阅读说明：本技术 一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法 (Method for separating isomers of oleanolic acid and ursolic acid ) 是由 童胜强 王超越 王香 于 2019-08-30 设计创作，主要内容包括：一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法,所述方法为：在分液漏斗中加入羟丙基-β-环糊精水溶液、正己烷和乙酸乙酯组成的混合溶剂体系,充分振摇后静置分层,取上相作为固定相,下相作为流动相；取齐墩果酸和熊果酸混合物用固定相和流动相的混合溶液溶解,得到样品溶液；取固定相注满逆流色谱仪的分离柱,开启速度控制器,使分离柱正转,注入流动相,等到柱尾端流出流动相时,表明两相已达到平衡,这时将样品溶液注入分离柱,紫外检测器检测,用自动部分收集器收集洗脱液,分别合并含目标物质的洗脱液,经后处理得到齐墩果酸、熊果酸；本发明操作简便,高效快捷,溶剂消耗少,齐墩果酸与熊果酸纯度高,且分离过程中样品回收率高。(A method of separating isomers of oleanolic acid and ursolic acid, said method comprising: adding a mixed solvent system consisting of a hydroxypropyl-beta-cyclodextrin aqueous solution, normal hexane and ethyl acetate into a separating funnel, fully shaking, standing for layering, taking an upper phase as a stationary phase, and taking a lower phase as a mobile phase; dissolving a mixture of oleanolic acid and ursolic acid by using a mixed solution of a stationary phase and a mobile phase to obtain a sample solution; filling a separation column of a counter-current chromatograph with a stationary phase, starting a speed controller to enable the separation column to rotate forwards, injecting a mobile phase, and when the mobile phase flows out from the tail end of the column, indicating that the two phases are balanced, injecting a sample solution into the separation column, detecting by an ultraviolet detector, collecting eluent by an automatic part collector, respectively combining the eluents containing target substances, and performing post-treatment to obtain oleanolic acid and ursolic acid; the method has the advantages of simple and convenient operation, high efficiency, rapidness, less solvent consumption, high purity of the oleanolic acid and the ursolic acid and high sample recovery rate in the separation process.)

一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法

(二)背景技术

齐墩果酸(oleanolic acid)和熊果酸(ursolic acid)均为五环三萜类化合物，在自然界中分布很广，两者互为同分异构体，分子式为C₃₀H₄₈O₃，仅有一个甲基的位置不同，不易分离。它们在植物中广泛存在而且总是同时存在于同种植物。基于齐墩果酸和熊果酸相近的化学结构，二者通常表现出相同或相似的疗效和生物效应。他们具有抵抗化学致癌物诱导的急性肝损伤，慢性肝纤维和肝硬化的显著保肝作用已广为人知。齐墩果酸和熊果酸的其他许多药理作用已经被报道，如抗氧化，抗炎，抗肿瘤，抗HIV，抗菌，保胃和潜在的抗肥胖作用。鉴于三萜酸类化合物在中草药中的自然丰度低和没有紫外吸收或紫外吸收极低的特点，对齐墩果酸以及熊果酸的研究引起了国内外研究者的广泛关注。

逆流色谱(countercurrent chromatography)，是一种连续的不需要固体载体的现代色谱分离技术，相比高效液相色谱而言，可避免固相吸附带来的污染和样品损失，且进样量大，运行成本低，是分离同分异构体的一种理想的制备色谱技术。

(三)

发明内容

本发明的目的是提供一种应用高速逆流色谱分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法，利用环糊精对齐墩果酸和熊果酸有不同的识别作用从而将快速两者分开，具有更强的目的性，快捷高效，工艺简单。

本发明的技术方案如下：

一种分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸的方法，所述方法为：

(1)在分液漏斗中加入羟丙基-β-环糊***溶液、正己烷和乙酸乙酯组成的混合溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相作为高速逆流色谱的固定相，下相用磷酸氢二钠-磷酸缓冲液调节pH至2～8(优选6～7)后作为流动相；

所述羟丙基-β-环糊***溶液的浓度为0.05～0.30mol/L，优选0.1～0.15mol/L；

所述混合溶剂体系中，羟丙基-β-环糊***溶液、正己烷、乙酸乙酯的体积份数分别为10份、8.5～9.5份、0.5～1.5份，优选分别为10份、9份、1份；

(2)取齐墩果酸和熊果酸的混合物用固定相和流动相的混合溶液溶解，得到样品溶液；

所述固定相和流动相的体积比为1：1；

所述固定相和流动相的混合溶液的体积用量以齐墩果酸和熊果酸的混合物的质量计为0.3～0.7mL/mg；

(3)取固定相注满高速逆流色谱仪的分离柱，开启速度控制器，使分离柱正转，在500～1000r/min转速下，以0.5～5mL/min的流速注入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时将样品溶液注入分离柱，波长200～254nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，分别合并含目标物质齐墩果酸、熊果酸的洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到齐墩果酸、熊果酸；

所述样品溶液可通过进样圈注入或通过泵泵入逆流色谱仪；

所述样品溶液的进样体积通常小于分离柱柱体积的30％，优选进样体积为分离柱柱体积的5％～10％；

所述目标物质可通过薄层层析或高效液相色谱进行监测，分别合并与齐墩果酸、熊果酸标准品R_f值或保留时间相同的含齐墩果酸、熊果酸的洗脱液；

所述薄层层析的展开剂为环己烷、乙酸乙酯和冰醋酸体积比10：3：0.5的混合溶剂；

所述高效液相色谱的检测条件为：Agilent 5HC-C₁₈(2)column(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵溶液(67：12：21，v/v/v)，等度洗脱模式；流速：1mL/min；检测波长：210nm；进样量：20μL。

本发明的有益效果在于：本发明操作简便，高效快捷，溶剂消耗少，样品无损失；羟丙基-β-环糊精对齐墩果酸和熊果酸具有很强的识别作用，目的性强，分离效果明显优于传统分离方法。

(四)附图说明

图1：实施例1的高速逆流色谱(HSCCC)图；

图2：实施例2的高速逆流色谱(HSCCC)图；

图3：实施例3的高速逆流色谱(HSCCC)图；

图4：实施例4的高速逆流色谱(HSCCC)图；

图1～图4中，1号峰代表齐墩果酸，2号峰代表熊果酸；

图5：a齐墩果酸和熊果酸混合物的高效液相(HPLC)图；b图1～图4中1号峰的高效液相(HPLC)图；c图1～图4中2号峰的高效液相(HPLC)图。

(五)

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本发明实施例中采用分析型逆流色谱仪以及半制备型逆流色谱，逆流色谱仪分离系统由恒流泵、紫外检测器、记录仪等组成。

实施例1：

配制0.10mol/L羟丙基-β-环糊***溶液、正己烷和乙酸乙酯按照体积比10:9:1配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相作为固定相，下相用磷酸氢二钠-磷酸缓冲液调节pH至3后作为流动相；称取齐墩果酸和熊果酸标准品混合物1.5mg，用0.5ml固定相和0.5ml流动相溶解，得到样品溶液。

采用分析型逆流色谱仪对齐墩果酸和熊果酸混合物进行分离，分离柱的柱体积为15ml。首先将固定相以10ml/min的流速注满分离柱，然后开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为1000r/min，设置流动相的流速为0.5ml/min，开始泵入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时通过六通阀将样品注入分离柱；用自动部分收集器按4分钟/管的速度接收洗脱液，用薄层层析(展开剂为环己烷：乙酸乙酯：冰醋酸＝10:3:0.5)跟踪检测至洗脱液中无齐墩果酸以及熊果酸组分，停止收集。收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与齐墩果酸标准品R_f值(R_f＝0.67)及保留时间(21.7min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到齐墩果酸0.23mg，其中齐墩果酸的纯度99.61％，回收率为93.22％；同时合并与熊果酸标准品R_f值(R_f＝0.60)及保留时间(22.5min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到熊果酸0.65mg，其中熊果酸的纯度99.41％，回收率为92.23％；

高效液相色谱的检测条件为：Agilent 5HC-C₁₈(2)column(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵溶液(67：12：21，v/v/v)，等度洗脱模式；检测波长：210nm；进样量：20μL。

实施例2：

配制0.1mol/L羟丙基-β-环糊***溶液、正己烷和乙酸乙酯按照体积比10:9:1配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相作为固定相，下相用磷酸氢二钠-磷酸缓冲液调节pH至5后作为流动相；称取齐墩果酸和熊果酸标准品混合物20mg，用5ml固定相和5ml流动相溶解，得到样品溶液。

采用半制备型逆流色谱仪对齐墩果酸和熊果酸进行分离，分离柱的柱体积为105ml。首先将固定相以10ml/min的流速注满分离柱，然后开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为600r/min，设置流动相的流速为2ml/min，开始泵入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时通过六通阀将样品注入分离柱；用自动部分收集器按4分钟/管的速度接收洗脱液，运行300min后，将流动相流速变为4ml/min，继续收集洗脱液，用薄层层析(展开剂为环己烷：乙酸乙酯：冰醋酸＝10:3:0.5)跟踪检测至洗脱液中无齐墩果酸以及熊果酸组分，停止收集。收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与齐墩果酸标准品R_f值(R_f＝0.67)及保留时间(21.7min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到齐墩果酸3.73mg，其中齐墩果酸的纯度99.21％，回收率为91.23％；同时合并与熊果酸标准品R_f值(R_f＝0.60)及保留时间(22.5min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到熊果酸11.26mg，其中熊果酸的纯度99.07％，回收率为93.51％；

高效液相色谱的检测条件为：Agilent 5HC-C₁₈(2)column(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵溶液(67：12：21，v/v/v)，等度洗脱模式；检测波长：210nm；进样量：20μL。

实施例3：

配制0.1mol/L羟丙基-β-环糊***溶液、正己烷和乙酸乙酯按照体积比10:9.5:0.5配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相作为固定相，下相用磷酸氢二钠-磷酸缓冲液调节pH至7后作为流动相；称取齐墩果酸和熊果酸混合物20mg，用5ml固定相和5ml流动相溶解，得到样品溶液。

采用半制备型逆流色谱仪对齐墩果酸和熊果酸进行分离，分离柱的柱体积为105ml。首先将固定相以10ml/min的流速注满分离柱，然后开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为600r/min，设置流动相的流速为2ml/min，开始泵入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时通过六通阀将样品注入分离柱；用自动部分收集器按4分钟/管的速度接收洗脱液，运行300min后，将流动相流速变为4ml/min，继续收集洗脱液，用薄层层析(展开剂为环己烷：乙酸乙酯：冰醋酸＝10:3:0.5)跟踪检测至洗脱液中无齐墩果酸以及熊果酸组分，停止收集。收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与齐墩果酸标准品R_f值(R_f＝0.67)及保留时间(21.7min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到齐墩果酸3.93mg，其中齐墩果酸的纯度98.79％，回收率为91.19％；同时合并与熊果酸标准品R_f值(R_f＝0.60)及保留时间(22.5min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到熊果酸11.68mg，其中熊果酸的纯度97.08％，回收率为93.99％；

高效液相色谱的检测条件为：Agilent 5HC-C₁₈(2)column(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵溶液(67：12：21，v/v/v)，等度洗脱模式；检测波长：210nm；进样量：20μL。

实施例4：

配制0.15mol/L羟丙基-β-环糊***溶液、正己烷和乙酸乙酯按照体积比10:8.5:2.5配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相作为固定相，下相用磷酸氢二钠-磷酸缓冲液调节pH至4后作为流动相；称取齐墩果酸和熊果酸混合物30mg，用5ml固定相和5ml流动相溶解，得到样品溶液。

采用半制备型逆流色谱仪对齐墩果酸和熊果酸进行分离，分离柱的柱体积为200ml。首先将固定相以10ml/min的流速注满分离柱，然后开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为600r/min，设置流动相的流速为2ml/min，开始泵入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时通过六通阀将样品注入分离柱；用自动部分收集器按4分钟/管的速度接收洗脱液，运行300min后，将流动相流速变为4ml/min，继续收集洗脱液，用薄层层析(展开剂为环己烷：乙酸乙酯：冰醋酸＝10:3:0.5)跟踪检测至洗脱液中无齐墩果酸以及熊果酸组分，停止收集。收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与齐墩果酸标准品R_f值(R_f＝0.67)及保留时间(21.7min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到齐墩果酸5.65mg，其中齐墩果酸的纯度98.90％，回收率为91.76％；同时合并与熊果酸标准品R_f值(R_f＝0.60)及保留时间(22.5min)相同洗脱液，洗脱液用10wt％HCl酸化至pH＝2-3，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤后减压蒸去溶剂后得到熊果酸13.14mg，其中熊果酸的纯度97.01％，回收率为90.85％；

高效液相色谱的检测条件为：Agilent 5HC-C₁₈(2)column(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵溶液(67：12：21，v/v/v)，等度洗脱模式；检测波长：210nm；进样量：20μL。

对比例：

李海鹏等[李海鹏,徐怀德,孟祥敏,等.光皮木瓜齐墩果酸超声波辅助提取及纯化工艺[J].农业工程学报,2008,24(10):222-226.]以光皮木瓜为原料，采用大孔吸附树脂纯化齐墩果酸：采用对齐墩果酸具有较好的吸附和解吸效果的XDA-1型大孔树脂纯化提取的齐墩果酸：以90％浓度乙醇洗脱，洗脱流速1.0m L/min，纯化后得提取物中齐墩果酸纯度仅达26.55％。

林国荣等[林国荣,郭养浩.枇杷叶中熊果酸和科罗索酸分离工艺优化[J].食品工业科技,2014,35(24).]筛选了大孔树脂纯化枇杷叶中熊果酸条件：采用HZ816树脂进行柱分离，上柱流速为1BV/h，上样液熊果酸浓度为2mg/m L；洗脱流速为1BV/h，先后以38％、55％、95％乙醇洗脱，分离后得到熊果酸纯度为85.6％。

这些分离纯化齐墩果酸和熊果酸的方法的生产成本比较高，工艺繁琐复杂而且生产周期长，并且得到的熊果酸或者齐墩果酸纯度不高。而本发明中应用高速逆流色谱分离同分异构体齐墩果酸和熊果酸，操作简单，分离时间短，回收率高，得到的齐墩果酸和熊果酸纯度高，具有一定的推广价值。