阅读说明：本技术 一种含氯倍半萜衍生物及其制备和应用 (Chlorine-containing sesquiterpene derivative and preparation and application thereof ) 是由 季乃云 宋银平 于 2020-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及抑藻剂领域,具体地说是一种海藻内生真菌来源的含氯倍半萜衍生物及其制备方法和在抑藻方面的应用。具体结构式如(I)所示,其制备方法为将海藻内生真菌绿木霉(Trichoderma virens)RR-dl-6-8接种于真菌培养基中发酵培养,发酵产物经分离纯化后,即为式(I)所示的含氯倍半萜衍生物。本发明获得的含氯倍半萜衍生物经抑微藻活性实验得出化合物对微藻的半数抑制浓度可达0.83微克/毫升。<Image he="464" wi="459" file="DDA0002506452230000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention relates to the field of algae inhibiting agents, in particular to a chlorine-containing sesquiterpene derivative derived from algal endophytic fungi, a preparation method thereof and application thereof in algae inhibition. The preparation method comprises inoculating Trichoderma viride (Trichoderma virens) RR-dl-6-8 of marine algae endophytic fungus into a fungus culture medium for fermentation culture, and separating and purifying the fermentation product to obtain the chlorine-containing sesquiterpene derivative shown in formula (I). The chlorine-containing sesquiterpene derivative obtained by the invention inhibits microalgae activityExperiments show that the half inhibitory concentration of the compound on microalgae can reach 0.83 micrograms/milliliter.)

一种含氯倍半萜衍生物及其制备和应用

技术领域

本发明涉及抑藻剂领域，具体地说是一种海藻内生真菌来源的含氯倍半萜衍生物及其制备方法和在抑藻方面的应用。

背景技术

世界范围内，近海赤潮灾害日益加剧，严重阻碍海洋渔业、近岸旅游和海洋经济的发展。赤潮的主要危害形式主要包括破坏海洋生态平衡，破坏海洋渔业资源，危害人类健康，影响海洋旅游业的发展。海洋中可引发赤潮的微藻约有300种，其中有毒赤潮藻约80种。科学有效地预防和治理赤潮是当今世界性难题之一。赤潮的防治对策除了防止海水富营养化外，还要遏制赤潮生物即赤潮藻的发展，而遏制赤潮藻发展的方法主要为化学药剂治理。虽然化学药剂如硫酸铜、氯气等可快速、有效地杀死或抑制有害藻类或抑制其生长繁殖，但存在对非赤潮生物的危害、药物残留以及对环境的二次污染等问题。

与治理赤潮中使用的传统的化学药剂相比，海洋生物源天然药物具有针对性强、安全性高、活性显著且对环境友好的优点，为解决目前由赤潮藻引发的赤潮的防治问题提供了新的思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种含氯倍半萜衍生物及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种含氯倍半萜衍生物，含氯倍半萜衍生物的结构如式(I)所示

一种含氯倍半萜衍生物的制备方法，将绿木霉(Trichoderma virens)RR-dl-6-8接种于真菌培养基中发酵培养，发酵产物经纯化后，即为式(I)所示的含氯倍半萜衍生物；所述的绿木霉(Trichoderma virens)RR-dl-6-8于2018年6月27日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2018406。

具体为：

1)将绿木霉(Trichoderma virens)RR-dl-6-8接种于真菌培养基中发酵10-60天，而后经有机溶剂提取并浓缩，即为粗提物；

2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；

3)收集步骤2)中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析、凝胶柱层析和制备薄层层析分离纯化，即得如式(I)所示的含氯倍半萜衍生物。

步骤1)中真菌培养基为大米固体培养基、菊芋葡萄糖液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基。

有机溶剂提取液为乙酸乙酯、石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中一种或几种。

步骤2)中的有机溶剂为体积比50-0:1的石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙醇、石油醚-丙醇、石油醚-异丙醇、二氯甲烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、二氯甲烷-丙醇、二氯甲烷-异丙醇中的一组或几组。

所述薄层层析的展开剂为体积比100-0:1的石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙醇、二氯甲烷-甲醇中的一组或几组。

步骤3)所述反相硅胶柱层析洗脱液为体积比5-0:1的水-甲醇或水-乙醇；凝胶柱层析洗脱液为体积比2-0:1的二氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-乙醇；制备薄层层析展开剂为体积比为30-0:1的二氯甲烷-甲醇或石油醚-乙醇。

一种含氯倍半萜衍生物的应用，所述的含氯倍半萜衍生物用于制备微藻的抑藻剂中的应用。

所述抑藻剂可作为引起赤潮危害的赤潮异弯藻、强壮前沟藻或东海原甲藻中的一种或几种。

本发明具有以下优点：本发明的含氯倍半萜衍生物是通过分离于海洋红藻松节藻的绿木霉(Trichoderma virens)RR-dl-6-8发酵经提取、分离获得，其经抑制微藻活性实验得出化合物对能引起赤潮的赤潮异弯藻、强壮前沟藻和东海原甲藻的半数抑制浓度分别为0.87微克/毫升、1.5微克/毫升和0.83微克/毫升。

具体实施方式

：

下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。

实施例1

海藻内生真菌来源的含氯倍半萜衍生物的结构如式(I)所示。

该化合物具有以下理化和波谱特性：

无色油状；比旋光度[α]²⁰ _D42(c 0.74,MeOH)；核磁共振氢谱(溶剂为氘代氯仿)δ_H0.74d(6.9),0.89d(6.9),1.13dddd(14.1,13.9,12.3,3.4),1.32dddd(12.3,10.5,3.2,3.2),1.40ddd(13.9,13.2,3.5),1.63m,1.69dddd(14.1,3.6,3.5,3.2),2.37ddd(13.2,3.6,3.4),2.75d(11.8),2.81ddd(11.8,10.5,10.4),3.63s,3.77s,3.88s,4.31s,6.42d(10.4)；核磁共振碳谱(溶剂为氘代氯仿)δ_C 15.6CH₃,20.4CH₂,21.5CH₃,28.3CH,35.5CH₂,40.2CH,46.4CH,48.6CH₂,52.2CH₃,52.5CH₃,57.5CH₂,57.6CH,72.4CH,133.7C,144.4CH,167.5C,173.6C；高分辨质谱[M]⁺m/z 362.1497，计算值362.1496。

实施例2

如式(I)所示的含氯倍半萜衍生物的制备方法：

取平板上生长良好的绿木霉(Trichoderma virens)RR-dl-6-8菌种，切成小块并接种于大米固体培养基中，每1升三角瓶中放50克大米固体培养基，共200瓶，室温静止发酵40天，而后用乙酸乙酯提取三次，减压浓缩，浓缩后得粗提物134.6克。

所述大米固体培养基组成为每升含500克大米，蛋白胨6克，蒸馏水500毫升，陈海水500毫升。

绿木霉(Trichoderma virens)RR-dl-6-8菌种于2018年6月27日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2018406,分类命名为Trichoderma virens，株号为RR-dl-6-8。

将粗提物经100-200目的硅胶柱层析，依次用体积比50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1到0:1的石油醚-乙酸乙酯和20:1、10:1、5:1、2:1到0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，收集的各组分再用薄层层析(TLC)检测(体积比50-1:1的二氯甲烷-甲醇展开，茴香醛-硫酸显色)，根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得8个组分(1-8)。

将Rf值为0.6-0.7(体积比20:1的二氯甲烷-甲醇展开，茴香醛-硫酸显色)的组分5，即以体积比1:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱下的组分再依次经反相C₁₈硅胶柱、SephadexLH-20凝胶柱和制备薄层层析分离。反相C₁₈硅胶柱层析洗脱液为体积比3:2的水-甲醇，TLC检测(体积比20:1的二氯甲烷-甲醇展开，茴香醛-硫酸显色)，收集茴香醛-硫酸显灰色的组分；收集组分经Sephadex LH-20凝胶柱层析时洗脱液为甲醇，TLC检测(体积比20:1的二氯甲烷-甲醇展开，茴香醛-硫酸显色)，收集茴香醛-硫酸显灰色的组分；收集组分再经制备薄层层析，用体积比20:1的二氯甲烷-甲醇为展开剂，收集Rf值为0.6－0.7的组分即为式(I)所示化合物(72.3毫克)。经薄层层析检测(体积比20:1二氯甲烷-甲醇展开，茴香醛-硫酸显色)，呈单个、显灰色斑点，确定为纯化合物。经波谱分析，其结构鉴定为一种含氯倍半萜衍生物，结构式如(I)所示。

实施例3

与实施例2不同之处在于

取平板上生长良好的绿木霉(Trichoderma virens)RR-dl-6-8菌种，切成小块并接种于菊芋葡萄糖液体培养基中，每1升三角瓶中放300毫升培养基，共200瓶，室温静止发酵30天，而后用二氯甲烷提取三次，减压浓缩，浓缩后得粗提物100克。

所述菊芋葡萄糖液体培养基组成为每升含200克菊芋块茎的煮汁500毫升，葡萄糖20克，蛋白胨5克，陈海水500毫升。

将粗提物经200-300目的硅胶柱层析，依次用体积比50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1到0:1的石油醚-乙醇进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析检测(体积比50-0:1的石油醚-乙醇展开，茴香醛-硫酸显色)，根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得8个组分(1-8)。

将Rf值为0.6-0.7(体积比12:1的石油醚-乙醇展开，茴香醛-硫酸显色)的组分3，即以体积比15:1的石油醚-乙醇梯度洗脱下的组分再依次经反相C₁₈硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱和制备薄层层析分离。反相C₁₈硅胶柱层析洗脱液为体积比2:1的水-乙醇，TLC检测(体积比12:1的石油醚-乙醇展开，茴香醛-硫酸显色)，收集茴香醛-硫酸显灰色的组分；收集组分经Sephadex LH-20凝胶柱层析时洗脱液为乙醇，TLC检测(体积比12:1的石油醚-乙醇展开，茴香醛-硫酸显色)，收集茴香醛-硫酸显灰色的组分；收集组分经制备薄层层析，体积比12:1的石油醚-乙醇为展开剂，收集Rf值为0.6-0.7的组分，得式(I)所示含氯倍半萜衍生物。

实施例4

抑微藻活性实验：

具体为:活化供试微藻，取对数生长期的微藻，用已灭菌的f/2培养基，稀释至一定的藻细胞浓度(约5×10⁴个/毫升)，取96孔板，每孔加195微升藻液为测试培养板。样品组和对照组各设三个平行，样品组加5微升浓度为4毫克/毫升的化合物溶液，溶剂为二甲基亚砜(DMSO)，空白对照组加5微升溶剂，阳性对照组加5微升浓度为4毫克/毫升的K₂Cr₂O₇溶液。培养温度20℃，光照强度2000Lux，光暗比14:10(小时)条件下，培养24小时。其中供试微藻为赤潮异弯藻、强壮前沟藻和东海原甲藻。

利用血球计数板，在显微镜下对各实验组中微藻进行计数。对抑制率大于50％的实验组，进一步计算其半数抑制浓度IC₅₀值。将配置好的终浓度为4毫克/毫升的化合物溶液依次进行稀释，最终得到15组浓度依次降低的组分(1000、500、200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125微克/毫升)。观察并计算各浓度梯度下化合物的微藻抑制率，取抑制率在0-100之间至少5个浓度梯度，计算IC₅₀值。

实验结果：上述获得的含氯倍半萜衍生物对赤潮异弯藻、强壮前沟藻和东海原甲藻的半数抑制浓度分别为0.87微克/毫升、1.5微克/毫升和0.83微克/毫升，具有抑制赤潮异弯藻、强壮前沟藻和东海原甲藻的作用。