录或查看的直接调节可能就足够了。优选地，确定时间相关曲线的步骤在单个节点上执行，这使得可以限制检测器的使用并且避免必须考虑检测器的同步，在例如系统色谱柱之一的状态变化的情况下，同步也可以随时间而变化。
代表待分离混合物中所包含的一种或多种物质的浓度的变量优选是可以快速和直接地、反向地获得的变量，例如对经常需要事先校准的浓度。
因此，作为特定变量的示例，我们可以引用：
-旋光度，其例如通过旋光检测器返回的信号获得，在待分离混合物的物质具有旋光性，例如是对映体的情况下是有用的；
-光谱辐射的吸收或发射，其例如通过光谱检测器(例如紫外/可见或红外辐射)返回的信号获得，当待分离混合物的物质是具有可检测化学基团的天然或合成分子，特别是生物分子，例如蛋白质或肽时，是有用的；
-折射率、密度、电导率或pH，其例如由检测这些物理量的检测器返回的信号获得，并且例如，在待分离混合物含有糖、离子物质、酸或碱的情况下是有用的；
-上述几个特定变量的组合，
-从其他检测器获得的一个或多个变量。
上面通过示例给出的代表浓度的变量是可以容易地获得时间相关曲线的变量。这些变量的时间相关曲线可以实时获得，这使得该方法高效。时间相关曲线以信号的形式体现了在观察节点处的浓度变化，该信号可以通过检测器的监视容易地获得。
根据本发明的分离方法还包括在所述时间相关曲线上检测在本说明书中称为“低浓度特征点”的特征点的步骤。该步骤使得可以从代表浓度的变量的确定来定义分离方法的显露点。根据某些实施方案，所述特征点不是所述变量的精确值，而是指示观察节点处的循环现象。所述特征点指示在观察节点处循环的物质的相对行为。
观察节点位于系统色谱柱的出口。在周期中，管线(用于收集提余液，注入待分离混合物，收集提取物以及注入流动相)和区域从一个色谱柱移至另一个色谱柱，因此，这些管线和区域在特定时间紧邻观察节点(或在观察节点附近)，即在作为观察节点的相同连续色谱柱之间。在时间相关曲线上，可以定义在观察节点附近与管线(收集提余液，注入待分离混合物，收集提取物以及注入流动相)的通过相对应的时间和持续时间。这样就可以在时间相关曲线上定位用于收集提余液、注入待分离混合物、收集提取物以及注入流动相的位置(也称为平均位置)的间隔或中点，以及这些间隔和中点确定的区域。
根据本发明，低浓度的特征点位于提取物收集步骤的起点与随后的提余液收集步骤的终点之间。
优选地，在时间相关曲线上，提取物收集步骤的起点和随后的提余液收集步骤的终点两侧存在流动相注入步骤。在如上所述的四区域方法的情况下，低浓度的特征点位于区域1或区域4中，或者位于这两个区域之间的界面处(即，在对应于特征点的瞬间，观察节点位于系统的区域1中或区域4中，或者位于这两个区域之间的界面处，即平均洗脱液注入位置)。
在实施方案中，在所述时间相关曲线上检测特征点发生在提取物收集步骤的终点与随后的提余液收集步骤的起点之间。
在实施方案中，在时间相关曲线的部分中进行特征点的检测，在该部分，物质的密度和/或总浓度分别小于或等于待分离混合物的密度或最大总浓度的25％。低浓度特征点的检测对应于时间相关曲线上由吸附前沿和解吸前沿形成的组的整***置的检测，而在文献WO2007/101944中，这两个前沿的位置分别检测并用于控制吸附和解吸前沿的位置。
“吸附前沿”是指在色谱柱出口观察到的浓度增加，特别是当浓度从低值增加到接近在一个周期中检测到的最大浓度的值时。该浓度可以是待分离混合物的一种物质的浓度，或者是存在的所有物质的浓度。
“解吸前沿”是指在色谱柱出口处观察到的浓度降低，特别是当浓度从接近在一个周期中检测到的最大浓度的值降低到低值时。该浓度可以是待分离混合物的一种物质的浓度，或者是存在的所有物质的浓度。
低浓度的特征点可以是，例如：
-时间相关曲线的最小值，即在提取物的收集与提余液的收集之间检测到的最小信号点，或局部最小值；该点可以通过来自密度仪、来自紫外线检测器的最小信号来测量，也可以通过来自旋光仪的信号的绝对值的最小值来测量；
-时间相关曲线中具有确定值(例如零值)的点，特别是当代表浓度的变量是旋光度，并且待分离物质具有相反符号的旋光度时；
-计算为与时间相关曲线上的预定值相对应的两个点之间的中间点的点；所述预定值可以例如对应于来自密度仪或UV检测器的信号的阈值，也可以对应于来自旋光仪的信号的绝对值的阈值；所述特征点例如可以是时间相关曲线中与预定值相对应的两个点的重心，尤其等重心(iso-barycenter)(时间的或体积的)；
-计算为与时间相关曲线上相对定义的值相对应的两个点之间的中间点的点；这些值尤其可以对应于达到时间相关曲线的局部最大值或最小值的值的各个分数；因此，特征点可以是对应于这些定义值的两个点之间，特别是分别为吸附前沿的特征点和解吸前沿的特征点的两个点之间的重心，尤其是等重心(时间的或体积的)；该方法的优点是可以根据两个不同的检测器来计算这两个特征点。
图1和2显示了从时间相关曲线中检测到的低浓度特征点的示例。图1对应于在提取物(表示为E)的收集和提余液(表示为R)的收集之间通过密度仪获得的密度时间相关曲线(黑线)。给出了低浓度特征点的三个示例。低浓度特征点的第一个示例(表示为1)是与最小密度相对应的点。第二示例是表示为2的点，其横坐标是时间相关曲线的对应于预定密度值1.05的两个点的横坐标的等重心。第三个示例是点3，其横坐标是通过相对20％的阈值获得的两个点的横坐标的等重心：第一个点由横坐标定义，使得密度为在观察到的最小密度和在提取物收集的起点测量的密度之间的20％；第二点由横坐标逆向定义，以使密度为在观察到的最小密度与提余液收集的终点测得的密度之间的20％。流动相注入的平均位置表示为PM。
图2对应于在提取物(表示为E)的收集和提余液(表示为R)的收集之间通过旋光仪获得的旋光时间相关曲线。给出了低浓度特征点的三个示例。低浓度特征点的第一个示例是测得的旋光度为零的标记为1的点。第二个示例是标记为2的点，其横坐标是与旋光度的绝对值的阈值相对应的两个点的横坐标的等重心。第三个示例是标记为3的点，其横坐标是对应于等于最大旋光度的50％的旋光度的点和对应于等于最小旋光度的50％的旋光度的点的横坐标的等重心。流动相的注入位置表示为PM。
特征点的位置是使得可以稳定系统纯度和收率的数据。
如上所述，根据本发明的方法的优点在于，可以在小于一个周期的持续时间内确定时间相关曲线。实际上，只需检测特征点，然后进行下一步的调节即可。然而，优选地，确定步骤在完整周期上执行。此外，确定时间相关曲线和检测特征点的步骤可以以对应于周期的整数(全部n个周期，n大于或等于1)的频率来执行。确定时间相关曲线和检测特征点的步骤越频繁，对系统操作的调节就越精确。
根据本发明的方法还包括将特征点的位置与目标位置进行比较的步骤。
特征点的检测可以类似于时间(或经过的体积，后者对应于流量随时间的积分)的确定，其中特征点在时间相关曲线持续时间内(例如一个周期)出现在观察节点处；然后，当特征点在观察节点处出现以允许在所需条件下进行操作时，目标位置对应于时间(或体积)。
在对应于代表要待分离混合物中包含的一种或多种物质的浓度的变量随时间变化的时间相关曲线上，比较特征点位置与目标位置的步骤包括比较特征点的横坐标与预定目标的横坐标。
这有助于确定系统中是否发生了干扰。在适当调节的系统中，优选无干扰且处于稳定状态，特征点的位置与目标位置一致。如果系统没有受到干扰，则特征点在每个周期的大约同一时间出现在观察节点上。然后，特征点的位置与目标位置之间的差可以对应于通过观察节点的时间差。
低浓度特征点的目标位置可以在周期中绝对定义，或者相对于流动相的注入步骤，和/或相对于馏分、提余液和/或提取物的收集步骤定义。
根据本发明的方法还包括以下步骤：如果在特征点的位置和目标位置之间存在差异，则调节承载特征点的体积，改变特征点的位置以使特征点的位置更接近目标位置。换句话说，特征点的位置与目标位置之间的差对应于系统功能的偏差或干扰，这可以通过仅调节承载特征点的体积来补偿。
在本发明中，“承载浓度前沿的体积”是指承载特征点位于其上或特征点位于其附近的前沿的体积。
在如上所述的四区域方法中，其可以是区域1的承载量(或解吸面积)或区域4的承载量(或吸附面积)。“区域的承载量”是指在两个管线切换操作之间在所讨论的区域中循环的体积。该体积是在该区域中循环的流体流量和该时期的乘积，当该时期中流量不稳定时，它也可以是两次管线切换操作之间的流量随时间的积分。当改变区域1的流动相体积时，存在于区域1中的解吸前沿的位置也被改变。同样地，区域4的体积承载吸附前沿，并且改变区域4的体积将改变吸附前沿的位置。
在本发明中，“承载特征点的体积”是指其变化会改变特征点的位置的体积。从图1和图2中可以看出，改变区域1的体积将改变提取物收集起点与平均洗脱液注入点之间的前沿的位置，并会改变解吸前沿的特征点的位置。相反，改变区域4的体积将改变平均洗脱液注入点与提余液收集终点之间的前沿的位置，从而改变吸附前沿的特征点的位置。
改变承载特征点的体积可以通过如下进行：改变一次或多次注入和/或收集的流速；和/或改变管线切换操作之间的持续时间；和/或改变一次或多次注入和/或收集的持续时间。优选地，通过改变一次或多次注入和/或收集的流速或在管线切换操作之间的持续时间来改变承载特征点的体积。
为了改变承载特征点的体积，例如可以改变区域1的流量或区域4的流量。例如，如果特征点的位置位于目标位置的下游(即，如果特征点的横坐标位于作为目标位置的预定横坐标的下游)，则流量将增加，或者如果特征点的横坐标位于目标位置的上游，则流量将减小。
优选地，在不改变流动相注入体积的情况下调整承载特征点的体积。则在使用该方法期间，每个周期注入的流动相的体积可以保持恒定。当设置了流动相体积限制时，这特别有用。因此，当每个周期注入的流动相的体积达到固定的极限(无论是最小极限还是最大极限)时，该体积在此极限下保持恒定。改变承载吸附区域(区域4)的体积，例如通过改变提余液收集物的流速，则相当于改变了承载解吸区域(区域1)的体积，反之亦然。
因此，对承载特征点的体积的调节使得可以改变在承载体积被改变的区域中物质的通过。特征点可以在目标点(即，横坐标为目标位置的点)之前。通过减少承载特征点的体积，我们可以减缓物质的流通，从而延迟特征点，使其更接近目标点。相反，如果特征点相对于目标点被延迟，则增加承载该特征点的体积以加速物质的流通，并加速特征点，从而使其靠近目标点。如果特征点稳定在目标点，则意味着无需进行调节。还可以考虑提供特征点位置与目标位置之间的差异的阈值，其中如果观察到的差异超过阈值，则进行调节。
如上所述的调节例如可以是作用在承载特征点的体积上的PID控制(比例、积分、微分控制)。
在四区域方法中，必须区分术语“区域的承载量”(也称为“区域的体积”或“区域的流动相的体积”)，“流动相的体积”和“注入的流动相体积”。
因此(如上所述)，区域1的体积对应于流动相的体积，该流动相在给定时间内通过区域1特有的色谱柱，并位于洗脱液注入管线和提取物收集管线之间。同样，我们可以为系统的每个区域(对于区域2，对于区域3，对于区域4)定义一个体积。如上所述，区域体积的改变优选地通过流量的改变或者通过对构成所述区域的管线的两次切换之间的持续时间的改变来进行。这可以改变注入的流动相的体积或收集物的流动相的体积。例如，在保持区域3和区域1的体积不变的同时，区域4的体积的变化等于萃余液的收集物的体积和注入的流动相的体积的变化。
术语“流动相体积”是流经色谱柱的流动相的通用术语。
另一方面，“注入的流动相的体积”或“每个周期注入的流动相的体积”对应于在区域4和区域1之间注入的新鲜洗脱液的体积(在四区域方法中)。本发明旨在控制该体积。
文献WO2007/101944中描述的调节方法使得可以分别调节区域1和4的流动相体积，其是承载区域1和4的特征点(解吸和吸附的特征点)的体积。这不允许精确控制每个周期注入的流动相的体积。
在根据本发明的方法中，当遇到每个周期注入的流动相的体积约束时(即，达到最大和/或最小极限时)，通过对区域1的体积和区域4的体积(当该方法是四区域方法时)进行相同的校正来进行调节。因此，该调节涉及一个称为“承载低浓度点的体积”的量，在具有四个区域的方法的情况下，所述“承载低浓度点的体积”可以是区域1的体积或区域4的体积或两者的组合。在这种情况下，对区域1和区域4的体积进行的改变会改变提余液和/或提取物的收集物的体积，但不会改变注入的流动相的体积。
与现有技术中描述的方法不同，根据本发明的方法的优点在于，它既可以对系统中的干扰迅速做出反应，又可以控制在每个操作周期内注入的流动相的量。通常，基于对收集的馏分的组成进行分析的方法无法对干扰产生快速反应，这些干扰的影响可能需要几个周期才能稳定下来。另外，在某些情况下，分析和获得纯度值所花费的时间很长。分析组成所花费的时间更长，因为优选在整个周期中对色谱系统的馏分进行采样，然后对这些样品进行分析。因此，只能以至少一个延迟周期和大于一个或两个周期的周期性来获得纯度结果，这使得调节和确定要应用的调整更加困难。因此，在改变操作参数之后或在可能添加分析延迟的干扰之后，累积系统的反应性存在延迟。
本方法使得一旦观察到时间相关曲线发生变化就可以做出反应。这样，为恢复系统而实施的调节很快。另外，根据本发明的方法还使得可以通过控制在提取物收集步骤的起点与随后的提余液收集步骤的终点之间的特征点来控制色谱方法所用的流动相的体积，这与通过控制位于吸附前沿和解吸前沿的两个特征点而调节的方法不同。
图3示出了在使用根据本发明的方法期间获得的时间相关曲线，其中已经设置了每个周期所注入的洗脱液的最大体积的限制。低浓度特征点的位置与其目标位置一致。在此示例中，低浓度特征点的位置对应于洗脱液注入的位置。注意，特征性吸附和解吸点(如文件WO2007/101944中所述)尚未达到其目标位置，并且在吸附和解吸点与它们各自的目标位置之间存在间隙。
图4示出了在使用根据本发明的方法的过程中获得的时间相关曲线，其中已经设置了每个周期注入的洗脱液的最小体积的限制。低浓度特征点的位置与其目标位置一致。在该示例中，低浓度特征点的位置同样对应于洗脱液注入的位置。要注意的是，在这种情况下，吸附和解吸的特征点同样没有达到它们的目标位置，并且在吸附和解吸点与它们各自的目标位置之间仍然存在间隙。
基于低浓度的特征点而不是吸附和解吸的特征点的这种调节允许遵守所施加的洗脱液体积的限制。
根据某些实施方案，该方法进一步包括测量至少一个收集的馏分的纯度的步骤。特别地，该方法包括测量提取物和/或提余液纯度的步骤。
然后分别将馏分的纯度与目标纯度，即与期望达到的预定纯度进行比较。
作为测量纯度的替代方法或对这些测量的补充，还可以测量所收集馏分中目标物质的量，并确定其在与所收集馏分中存在的目标物质相关的收率。因此，根据本发明的方法可以包括测量提取物和/或提余液的目标物质中的收率的步骤，以及分别比较所测量的收率与目标收率的步骤。在本发明中，可以使用纯度和/或收率约束。实际上，它是相同类型的约束，但施加不同。
“收集的馏分的收率”在本发明中是指包含在所收集的馏分中的目标物质的收率。
在某些实施方案中，根据本发明的方法还包括改变待分离混合物的体积的步骤，所述待分离混合物根据测量的纯度和目标纯度之间的差异在每个周期内注入。
例如，在二元混合物的情况下，如果提取物和提余液的两个纯度均大于预定纯度，则意味着纯度超出规格；可以增加混合物的量以将纯度“降低”至规格。如果提取物和提余液的纯度均低于预定纯度，则表示纯度低于规格；可以减少混合物的量以改善分离并提高纯度至规格。当需要单一纯度时，可以调整此操作模式。如上所述，还可以测量目标物质的量及其与在其他收集物中损失的目标物质的存在有关的收率。该收率与其他馏分的纯度直接相关。
优选地，至少部分地执行以下步骤：测量至少一个所收集馏分的纯度(和/或收率)，将测得的纯度(和/或测得的收率)与目标纯度(和/或目标收率)进行比较，以及改变每个周期注入的待分离混合物的体积，其与以下步骤并行，在所述时间相关曲线上检测低浓度特征点，将其位置与目标位置比较，并调整承载该特征点的体积。
可以通过改变在一个阶段内注入的混合物的体积来实现对待分离混合物量的改变。可以通过以下几种方式来改变待分离混合物的体积：
-通过增加或减少混合物的注入速率；和/或
-通过增加或减少阶段持续时间。
控制要注入的待分离混合物(或负载)的量需要测量与纯度和/或收率有关的至少一个数据项目。以下非限制性示例举例说明了一种用于限定待注入负载的量的方法，并且如果对提取物和提余液将两个纯度确定为目标，则可以使用该方法。让以下变量为：
-P*ext：提取物中的目标纯度；
-p*raff：提余液中的目标纯度；
-Pext：提取物中测得的纯度；
-Praff：提余液中测得的纯度；
-εext＝Pext-P*ext，即提取物的测得纯度和目标纯度之间的差值；
-εraff＝Praff-P*raff，即提余液的测得纯度和目标纯度之间的差值。
纯度可以通过确定有关馏分中一种或多种目标物质的质量或摩尔浓度来计算。
根据第一种方法，可以对从一个或多个纯度与它们的目标值的偏差(εext和/或εraff)获得的量执行PID控制。另一种可能性是使用取决于所获得纯度和目标纯度的函数的值，以便计算新的待注入的量。
所注入的待分离混合物的量的改变引起干扰，该干扰可能导致低浓度特征点相对于目标位置移动。然后如上所述通过调节承载该特征点的体积来改变低浓度特征点的位置。
在本发明中，通过控制选自区域1的体积、区域4的体积或两者的组合(例如每个区域的特征点的平均值)中的单个承载体积来进行低浓度特征点的位置的调节。在区域1和区域4之间承载的体积的分布保持精确控制，这使得可以遵守流动相体积的高和/或低阈值。如果高阈值和低阈值相等，则根据本发明将每个周期注入的流动相的体积调节为精确的设定值。该设定点自然位于最大和最小流动相体积限制之间。因此，根据本发明的控制方法，使得可以施加不超过高和/或低阈值，并且还可以根据除了遵守在区域1和区域4的前沿的位置以外的其他标准来精确地控制流动相的体积。
在本发明的更一般的描述中，可以通过使用为高阈值和低阈值的中间控制变量来将流动相的体积控制在最大极限和最小极限之间，这些极限是不可被超越的极限。两种极端的使用方式可能是：
·高阈值和低阈值被固定为接近最大和最小极限，而当流动相体积的超出值超出规定范围时，将根据本发明控制流动相体积；
·根据纯度和/或收率测量值改变高和低阈值，而阈值本身的值始终保持在流动相体积的最大和最小限制之间。
因此，在某些实施方案中，根据本发明的方法包括以下步骤：根据测量纯度与目标纯度之间的差异(和/或测得收率与目标收率之间的差异)来改变每个周期注入的流动相体积的设定值。
例如，在二元混合物的情况下，如果提取物和提余液的两个纯度均大于预定纯度，则意味着纯度超出规格；由此可以减少流动相的体积。如果提取物和提余液的纯度均低于预定纯度，则表示纯度低于规格；可以增加流动相的体积。当需要单一纯度时，可以调整此操作模式。我们还可以测量目标产品的量及其与在其他收集物中损失的目标产品的存在有关的收率。该收率与其他馏分的纯度直接相关。
优选地，至少部分地执行以下步骤：测量至少一个所收集馏分的纯度(和/或收率)，将测得的纯度(和/或测得的收率)与目标纯度(和/或与目标收率)进行比较，和改变每个周期注入的流动相体积，其与以下步骤并行，在所述时间相关曲线上检测低浓度特征点，将其位置与目标位置比较，并调整承载该特征点的体积。
在某些实施方案中，在改变每个周期注入的流动相的体积的步骤中，每个周期待分离和注入的混合物的体积保持恒定。
根据其他实施方案，根据测得的纯度和目标纯度之间的差(和/或测得的收率和目标收率之间的差)共同改变每个周期注入的混合物的体积和每个周期注入的流动相的体积。
考虑到在本发明的方法中规定的注入的流动相的体积的最大极限和/或最小极限，可以对注入的流动相的体积进行变化。
在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：根据所测量的纯度和目标纯度之间的差异(和/或所测量的收率和目标收率之间的差异)来定义低浓度特征点的目标位置。该步骤使得可以改进已经描述的方法，从而优化相对于期望纯度的目标位置。所测量的纯度可以是提取物和/或提余液的纯度。
优选地，至少执行部分以下步骤：测量至少一个所收集馏分的纯度(和/或收率)，将测得的纯度(和/或测得的收率)与目标纯度(和/或与目标收率)进行比较，和定义目标位置；其与以下步骤并行，在所述时间相关曲线上检测低浓度特征点，将其位置与目标位置比较，并调整承载该特征点的体积。
如果提余液和提取液收集物这两个馏分的纯度(在二元混合的情况下)很重要，则低浓度特征点的目标位置应使其与提余液和提取液收集物足够远(随时间变化)。例如，低浓度的特征点可以位于洗脱液注入步骤中。
但是，单个馏分的纯度可能很重要。
在这种情况下，可以将目标位置与提余液或提取物收集物中的一个或另一个进行比较。例如，低浓度的特征点可以位于区域1或区域4中。
如上所述，还可以测量目标产物的量及其与在其他收集物中损失的目标产物的存在有关的收率。该收率与其他馏分的纯度直接相关。
应该注意的是，馏分纯度的测量可能会有一定的延迟。然而，这不会对方法造成不利影响，因为测量至少一个所收集馏分的纯度，将测得的纯度与目标纯度进行比较以及确定目标位置的步骤有利地与以下步骤并行地执行：在所述时间相关曲线上检测低浓度特征点，将其位置与目标位置进行比较，并调整承载该特征点的体积。然后，可以通过简单地考虑最后可用的测量，对每个新的测量甚至所有周期实施新的目标位置的定义。
在纯度分析阶段期间，该方法通过将低浓度特征点的位置与有效目标位置进行比较，连续调整承载低浓度特征点的体积。
可以使用几种方法来定义特征点的目标位置。
根据第一方法，对εext或εraff参数施加PID类型的调节。因此，如果εext为负值，则目标位置将远离提取物管线(目标位置接近提余液管线)。类似地，如果εext为正值，则目标位置将更靠近提取物管线(使目标位置远离提余液管线)。如果施加到εraff，则调节是类似的。如果εraff为负值，则目标位置将远离提余液管线(目标位置更靠近提取物管线)。类似地，如果εraff为正值，则目标位置将更靠近提余液管线(使目标位置远离提取物管线)。
根据第二种方法，对εext和εraff偏差的组合施加PID控制，并且更一般地，对所测量纯度和/或收率与目标纯度和/或收率之间的偏差的组合施加PID控制。
根据第三种方法，取决于所得纯度和目标纯度的函数可以直接用于计算特征点的新位置。
在定义目标位置的步骤中，目标位置也可以相对于时间相关曲线上流动相注入的位置进行定义。这使得可以适应注入点位置的变化。
低浓度特征点的目标位置的优化可以自动进行。
在某些有利的实施方案中，该方法还包括：
-在系统节点中确定变量的时间相关曲线，该变量代表待分离混合物中所含一种或多种物质的浓度；
-在所述时间相关曲线上检测另一特征点，该特征点在本说明书中称为高浓度特征点，其位于提余液收集步骤的起点与随后的提取物收集步骤的终点之间；
-比较高浓度特征点的位置与目标位置；
-调整承载高浓度特征点的体积，改变其位置以使其更接近其目标位置。
代表浓度的变量、观测节点和时间相关曲线可以各自独立地与用于检测低浓度特征点的变量、观测节点和时间相关曲线的那些相同；或者可以是不同的变量、观察节点和时间相关曲线。
所述高浓度特征点位于提余液和提取液管线之间，换句话说，位于区域2或区域3中，或位于区域2和3的界面处(即，在待分离混合物的平均注入位置处)，那里的浓度很高。
文献WO2007/101944详细描述了该高浓度特征点的检测和使用，这尤其呈现在文献WO2007/101944的图6至11和18至21中。
上面关于低浓度特征点所描述的内容类似地适用于高浓度特征点。
被调节以控制高浓度特征点的位置的承载体积可以是例如区域2的体积，而区域2的体积的任何变化都同等地传递至区域3的体积。
流动相体积限制
在根据本发明第一方面的方法中，在至少部分方法中，优选在整个方法中，每个周期注入的流动相的体积都保持大于或等于最小极限和/或小于或等于最大极限。
在施加最大限制的情况下，当每个周期注入的流动相的体积达到该最大限制时，它将不再增加。有利地，当流动相体积达到最大极限时，它保持恒定在该最大极限。
在施加最小限制的情况下，当每个周期注入的流动相的体积达到该最小限制时，它将不再减小。有利地，当流动相体积达到最小极限时，它保持恒定在该最小极限。
在某些实施方案中，流动相体积既保持大于或等于最小极限，又小于或等于最大极限。在一些实施方案中，上限和下限是相同的。在这种情况下，将注入的流动相的体积调节为等于最小(或最大)极限的恒定体积。
在该方法期间根据本发明的调节的触发
在某些情况下，可以在方法期间当达到条件时参考低浓度的特征点对方法进行调节，而不必从方法开始就进行。
例如，当注入的流动相的体积达到或超过某个阈值时，可以触发此调节。
因此，本发明的另一个目的是一种在包括一个或多个色谱柱的组件的系统中分离混合物的方法，该方法以循环方式依次包括：
-收集提余液的步骤，注入待分离混合物的步骤，收集提取物的步骤以及注入流动相的步骤；
其中每个周期注入的流动相的体积保持大于或等于最小极限和/或小于或等于最大极限；
该方法是这样的：
-只要每个周期注入的流动相的体积大于或等于阈值，或者小于或等于阈值，则该方法包括：
·在系统节点中确定变量的时间相关曲线，该变量代表待分离混合物中所含一种或多种物质的浓度；
·在所述时间相关曲线上检测在提取物收集步骤的起点与后续流动相注入步骤的终点之间的第一特征点(也称为吸附特征点)；
·在所述时间相关曲线上检测在流动相注入步骤的起点与随后的提余液收集步骤的终点之间的第二特征点(也称为解吸特征点)；
·将每个特征点的位置与各自的目标位置进行比较；
·调整承载第一特征点的体积和承载第二特征点的体积，改变第一特征点和第二特征点的位置，以使它们靠近各自的目标位置；
-当每个周期注入的流动相的体积达到阈值时，该方法如上所述：即放弃基于第一特征点和第二特征点的调节，而转向上述基于低浓度特征点的调节。
例如，阈值可以是注入的流动相的最小极限和/或最大极限。或者，它可以是与最小极限和/或最大极限具有预定偏差的阈值。
因此，只要每个周期注入的流动相的体积尚未达到阈值，就可以通过将吸附和解吸两个特征点的位置与各自的目标位置进行比较来调节色谱方法。这允许优化调节的精度。当由于调节或任何其他原因而改变的流动相体积达到阈值(例如，最小极限或最大极限)时，则使用低浓度特征点对方法进行不太精确的调节，如上所述，这可以避免与注入的流动相的过度增加或过度减少有关的缺点。
借助于吸附和解吸的两个特征点的调节已在上面提及的文献WO2007/101944中详细描述。
另外，关于低浓度特征点的上述内容类似地适用于吸附和解吸的每个特征点。
计算机程序
本发明的另一个目的包括一种计算机程序，其包括程序代码指令，当在计算机上执行所述程序时，所述程序代码指令用于执行根据本发明的方法的步骤。
本发明还涉及一种记录了上述计算机程序的计算机可读存储介质。
本发明还涉及一种系统，该系统包括耦合到存储器的处理器，所述存储器记录了如上所述的计算机程序。所述系统还可以包括如上所述的色谱分离系统，或者可以仅仅是连接至分离系统并且与之分离的控制系统。
通过在线检测器测量纯度和/或收率
根据第二方面，本发明涉及一种在包括多个色谱柱的系统中分离混合物的方法，该方法在系统的给定部分中以循环的方式依次包括：
-收集提余液的步骤，注入待分离混合物的步骤，收集提取物的步骤和注入流动相的步骤；
其中所述方法进一步包括对选自提取物和提余液的至少一种收集馏分的纯度和/或收率的测量，所述纯度和/或收率的测量包括以下步骤：
-在系统节点中，借助于至少一个快速在线检测器，确定代表待分离混合物中包含的至少两种物质的浓度的至少两个相应变量的时间相关曲线；
-由时间相关曲线确定待分离混合物的至少两种物质在所收集馏分中的浓度；
-由浓度确定所收集馏分的纯度和/或收率。
“确定代表待分离混合物中包含的至少两种物质的浓度的至少两个相应变量的时间相关曲线”是指确定至少两个变量的时间相关曲线，这些变量各自代表待分离混合物中包含的至少两种物质(至少两种物质的组)的浓度。
纯度对应于所收集馏分中一种或多种物质的浓度与所收集馏分中确定的所有浓度之和的比率。
收率对应于两个收集馏分之一中的一种物质的量与两个累积的收集馏分中该物质的总量的比率。
在本发明的意义上，“在线检测器”是指位于色谱柱出口处，即在两个连续的色谱柱之间的连接管线上的检测器。术语“在线检测器”还指的是旁路检测器，其取样位于色谱柱的出口处，即在两个连续的色谱柱之间的连接管线上。因此，在线检测器不位于色谱系统的出口管线上(即，在收集提取物或提余液的管线上)。
根据本发明，可以使用单个检测器，或可选地可以使用几个检测器。在使用至少两个检测器的情况下，它们可以位于同一个色谱柱的出口，也可以位于不同色谱柱的出口。
在实施循环色谱方法的系统中，可以使用两种类型的检测器：快速检测器和慢速检测器。在本发明的第二方面，所使用的至少一个在线检测器是快速检测器。
在本发明的意义上，“快速检测器”是指其响应时间小于周期持续时间的二十分之一的检测器。“慢速检测器”是指其响应时间大于周期持续时间的二十分之一的检测器。
快速检测器根据在检测器内部移动的化合物的浓度分布发出信号。因此，它使得可以检测时间相关曲线上的特征点，例如，以实施根据本发明的第一方面的分离方法。
作为快速检测器，可以提及的是在一个或多个波长测量的UV/可见光吸收检测器，色度仪，密度仪，电导仪，折光仪，白利糖度仪，旋光仪，核磁共振设备和NIR(近红外)、IR(红外)、傅立叶变换红外光谱(FTIR)和拉曼光谱仪。温度检测器可用于校正上述检测器给出的信号。
在某些实施方案中，所述至少一个快速在线检测器选自上述快速检测器，只要代表待分离混合物中包含的至少两种物质的浓度的至少两个变量被检测并且不同即可。
所述至少一个检测器可以测量一个或多个变量，所述变量表示待分离混合物中所包含的至少两种物质的浓度。因此，例如，在对待分离物质的吸收或发射波长进行校准之后，光谱型检测器使得可以使用单个装置测量所述物质的浓度。
使用单个快速检测器有时不允许精确待测量物质的浓度。
如实施例6所示，在纯化包含葡萄糖、果糖和少量葡聚糖的混合物的过程中，使用旋光仪和密度仪的组合使得可以获得代表混合物的物质的浓度的变量：密度仪给出所有浓度之和的信息，而旋光仪测量偏振光的旋转，已知葡萄糖和葡聚糖起正作用而果糖起负作用。在这种情况下，代表性变量是密度和极性。由这两个检测器获得的这些变量的值的组合使得可以评估混合物的物质的浓度(在检测器进行校准之后)。
在使用光谱仪(IR，NIR，FTIR，拉曼...)的情况下，光谱仪的每次测量都会返回由一组在不同波长下的吸收或发射值组成的信息向量。在这些不同波长下的吸收或发射各自可能是代表所述物质的浓度的变量。实际上，这些吸收或发射值的组合使得可以估计一种或多种物质的浓度值。这种组合的确定是通过标准化学计量工具进行的。在一些实施方案中，使用至少两个快速在线检测器用于确定时间相关曲线。优选地，它们选自上述快速检测器。
在一些实施方案中，所述至少两个在线检测器是旋光仪和密度仪。
根据其他实施方案，所述至少两个在线检测器是密度仪和电导仪。
在某些实施方案中，待分离混合物的至少两种物质是单糖。在这些实施方案中，提取物和提余液富含不同的单糖。具体地，单糖选自上述的单糖。
在某些实施方案中，待分离混合物的至少两种物质是葡萄糖和果糖。在这些实施方案中，待分离混合物可以仅包含葡萄糖和果糖，任选地在溶剂(例如水)中稀释。或者，待分离混合物可以包含一种或多种其他化合物，例如葡聚糖。
有利地，当待分离混合物的至少两种物质是葡萄糖和果糖时，使用至少两种在线快速检测器，优选旋光仪和密度仪。
根据其他实施方案，待分离混合物的至少两种物质是例如盐形式的离子化物质和非离子化物质。在这些实施方案中，提取物和提余液富含不同的物质，即提取物富含离子化物质，提余液富含非离子化物质，或反之(提取物富含非离子化物质，提余液富含离子化物质)。
作为离子化物质，可以提及氨基酸、盐或有机酸，其在色谱分离的pH和操作温度下为离子化形式。
作为在色谱分离的pH值和操作温度下的非离子化物质，我们可以提及醇和糖，例如上述的单糖和多糖。
有利地，当待分离混合物的至少两种物质是离子化物质和非离子化物质时，使用至少两个快速在线检测器，优选密度仪和电导仪。
在某些实施方案中，根据本发明的方法包括，在确定代表待分离混合物中所包含的至少两种物质的浓度的至少两个相应变量的时间相关曲线的步骤之后，在时间相关曲线的测量间隔内确定每个变量的平均值的步骤。
根据其他实施方案，根据本发明的方法包括，在确定代表待分离混合物中所含至少两种物质的浓度的至少两种相应变量的时间相关曲线的步骤之后，在时间相关曲线的测量间隔内确定每个变量的积分值。
在上文中，可以通过收集所考虑的馏分来完全定义时间相关曲线的每个测量间隔。换句话说，在一个周期内，所述时间相关曲线测量间隔对应于所考虑的馏分的收集管线在与所考虑的检测器相同的连续色谱柱之间的时间(或体积)。
所述测量间隔还可以仅对应于所考虑馏分的收集的一部分。
所述测量间隔还可以对应于所考虑的馏分的收集的部分或全部，并对应于所考虑的馏分的收集之后紧跟着的时间相关曲线的一部分。
所述测量间隔还可以对应于所考虑的馏分的收集的部分或全部，以及对应于刚好在所考虑的馏分的收集之前的时间相关曲线的一部分。
如果色谱系统中存在不对称性，则后三个实施方案特别有用。
纯度和/或收率的这种测量可以与需要纯度测量以执行作用的所有现有技术控制方法一起使用。
在某些实施方案中，根据本发明的方法还包括：
·在系统节点中确定变量的时间相关曲线，该变量代表了待分离混合物中包含的一种或多种物质的浓度；
·在所述时间相关曲线上检测高浓度特征点，该特征点位于提余液收集步骤的起点与随后的提取物收集步骤的终点之间；
·比较高浓度特征点的位置与目标位置；
·调整承载高浓度特征点的体积，改变高浓度特征点的位置以使其接近目标位置。
上面关于高浓度的特征点所描述的内容因此可以应用于本发明的第二方面。
在某些实施方案中，根据本发明的方法还包括：
·在所述时间相关曲线上检测在提取物收集步骤的起点与后续流动相注入步骤的终点之间的第一特征点(也称为吸附特征点)；
·在所述时间相关曲线上检测在流动相注入步骤的起点与随后的提余液收集步骤的终点之间的第二特征点(也称为解吸特征点)；
·将每个特征点的位置与各自的目标位置进行比较；
·调整承载第一特征点的体积和承载第二特征点的体积，改变第一特征点和第二特征点的位置以使它们更接近各自的目标位置。
上面关于吸附和解吸的特征点所描述的内容因此可以应用于本发明的第二方面。
在某些实施方案中，根据本发明的方法还包括：
·在系统节点中确定变量的时间相关曲线，该变量代表了待分离混合物中包含的一种或多种物质的浓度；
·在所述时间相关曲线上检测在提取物收集步骤的起点与随后的提余液收集步骤的终点之间的低浓度特征点；
·比较低浓度特征点的位置与目标位置；
·调节承载低浓度特征点的体积，改变低浓度特征点的位置以使低浓度特征点的位置更接近目标位置；
·优选地，每个周期注入的流动相的体积保持大于或等于最小极限和/或小于或等于最大极限。
上面关于低浓度特征点所描述的内容因此可以应用于本发明的第二方面。
在上述实施方案中，检测高浓度特征点、吸附和解吸的特征点、低浓度特征点的时间相关曲线，以及在至少一个所收集馏分中确定待分离混合物的至少两种物质的浓度的时间相关曲线，可以独立地是相同的时间相关曲线或不同的时间相关曲线。对于代表待分离混合物中所含物质的浓度的变量而言，情况也是如此。
在一些实施方案中，该方法还包括将测得的纯度和/或测得的收率与目标纯度和/或目标收率进行比较的步骤。如果在提取物中和提余液中测量纯度和/或收率，则该方法可以包括将所测量的两个纯度和/或收率与它们各自的目标纯度和/或收率进行比较的步骤。
在某些实施方案中，根据本发明的方法还可包括以下步骤：根据所测得的纯度和目标纯度之间的差异(和/或测得的收率与目标收率之间的差异)，改变每个周期注入的待分离混合物的体积。
在某些实施方案中，根据本发明的方法包括以下步骤：根据所测量的纯度与目标纯度之间的差异(和/或测得的收率与目标收率之间的差异)，改变每个周期注入的流动相的体积。
在某些实施方案中，根据所测量的纯度与目标纯度之间的差异(和/或测得的收率与目标收率之间的差异)，共同改变每个周期注入的混合物的体积和每个周期注入的流动相的体积。
在某些实施方案中，该方法包括以下步骤：根据所测量的纯度与目标纯度之间的差异(和/或测得的收率与目标收率之间的差异)，定义特征点的目标位置。这可以是高浓度特征点的目标位置的定义和/或吸附特征点的目标位置和/或解吸特征点的目标位置和/或低浓度特征点的目标位置的定义。
如上所述的关于测量的纯度和/或收率与目标纯度和/或收率的比较，根据该比较来改变注入的混合物的体积以及流动负载体积，和根据该比较来定义特征点的目标位置，可以应用于本发明的第二方面。
在本发明的某些实施方案中，如果希望改变系统的生产量或控制系统的一个或多个色谱柱上的压力，也可以调节诸如色谱柱中流体的平均操作速度的大小。
本发明的另一个目的是一种包括程序代码指令的计算机程序，当所述程序在计算机上执行时，所述程序代码指令用于执行根据本发明的第二方面的方法的步骤。
本发明还涉及一种计算机可读存储介质，在其上记录了如上定义的计算机程序。
本发明还涉及一种系统，该系统包括耦合到存储器的处理器，在存储器上记录了如上定义的计算机程序。所述系统还可以包括如上所述的色谱分离系统，或者可以仅仅是连接至分离系统并且与之分离的控制系统。
在中间罐上测量纯度和/或收率
根据第三方面，本发明涉及一种用于在设备中分离混合物的方法，包括：
-第一系统，其包括多个色谱柱，用于收集提余液的出口管线和用于收集提取物的出口管线；
-至少一个第二系统，其位于第一系统下游；
和
-至少一个罐，其由第一系统的所述出口管线之一供应，并且向第二系统供应，优选以连续流；
该方法在第一系统的给定部分中以循环的方式连续地包括如下步骤：
-收集提余液的步骤，注入待分离混合物的步骤，收集提取物的步骤以及注入流动相的步骤；
其中所述方法进一步包括对选自提取物和提余液的至少一种收集馏分的纯度和/或收率的测量，所述纯度和/或收率的测量包括以下步骤：
-确定罐中收集的馏分中待分离混合物的至少两种物质的浓度；
-确定在罐中收集的馏分中的至少一种物质的纯度和/或收率。
基于在罐中收集的馏分中确定的待分离混合物的至少两种物质的浓度，确定在罐中收集的馏分的至少一种物质的纯度和/或收率。
纯度对应于在罐中收集的馏分中的一种或多种物质的浓度与在罐中收集的馏分中确定的所有浓度的总和之比。
收率对应于两个收集馏分之一中的一种物质的量与合并这两个收集馏分的该物质的总量之比。
所述至少一个第二系统优选在连续供应下并且以稳定的流量和组成运行。如果第一个系统短暂停机，则所述罐可确保第二系统获得连续供应。罐的存在可以例如，在色谱设备停机的情况下，允许第二系统运行一小时。在第一系统中从一个色谱柱到另一个色谱柱存在不对称的情况下，该罐还可以使流速均匀，并使收集到的馏分供应到第二系统之前平滑收集到的馏分的组成。优选地，该罐定期地由收集的馏分供应，并且不断地向第二系统排空。在系统的每个周期之间都不会清除或完全冲洗该罐。
在平衡色谱系统的情况下，罐中包含的馏分的平均组成非常接近整个循环中收集的馏分的平均组成。
当色谱系统发生改变或变化时，罐中包含的馏分的组成并不严格等于系统整个周期中直接收集的馏分的组成，这是因为由于罐更新的持续时间，与直接收集的馏分的组成相比，罐中包含的馏分的组成的变化会延迟。当罐的体积较大时，罐内物质的更新会更加延迟。但是，该测量仍然保持足够的代表性，特别是对于允许调节色谱系统而言。
在本说明书中，术语“出口管线”和“收集管线”具有相同的含义。
在某些实施方案中，借助于至少一个检测器，优选慢速检测器，对罐中收集的馏分中的待分离混合物的至少两种物质的浓度进行测定。
作为慢速检测器，在需要采集多个光谱以获得允许精确测量的信号，因此总的采集时间可能很长的情况下，我们可以提及近红外光谱仪、红外光谱仪、傅立叶变换红外光谱仪和拉曼光谱仪。在慢速检测器的背景下，也可以提及所有核磁共振技术。
根据其他实施方案，通过分析色谱系统，例如高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UPLC)、超高压液相色谱(UHPLC)、气相色谱(GC)，确定罐中收集的馏分中待分离混合物的至少两种物质的浓度。
第二系统尤其可以是色谱单元、酶转化单元、化学转化单元、蒸馏单元、膜浓缩单元或蒸发单元。在一些实施方案中，第二系统是蒸发单元。
该设备包括由出口管线供应的罐(或“中间罐”)。因此，可以通过提余液出口管线或提取物出口管线来供应所述罐。可以由每个出口管线(即提余液的出口管线和提取物的出口管线)供应对应的罐。以在罐上存在的出口管线中收集的馏分来供应所述罐。罐直接或间接连接到第二系统，将所述罐中包含的馏分供应至第二系统。
优选地，在一个周期中，该罐的容积小于所收集的馏分(即，供应该罐的收集馏分)的体积。在一些实施方案中，罐容纳的馏分体积等于在一到五个阶段的时期内，优选三个阶段内收集的馏分的体积。
特别有利的是，当连续进行几次纯度和/或收率测量时，在这些测量之间无需清洁和/或清除和/或冲洗存储罐。
待分离混合物可以包含上面已经提到的物质。
在某些实施方案中，待分离混合物的要确定浓度的至少两种物质是单糖。在这些实施方案中，提取物和提余液富含不同的单糖。特别地，所述单糖选自以上在本发明的第一方面的描述中提及的单糖。
在某些实施方案中，待分离混合物中的至少两种物质是葡萄糖和果糖。
在某些实施方案中，根据本发明的方法还包括：
·在系统节点中确定变量的时间相关曲线，该变量代表了待分离混合物中包含的一种或多种物质的浓度；
·在所述时间相关曲线上检测高浓度特征点，该特征点位于提余液收集步骤的起点与随后的提取物收集步骤的终点之间；
·比较高浓度特征点的位置与目标位置；
·调整承载高浓度特征点的体积，改变高浓度特征点的位置以使其接近目标位置。
上面关于高浓度特征点所描述的内容可以应用于本发明的第三方面。
在某些实施方案中，根据本发明的方法还包括：
·在所述时间相关曲线上检测在提取物收集步骤的起点与后续流动相注入步骤的终点之间的第一特征点(也称为吸附特征点)；
·在所述时间相关曲线上检测在流动相注入步骤的起点与随后的提余液收集步骤之间的第二特征点(也称为解吸特征点)；
·将每个特征点的位置与各自的目标位置进行比较；
·调整承载第一特征点的体积和承载第二特征点的体积，改变第一特征点和第二特征点的位置，以使它们更接近各自的目标位置。
以上关于吸附和解吸特征点所描述的内容可以应用于本发明的第三方面。
在某些实施方案中，根据本发明的方法还包括：
·在系统节点中确定变量的时间相关曲线，该变量代表了待分离混合物中包含的一种或多种物质的浓度；
·在所述时间相关曲线上检测在提取物收集步骤的起点与随后的提余液收集步骤的终点之间的低浓度特征点；
·将低浓度特征点的位置与目标位置进行比较；
·调整承载低浓度特征点的体积，改变低浓度特征点的位置，以使低浓度特征点的位置更接近目标位置；
·优选地，每个周期注入的流动相的体积保持大于或等于最小极限和/或小于或等于最大极限。
上面关于低浓度特征点的描述内容可以应用于本发明的第三方面。
在一些实施方案中，该方法还包括将测得的纯度和/或测得的收率与目标纯度进行比较的步骤。如果在提取物中和提余液中测量纯度和/或收率，则该方法可以包括将两个测量的纯度和/或收率与各自的目标纯度和/或收率进行比较的步骤。
在某些实施方案中，根据本发明的方法还包括以下步骤：根据所测得的纯度与目标纯度之间的差异(和/或测量的收率与目标收率之间的差异)，改变每个周期注入的待分离混合物的体积。
在某些实施方案中，根据本发明的方法包括以下步骤：根据测得的纯度与目标纯度之间的差异(和/或测得的收率和目标收率之间的差异)，改变每个周期注入的流动相的体积。
在某些实施方案中，根据测得的纯度和目标纯度之间的差异(和/或测得的收率和目标收率之间的差异)共同改变每个周期注入的混合物的体积和每个周期注入的流动相的体积。
在某些实施方案中，该方法包括根据测得的纯度和目标纯度之间的差异(和/或测得的收率和目标收率之间的差异)定义特征点的目标位置的步骤。它可以是高浓度特征点的目标位置的定义，和/或吸附特征点的目标位置的定义，和/或解吸特征点的目标位置的定义和/或低浓度特征点的目标位置的定义。
上面关于将测得的纯度和/或收率与目标纯度和/或收率进行比较，根据该比较来改变注入的混合物的体积和流动负载的体积，以及根据该比较来定义特征点的目标位置的描述可以应用于本发明的第三方面。
本发明的另一个目的包括一种计算机程序，其包括程序代码指令，当在计算机上执行所述程序时，所述程序代码指令用于执行根据本发明的第三方面的方法的步骤。
本发明还涉及一种计算机可读存储介质，在其上记录了如上定义的计算机程序。
本发明还涉及一种系统，该系统包括耦合到存储器的处理器，在所述存储器上记录了如上定义的计算机程序。所述系统还可以包括如上所述的色谱分离系统，或者可以仅仅是连接至分离系统并且与之分离的控制系统。
实施例
下列实施例举例说明本发明而不是限制本发明。
在随后的实施例1至5中，使用色谱模拟模型，其参数如下：
-存在于待分离混合物中的物质：聚合度(order)大于或等于2的葡聚糖，葡萄糖和果糖；
-固定相：来自Novasep的树脂XA2004/30Ca；
-流动相：水；
-洗脱温度：55℃至65℃之间。
这些呈现在长2米、直径8.5厘米的色谱柱中20mL/min的流速下的加载脉冲、高浓度饱和和低浓度饱和的浓度图分别显示在图5.A、5.B和5.C中。这些数据使得可以使用例如，在手册《Preparative Chromatography of Fine Chemicals and PharmaceuticalAgents(精细化学和药物制剂的制备色谱)》，Henner Schmidt-Traub，Wiley-VCH，ISBN-13978-3-527-30643-5中描述的方法，使用任何色谱模拟软件来重建所使用的模型。
实施例1、2、4和5中使用的方法是SSMB4，总柱高为8米。
实施例3中使用的方法是SMB，其总柱高为8米。
在随后的实施例6至7中，使用以下参数在中试设备上进行了真正的色谱分离：
-存在于待分离混合物中的物质：聚合度大于或等于2的葡聚糖，葡萄糖和果糖；
-固定相：来自Novasep的树脂XA2004/30Ca；
-流动相：水；
-洗脱温度：55℃至65℃之间；
-中试设备由4根2米长、直径8.5厘米的色谱柱组成；
-产品和洗脱液的流速在20到30mL/min之间；
-所采用的方法是SSMB，总柱高为8米。
实施例1
进行如上所述的色谱方法的模拟。
在1号周期和10号周期之间稳定系统，将不同区域的体积固定并保持恒定。注入的流动相的体积为0.18BV(床体积)。
从第10个周期开始，用位于区域4的+0.17(目标位置与吸附体积除以周期体积的特征点的偏差，相对于平均洗脱液注入位置)和区域1的-0.17处(目标位置与解吸体积除以周期体积的特征点的偏差，相对于平均洗脱液注入位置)的特征点的目标位置来调节区域。这对应于位于平均洗脱液注入点处的低浓度特征点的目标位置。
然后，在不限制流动相的体积的情况下，对使用吸附和解吸的两个特征点调节的方法(如文献WO2007/101944中所述)与其中已施加最大体积阈值的根据本发明的采用低浓度特征点调节的方法进行比较。
结果总结在图6、7、8和9中。
可以看出，当使用吸附和解吸的两个特征点对方法进行调节时，其中两个特征点均达到其目标位置。这对于低浓度特征点也是一样的。为了实现这些特征点位置目标，将流动相体积增加到0.27BV。
在第二种情况下，将流动相的体积限制为0.22BV，并根据本发明使用低浓度特征点调节色谱方法。低浓度特征点保持不变。发现达到了低浓度点的目标位置，特征点达到了洗脱液注入点的位置。然而，没有达到吸附和解吸特征点的目标位置。达到这些目标位置所需的流动相体积尚未达到，并且已将其限制为预设的最大值。相对于洗脱液注入的平均位置(体积除以周期体积)，吸附和解吸的特征点分别位于+0.143和-0.143。每个吸附和解吸特征点与它们的目标位置之间的差的绝对值相同，并且差之和为零。
因此，根据本发明的方法使得可以避免超过所用流动相体积的上限，该上限不允许通过考虑吸附和解吸的两个特征点调节的方法。
实施例2
进行如上所述的色谱方法模拟。
在1号周期和10号周期之间稳定系统，将不同区域的体积固定并保持恒定。流动相体积为0.25BV。
从第10个周期开始，用位于区域4的+0.10(吸附体积除以周期体积的特征点的位置，相对于平均洗脱液注入位置)和区域1的-0.10(解吸体积除以周期体积的特征点的位置，相对于平均洗脱液注入位置)处的特征点的目标位置来调节区域。这对应于位于平均洗脱液注入点处的低浓度特征点的目标位置。
然后，在不限制流动相的体积的情况下，对使用吸附和解吸的两个特征点调节的方法(如文献WO2007/101944中所述)与其中已施加最小体积阈值的根据本发明的采用低浓度的特征点调节的方法进行比较。
结果总结在图10、11、12和13中。
可以看出，当使用吸附和解吸的两个特征点对方法进行调节时，两个特征点各自达到其目标位置(在+0.10和-0.10处)。这对于低浓度特征点也是一样的。为了实现这些特征点位置目标，将流动相体积减小到0.18BV。
在第二种情况下，将流动相的体积最小化为0.20并根据本发明使用低浓度特征点调节色谱方法。低浓度的特征点保持不变。可以看出，在洗脱液注入点达到了低浓度特征点的目标位置。但是，没有达到吸附和解吸的特征点的目标位置。达到这些目标位置所需的流动相体积尚未达到，并且已将其限制为预设的最小值。相对于洗脱液注入的平均位置(体积除以周期体积)，吸附和解吸的特征点位于+0.12和-0.12。每个吸附和解吸的特征点与其目标位置之间的差相同。
因此，根据本发明的方法使得可以不超过所使用的流动相的体积的下限，该下限不允许通过考虑吸附和解吸的两个特征点调节的方法。
实施例3
进行如上所述的色谱方法的模拟。
对提取物和提余液馏分的纯度和果糖收率进行测量，同时将这些馏分收集在设置在色谱出口处的罐中，并从每个罐中连续抽出，以使罐中的平均体积代表三个阶段。
在1号周期和10号周期之间稳定系统，将不同区域的体积固定并保持恒定。注入的待分离混合物(负载)的体积为0.175BV。收率为90.3％，纯度为84.9％。低浓度特征点的目标位置位于平均洗脱液注入点上。
从第10个周期开始，调节区域和注入的装填量，目标是提取物馏分的纯度为90％，收率为85％。通过使用根据本发明的方法的低浓度特征点的调节，将流动相体积保持恒定在+0.2BV的值。
结果总结在图14中。
在洗脱液的平均注入位置上调节低浓度特征点。流动相的体积因此保持恒定并受到控制。
达到了收率和纯度的目标，注入的装填量增加到+0.179BV。
实施例4
进行如上所述的色谱方法的模拟。
在提取物馏分中进行纯度和果糖收率的测量。
在1号周期和10号周期之间稳定系统，将不同区域的体积固定并保持恒定。注入的待分离混合物(负载)的体积为0.175BV。收率为90.3％，纯度为84.9％。流动相体积恒定为+0.2BV。低浓度特征点的目标位置位于平均洗脱液注入点上。
从第10个周期开始，根据本发明的方法使用低浓度特征点调节该方法，纯度和收率目标分别为90％和85％，注入的装填量保持恒定在+0.175BV。
结果总结在图15中。
低浓度特征点在洗脱液注入的平均位置进行调节。由此控制流动相的体积。
达到了收率和纯度的目标，流动相的体积减少到+0.194BV。
实施例5
进行如上所述的色谱方法模拟。
在提取物馏分中进行纯度和果糖收率的测量。
低浓度特征点的目标位置根据所需的纯度和收率进行优化。
在第一个测试中，低浓度特征点的目标位置相对于洗脱液注入的平均位置固定为-0.1BV(在提取物处)，同时应用实施例4中所述的调节。
结果总结在图16中。获得的流动相体积为+0.198BV。
在第二个测试中，相对于洗脱液的平均注入位置，低浓度特征点的目标位置固定为+0.1BV(朝向提余液)，并应用实施例4中所述的调节。
结果总结在图17中。获得的流动相体积为+0.194BV。
因此可以定位低浓度特征点，以获得最小体积的流动相。当特征点相对于洗脱液的平均注入位置朝向提余液位于+0.04BV时，在注入的负载量固定为+0.175BV的情况下，可获得该分离的最小流动相体积(值为+0.193BV)。结果总结在图18中。
实施例6
进行如上所述的实验色谱测试。
使用色谱法处理待分离混合物，其中包含葡萄糖、果糖和少量葡聚糖(聚合度为2(DP2)，3(DP3)及以上)。
对于待分离的两种物质(葡萄糖和果糖)，作为温度的函数以及作为物质的浓度的函数，对密度仪和旋光仪进行校准。旋光仪校准的结果总结在图19和20中。
然后使用先前校准的密度仪和旋光仪在线测量两个时间相关曲线。
图1和图2说明了该实施例，因为从这些时间相关曲线中，在一个周期上，对于每个馏分(提取物和提余液)，在时间相关曲线的对应于馏分收集的部分上对来自每个检测器的信号进行积分，以确定每个收集的馏分的“平均”密度和“平均”极性。
葡萄糖以及葡聚糖混合物都是右旋的，即，由旋光仪测得的由葡萄糖和葡聚糖引起的旋转角为正。果糖是左旋的，即由旋光仪测得的由果糖引起的旋转角为负。
在混合物测量过程中，通过旋光仪测得的旋转角度是混合物中所含不同物质以单一方式引起的旋转角度的总和。
因此，我们可以建立以下等式：
α＝α(T)葡萄糖.C葡萄糖+α(T)果糖.C果糖,
其中：
-α是葡萄糖/果糖混合物的由旋光仪测量的角度，
-α(T)是在旋光仪的校准期间得到的在测量温度下的物质的旋转角度，和
-C是该物质的浓度。
作为每种糖浓度的函数用密度仪测量葡萄糖和果糖混合物的密度，满足以下方程式：
密度＝β(T).(C葡萄糖+C果糖)+密度洗脱液(T)
其中：
-密度是通过密度仪测得的密度，
-密度洗脱液(T)是在测量温度下洗脱液的密度，
-β(T)是在测量温度下葡萄糖和果糖的密度因子，此因子与在给定的温度下纯葡萄糖和果糖的相同，并且
-C是该物质的浓度。
这两个方程式允许根据表征每个馏分的平均密度和旋转角度使用高斯枢轴法(Gauss pivot method)计算混合物中葡萄糖和果糖的浓度。然后可以从这些浓度计算出葡萄糖和果糖各馏分的纯度。
该方法允许相对准确地测量所收集馏分的葡萄糖和果糖浓度。根据其他少数杂质(如葡聚糖)在这两个收集馏分之间的分布，还可以在校正项的裕度内校正提取物和提余液的纯度。
实施例7
进行如上所述的实验色谱测试。
在提取物馏分中进行纯度和果糖收率的测量。
在1号周期和20号周期之间，稳定并调节系统。
注入的待分离混合物(负载)的体积为0.15BV。收率为90％，纯度为90％。低浓度特征点的目标位置位于平均洗脱液注入点上。
从第20个周期开始，调节区域和注入的负载体积，目标是纯度为86％，收率为92％。通过使用根据本发明的方法的低浓度特征点的调节，将流动相体积保持恒定在+0.18BV的值。从第60个周期开始，在注入负载的浓度上产生振荡，其中所述控制方法保持了系统的性能。
结果总结在图21中。
在洗脱液的平均注入位置上调节低浓度的特征点。流动相的体积因此保持恒定并受到控制。
达到了收率和纯度的目标，注入的装填量增加到+0.16BV。