肿瘤细胞粘附材料及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 肿瘤细胞粘附材料及其制备方法和应用 (Tumor cell adhesion material and preparation method and application thereof ) 是由 欧来良 于 2020-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种肿瘤细胞粘附材料及其制备方法和应用,涉及医药技术领域,本发明提供的肿瘤细胞粘附材料,包括载体、包覆于载体表面的抗污聚合物、设于载体表面的分子手臂和偶联的小分子粘附配基,其中,抗污聚合物能够有效提高改肿瘤细胞粘附材料的血液相容性,将肿瘤亲和性小分子粘附配基通过连接体偶联到载体上,使得本发明提供的肿瘤细胞粘附材料对肿瘤细胞具有强粘附能力,能够特异性粘附血液、体液或手术区溶液中的肿瘤细胞,从而减少原发性癌症因血液转移或手术创伤播散导致的转移癌的发生,为癌症治疗提供了一种辅助治疗方法。并且,该材料制备简单、成本低、使用中易于操作,具有重要的临床价值与经济、社会效益。(The invention provides a tumor cell adhesion material and a preparation method and application thereof, and relates to the technical field of medicines. In addition, the material is simple to prepare, low in cost and easy to operate in use, and has important clinical value and economic and social benefits.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种肿瘤细胞粘附材料及其制备方法和应用。
背景技术
癌症疾患持续高发，癌症已经成为了城市的首位死因，科技的进步并未降低癌症患者的死亡率，有调查表明，癌症病人死亡，90％是由于癌症的复发转移导致。因此，如何预防和减少肿瘤的转移成为了当前面临的重大问题。
如何有效降低肿瘤的转移是改善肿瘤预后的重要因素。但有很多类型的肿瘤，在发现时已经发生了转移，这也是肿瘤治疗预后不佳的原因之一。而一般认为，肿瘤的转移主要基于以下几种方式，其一为血液转移，该类转移占肿瘤转移的80％以上；其二为淋巴转移；其三为创伤播散，比如手术时引起肿瘤细胞的局部脱落等。因此，如何阻断肿瘤细胞的转移，将是肿瘤治疗需要关注的重要问题。
造成肿瘤转移的因素中，循环肿瘤细胞(Circulating tumour cells，CTCs，指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞)引起的血行播散及手术区局部散落播散占据肿瘤转移的90％以上。因此，若能有效清除循环肿瘤细胞或手术区散落的肿瘤细胞，也将能有效降低肿瘤转移的风险。
肿瘤细胞的快速粘附技术在在循环肿瘤细胞的检测中，在国内、外均有较多报道，用于肿瘤细胞检测的细胞粘附材料多数采用抗原-抗体、外泌体、DNA、RNA等识别的方法，如基于CTC表面标志物原理捕获CTC的技术有：CTC-chip(CTC-芯片)、iFISH-CTC(免疫荧光染色结合FISH技术)等。本发明人也基于抗污材料表面接枝多抗体用于肿瘤细胞的捕获检测(专利申请号：201910485658.9)，这类基于生物分子识别的技术，用于检测前景广阔，而在清除CTC方面的研究则非常之少，用于手术区散落肿瘤细胞的清除更罕见报道。因为这类基于生物大分子(抗体、外泌体、DNA等)为配基的粘附材料，在用于微量检测是时成本尚可接受，但若用于大量肿瘤细胞的清除时，从制作工艺、成本等方面均尚未具有可实施性。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种肿瘤细胞粘附材料，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述肿瘤细胞粘附材料的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供上述肿瘤细胞粘附材料的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种包括本发明提供的肿瘤细胞粘附材料的医疗器械。
本发明提供了一种肿瘤细胞粘附材料，所述肿瘤细胞粘附材料包括载体、抗污聚合物、连接体和小分子粘附配基；
所述抗污聚合物和包覆于所述载体表面；
所述连接体设于所述载体表面，用于偶联所述小分子粘附配基。
进一步的，所述载体包括磁性载体或非磁性载体。
进一步的，所述磁性载体包括磁性氧化铁；
可选地，所述非磁性载体包括聚乙烯醇、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、聚甲基丙烯酸酯类或聚苯乙烯。
进一步的，所述抗污聚合物包括聚乙烯醇、聚己内酯、聚乙二醇或聚丙烯酸酯。
进一步的，所述连接体包括分子手臂或交联剂；
优选地，所述分子手臂带有双官能团；
优选地，所述分子手臂带有胺基、羧基、醛基或羟基中的一种或多种。
进一步的，所述小分子粘附配基包括小分子果胶、多肽、叶酸或多胺化合物中的一种或多种。
进一步的，所述肿瘤细胞粘附材料的形状包括管状、片状、絮状、块状、粉状或球状。
本发明还提供了上述的肿瘤细胞粘附材料的制备方法，包括将载体通过抗污聚合物处理后，通过连接体进行活化，然后偶联小分子粘附配基，得到所述肿瘤细胞粘附材料。
本发明还提供了上述的肿瘤细胞粘附材料在清除肿瘤细胞中的应用；和/或，
在制备防治肿瘤转移的产品中的应用。
另外，本发明还提供了一种医疗器械，所述医疗器械包括上述的肿瘤细胞粘附材料。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的肿瘤细胞粘附材料，包括载体、包覆于载体表面的抗污聚合物、设于载体表面的分子手臂和偶联的小分子粘附配基，其中，抗污聚合物能够有效提高改肿瘤细胞粘附材料的血液相容性，将肿瘤亲和性小分子粘附配基通过连接体偶联到载体上，使得本发明提供的肿瘤细胞粘附材料对肿瘤细胞具有强粘附能力，能够特异性粘附血液、体液或手术区溶液中的肿瘤细胞，从而减少原发性癌症因血液转移或手术创伤播散导致的转移癌的发生，为癌症治疗提供了一种辅助治疗方法。并且，该材料制备简单、成本低、使用中易于操作，具有重要的临床价值与经济、社会效益。
本发明提供的上述肿瘤细胞粘附材料的制备方法，工艺简单、操作方便，适于推广应用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的目的是针对临床循环肿瘤细胞和手术致肿瘤细胞局部散落等所导致的肿瘤转移等问题，提供一种操作简单、处理时间短、结果可靠、价格适中、可有效清除血液和手术区散落肿瘤细胞的肿瘤细胞粘附材料及其制备方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种肿瘤细胞粘附材料，所述肿瘤细胞粘附材料包括载体、抗污聚合物、连接体和小分子粘附配基；
所述抗污聚合物和包覆于所述载体表面；
所述连接体设于所述载体表面，用于偶联所述小分子粘附配基。
本发明提供的肿瘤细胞粘附材料中，抗污聚合物能够有效提高改肿瘤细胞粘附材料的血液相容性，将肿瘤亲和性小分子粘附配基通过连接体偶联到载体上，使得本发明提供的肿瘤细胞粘附材料对肿瘤细胞具有强粘附能力，能够特异性粘附血液、体液或手术区溶液中的肿瘤细胞，从而减少原发性癌症因血液转移或手术创伤播散导致的转移癌的发生，为癌症治疗提供了一种辅助治疗方法。并且，该材料制备简单、成本低、使用中易于操作，具有重要的临床价值与经济、社会效益。
在本发明中，所述载体可以包括磁性载体或非磁性载体。
根据实际吸附需求，可以选择不同材料作为载体制备肿瘤细胞粘附材料。例如，非磁性载体可用于直接从血液、体液或手术区溶液中清除肿瘤细胞；磁性载体可以通过分散在血液、体液或溶液中，再通过磁铁将磁性载体吸附，进而清除血液、体液或手术区溶液中的肿瘤细胞。
可选的磁性载体包括磁性氧化铁。
可选的非磁性载体包括聚乙烯醇、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、聚甲基丙烯酸酯类或聚苯乙烯。
在本发明中，载体材料通过抗污聚合物进行表面抗污处理后，能够得到所需要的具有优良血液相容性的材料。
本发明对抗污聚合物的具体选择不做限定，凡是能够起到增加载体血液相容性的高分子物质均可。优选地，根据所述肿瘤细胞粘附材料用途的不同，所述抗污聚合物包括聚乙烯醇、聚己内酯、聚乙二醇或聚丙烯酸酯以及壳聚糖、聚氨基酸等。例如，用于从血液中清除肿瘤细胞时，需要用血液相容性优异的材料，可以选择聚乙烯醇、聚乙二醇、聚己内酯或聚丙烯酸酯等作为本发明的抗污聚合物；用于非血液中肿瘤细胞清除时，比如组织液或手术区溶液，可用组织相容性优异的材料，包括壳聚糖、聚氨基酸、聚丙烯酸类等作为本发明的抗污聚合物。
在本发明中，连接体用于活化所述载体的表面，使活化后的载体表面能够偶联对肿瘤细胞具有亲和力的小分子粘附配基。
典型的连接体可以为分子手臂或交联剂。
其中，分子手臂官能团的种类一般要根据所要接枝配基的官能团所决定，以保证这两个官能团能够发生化学反应，在本发明中分子手臂优选带有双官能团，例如可以为，但不限于带有胺基、羧基、醛基或羟基中的一种或多种。
需要说明的是，“一种或多种”的含义为，根据不同的用途，双官能团的具体选择可以为胺基、羧基、醛基或羟基其中之一，也可以为其中的两种、三种或四种。本发明对此不作限定。
在本发明中，小分子粘附配基对肿瘤细胞具有高亲和力，通过偶联小分子粘附配基，能够实现对肿瘤细胞的有效吸附。根据所述肿瘤细胞粘附材料用途的不同，所述小分子粘附配基包括小分子果胶、多肽、叶酸或多胺化合物中的一种或多种。例如，用于血液中肿瘤细胞的清除时，一般用多肽、果胶、叶酸作为本发明中的小分子粘附配基，其与血液相容性更好；用于组织液或手术区液体肿瘤细胞清除时，除上述配基外，还可用多胺配基。
同样地，“一种或多种”的含义为，根据不同的用途，小分子粘附配基的具体选择可以为小分子果胶、多肽、叶酸或多胺化合物其中之一，也可以为其中的两种、三种或四种。本发明对此不作限定。
其中，多肽优选为18个氨基酸以下的多肽，例如RKEM、RHCLS、RHCLSGGGGRKEM等。
在本发明中，载体可以为任意形状，例如可以为，但不限于管状、片状、絮状、块状、粉状或球状。
当载体为管状、球状或块状时，可更适用于循环血液中肿瘤细胞的清除；当载体为粉状、片状、絮状或球状时，可更适用于体液或手术区溶液中的肿瘤细胞的清除。
根据本发明的第二个方面，本发明还提供了上述肿瘤细胞粘附材料的制备方法，包括将载体通过抗污聚合物处理后，通过连接体进行活化，然后偶联小分子粘附配基，得到所述肿瘤细胞粘附材料。
本发明提供的肿瘤细胞粘附材料的制备方法，工艺简单、操作方便，适于推广应用。
基于本发明提供的肿瘤细胞粘附材料的有益效果，本发明还提供了上述肿瘤细胞粘附材料在清除肿瘤细胞中的应用。以及，上述肿瘤细胞粘附材料在制备防治肿瘤转移的产品中的应用。
本发明提供的肿瘤细胞粘附材料能够吸附所有类型的肿瘤细胞，可以粘附血液、体液、手术区渗液中的肿瘤细胞。其不仅可以作为手术前的预防性治疗，也可以用于术中、术后预防肿瘤细胞的转移。
通过本发明提供的肿瘤细胞粘附材料对肿瘤细胞的特异性粘附效果，可以将该肿瘤细胞吸附材料应用于现有的医疗器械中，便于临床操作或使用，例如可用作手术时体外循环或静脉流转系统管路的涂层材料；也可用于透析器或血液滤过器的膜表面涂层；也可与上述医械联合使用等，本发明对此不作限定。
另外，本发明还提供了一种医疗器械，所述医疗器械包括上述的肿瘤细胞粘附材料。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1肿瘤细胞粘附微球的制备及应用
1、肿瘤细胞粘附微球载体的制备
通过悬浮聚合法合成聚乙烯醇(PVA)球形载体：
①预先配置1.5％(w/v)聚乙烯醇水溶液1000mL。
②将67.6mL的单体乙酸乙烯酯、27g的交联剂异氰尿酸三烯丙酯(TAIC)、各45mL的液体致孔剂乙酸乙酯与正庚烷，加入到1000mL三颈烧瓶中，并在40℃下搅拌至完全溶解(约30min)。向反应体系中加入2g的引发剂偶氮二异丁腈(ABIN)，搅拌至完全溶解。
③加入预先配置好的水相(1.5％(w/v)聚乙烯醇水溶液)500mL，调节搅拌速度至能使体系分散为均匀的小油珠，逐步温度升高至75℃，反应3h使其充分反应。
④将得到的微球用热水洗涤将油稍微洗去，用200目的筛子筛洗至无味，晾干。再用甲醇在90℃下充分抽提约48h，把微球中的致孔剂和多余的有机物(单体、致孔剂)给除去。
⑤给微球加入至3％(w/v)的NaOH/甲醇溶液中，在40℃进行酯交换18h，反应中间需换一次液。用水将微球洗至中性后，用甲醇抽滤，晾干。最后再将甲醇抽提24h，使微球中的杂质等被充分除去，低温干燥，即可得到所需要的球形载体。
2、球形载体的活化与配基偶联
取上述微球10g，加入到100ml含10％(w/v)的环氧氯丙烷水溶液中，NaOH调节pH值至11，50℃反应4小时，然后用200ml去离子水充分清洗。再将活化后微球加入到1％(w/v)的小分子果胶溶液中，pH 10条件下反应1.5小时，然后滤去反应液，去离子水冲洗后，即得到所需的肿瘤细胞粘附微球。
实施例2肿瘤细胞粘附片的制备
1、粘附片载体的制备
取壳聚糖10g，置入500ml含1％的醋酸水溶液中，室温搅拌下溶解4小时，倒入一定形状的容器中，然后缓慢加入1％的NaOH水溶液，使溶液固化成膜，大量水洗后，放入-70℃冰箱冷冻，冷冻完毕后，冷冻干燥机干燥24小时，备用。
2、接枝分子手臂
取冷冻干燥的粘附片载体10cm2，过量加入预先配制好的1mg/ml浓度NH2-PEG-COOH，室温反应30分钟，吸弃反应液，PBS清洗3次，每次5分钟，即得到交联化并具有配基键合活性的粘附片载体。
3、偶联亲和配基
将上述的活化后的10cm2粘附片，放入预先配制好10ml的10mg/ml的叶酸水溶液中，45℃反应2小时，即得到肿瘤细胞粘附吸附片。
实施例3肿瘤细胞粘附棉的制备
1、粘附棉的活化
取干燥医用棉10g，中加入100ml二甲基亚砜和80ml环氧氯丙烷于40℃下溶胀30min，再加入10ml 3mol/l的NaOH溶液，40℃下振荡反应5h，将挤去反应液，用去离子水淋洗至中性，4℃保存备用，活化后棉球的环氧值为150umol/g。
2、粘附棉配基的偶联
量取活化后的湿棉10g加入含50mg多肽RKEM水溶液中，37℃下振荡反应24h，抽滤，用去离子水淋洗至中性，即得到可用于肿瘤细胞粘附的棉球。
实施例4磁性肿瘤细胞粘附微球的制备
1、包膜磁性微球的制备
取粒径10-15nm的四氧化三铁微球5g，放入烧杯中，然后在烧杯中加入10ml预先配置的1％壳聚糖的1％的乙酸水溶液，快速搅拌(30-50转/分钟)30分钟，然后逐渐升温(1-2℃/分钟)至60℃，直至微球充分干燥。然后缓慢滴加0.1％的氢氧化钠水溶液，使包膜剂固化，备用。
2、磁性微球的抗污手臂配基偶联
取上述制备的薄膜磁性微球5g，放入50ml的烧瓶中，然后再向烧瓶中加入2％的NH2-PEG-NH2溶液10ml，然后缓慢滴加1％的戊二醛溶液，使包膜壳聚糖以及壳聚糖上的活性NH2基团与NH2-PEG-NH2偶联或交联，进而获得带有大量胺基基团的磁性微球。
实验例1肿瘤细胞粘附试验
实施例1、2、3、4制备的肿瘤细胞吸附剂对肿瘤细胞粘附效果的考察。
1、分别取5ml的PBS，加入一定量的MCF7-pEGFP细胞，搅拌混匀，各加入0.25g上述实施例中制备的肿瘤细胞粘附材料，37℃孵育震荡粘附30min。每个样品重复测试3次。
2、将实施例1、2、3孵育后的混悬液加入一个过滤装置中，抽滤使液体缓慢通过滤器和滤膜(孔径为0.22微米)，加入5ml缓冲液冲洗上样管管壁和滤膜。将实施例4孵育后的悬浮液流经一个磁铁环，再经过一个过滤装置中，抽滤使液体缓慢通过滤器和滤膜(孔径为0.22微米)，加入5ml缓冲液冲洗上样管管壁和滤膜。
3、将滤膜取出，固定于载玻片上，在荧光显微镜下对肿瘤细胞进行鉴定和计数。
4、结果显示，本发明材料对PBS中各类肿瘤细胞的粘附率均在90％以上。
实验例2
使用实施例1、2、3、4制备的试剂盒检测体外模拟循环肿瘤细胞。
1、将10000个用红色荧光DiI预标记的肿瘤细胞(Hela细胞)加入7.5ml健康志愿者的外周血中，模拟肿瘤患者外周血标本。分别加入0.5g肿瘤细胞粘附材料，37℃孵育30min。
2、将实施例1、2、3孵育后的混悬液加入过滤装置中，抽滤处理使液体缓慢通过滤器和滤膜，加入5ml缓冲液冲洗上样管管壁和滤膜。将实施例4孵育后的悬浮液流经一个磁铁环，再经过一个过滤装置中，抽滤使液体缓慢通过滤器和滤膜(孔径为0.22微米)，加入5ml缓冲液冲洗上样管管壁和滤膜。
3、将滤膜取出，固定于载玻片上，在荧光显微镜下，按照判定标准对肿瘤细胞进行鉴定和计数。
4、结果显示，本发明粘附材料试对体外模拟血液肿瘤细胞粘附率均在85％以上。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。