一种抗凝血桃花有效成分及其应用
阅读说明：本技术 一种抗凝血桃花有效成分及其应用 (Anticoagulant peach blossom effective component and application thereof ) 是由 张娟娟 康文艺 尹震花 张伟 陈林 于 2021-01-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗凝血桃花有效成分,其经下述步骤提取获得：桃花用石油醚浸提脱脂,过滤,回收滤渣,然后用乙醇室温浸提,过滤、浓缩,得乙醇总浸膏；将乙醇总浸膏分散于少量水中形成分散液,依次用溶剂石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,回收溶剂,得到石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位；正丁醇部位用硅胶拌样后,经硅胶柱色谱,用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱,得到8个组分；将组分5用硅胶拌样后装柱,以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇进行洗脱,经薄层色谱检测,合并相同组分并减压回收溶剂。本发明采用特殊方法从桃花的正丁醇部位中分离得到1个具有抗凝血活性的化合物,实验结果证实可用于抗凝血试剂。(The invention discloses an anticoagulant peach blossom effective component, which is obtained by extracting the following steps: extracting flos persicae with petroleum ether for defatting, filtering, recovering residue, extracting with ethanol at room temperature, filtering, and concentrating to obtain ethanol total extract; dispersing the ethanol total extract in a small amount of water to form a dispersion, sequentially extracting with solvents of petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol, and recovering the solvents to obtain petroleum ether fraction, ethyl acetate fraction and n-butanol fraction; mixing n-butanol fraction with silica gel, subjecting to silica gel column chromatography, and gradient eluting with dichloromethane-methanol to obtain 8 components; mixing component 5 with silica gel, loading onto column, eluting with dichloromethane-ethyl acetate-methanol, detecting by thin layer chromatography, mixing the same components, and recovering solvent under reduced pressure. The invention adopts a special method to separate 1 compound with anticoagulant activity from the n-butanol part of the peach blossom, and experimental results prove that the compound can be used as an anticoagulant reagent.)
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种抗凝血桃花有效成分及其提取应用。
背景技术
桃花为蔷薇科（Rosaceae）桃属（Amygdalus）植物桃（Amygdalus persica L.）或山桃（Amygdalus davidiana）的花，味苦，性平，归心、肝、大肠经，有利水通便、活血化瘀之功效。目前，对桃花的化学研究多侧重于多酚的提取纯化工艺和脂溶性成分分析，研究结果表明，桃花（Amygdalus persica）挥发油中鉴定出苯甲醛、α-金合欢烯、十六烷酸等88种挥发性成分，且发现桃花挥发油对伤寒沙门氏菌等8种致病菌具有较强的抑制作用。然而，桃（Amygdalus persica L）花的化学成分和药理作用仍然不确定，没有明确的理论证据。
血栓形成涉及血管系统局部血液凝结，经常导致严重的健康相关疾病，如心脏病发作和中风等。血栓形成的危险因素有异常的高脂血症，高血糖，血浆纤维蛋白原升高，高血压和癌症，这些血栓性疾病已成为死亡的主要原因，并且其发病率每年都在增加。近几十年来，用肝素，华法林等药物达到了防治血栓的目的，但肝素易引起自发性出血，表现为各种粘膜出血，关节出血，伤口出血等。另外， 肝素诱导的血小板减少症是药物引起的血小板减少症，是肝素治疗的严重并发症。 因此，这些缺点已经迫使研究者发现与肝素相比副作用较小的新型抗血栓和抗凝剂。
凝血的实质是呈水溶性的纤维蛋白原转变为水中不溶解的固态纤维蛋白的过程，是在内源性或（和）外源性凝血途径下产生凝血酶原激活物，在凝血因子的作用下产生凝血酶，最后在凝血酶的作用下使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。PT主要反映的是外源性凝血途径中凝血因子I、II、V、VII、X的活性；APTT主要反映内源性凝血系统状况，与VIII、X、XI、XII等内源性凝血因子活性有关；TT值是主要反映纤维蛋白原转变为纤维蛋白程度的重要指标；FIB主要反映纤维蛋白原的含量。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明目的在于提供一种抗凝血桃花有效成分，并提供该抗凝血桃花有效成分的提取分离方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种抗凝血桃花有效成分，其经下述步骤提取获得：
1）以干燥、粉粹后的桃花为原料，用石油醚浸提脱脂，石油醚浸提结束后过滤，回收滤渣，然后用乙醇室温浸提，乙醇浸提结束后，过滤、浓缩，得乙醇总浸膏；将乙醇总浸膏分散于少量水中形成分散液，依次用溶剂石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶剂，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位；
2）将步骤1）所得正丁醇部位用硅胶拌样后，经200~300目硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，以硅胶薄层色谱检测合并，得8个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1~8；
3）将组分5用硅胶拌样后，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇进行洗脱，经硅胶薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得Fr.5.1；
4）将步骤3）所得Fr.5.1用硅胶拌样后装柱，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇进行洗脱，经硅胶薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得Fr.5.1.1；
5）将步骤4）所得Fr.5.1.1用硅胶拌样后装柱，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇洗脱，经薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得Fr.5.1.1.1；将Fr.5.1.1.1用甲醇溶解，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，甲醇洗脱，薄层色谱检测、合并相同组分并减压回收溶剂，干燥，得到化合物1；
化合物1即为抗凝血桃花有效成分。相当于，本发明公开了一种抗凝血桃花有效成分的提取分离方法。
优选的，步骤1）中，干燥、粉粹后的桃花在室温下用桃花重量10-15倍的石油醚浸提2~4次，每次3~4 d；然后用体积浓度70~80%的乙醇（乙醇添加量为桃花重量的10-15倍）在室温下浸提滤渣，浸提2~4次，每次3~4 d，乙醇浸提结束后合并乙醇浸提液，过滤、浓缩，得乙醇总浸膏。
优选的，步骤2）中，正丁醇部位拌样后按重量比1:29~1:31用200~300目硅胶装柱；用体积比100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32、0:100的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱。
优选的，步骤3）中，组分5拌样后按重量比1:29~1:31用200~300目硅胶装柱，用体积比15:1:1的二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇进行洗脱；步骤4）中，以体积比20:1的二氯甲烷-甲醇进行洗脱；步骤5）中，以体积比10:1的二氯甲烷-甲醇洗脱。
本发明上述所述的抗凝血桃花有效成分，化合物1为绿原酸正丁酯，分子式：C20H26O9，分子量：410，其结构如下：
。
本发明还提供了上述抗凝血桃花有效成分在制备抗凝血药物方面的应用。本发明采用特殊的方法从桃花的正丁醇部位中分离得到1个具有抗凝血活性的化合物（绿原酸正丁酯），可用于抗凝血剂。
和现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明以常被作为观赏、花落后作为废弃物丢弃、未得到广泛应用的桃（Amygdalus persica L.）花为原料，进行抗凝血有效成分的提取，大大拓展了桃花这一药用植物的开发利用价值。本发明提取方法简单，原料来源丰富，成本低，所提取得到的化合物经试验证明具有抗凝血作用，可用于抗凝血试剂；提取过程中用到的溶剂可回收利用，提取量大，可工业化生产。
附图说明
图1为实施例1提取获得化合物绿原酸正丁酯的1H-NMR谱图；
图2为实施例1提取获得化合物绿原酸正丁酯的13C-NMR谱图。
具体实施方式
为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施例旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
下述实施例中，作为原料的桃花购买于安徽药知源中药饮片有限公司，为蔷薇科桃属植物桃（Amygdalus persica L.）的花；所述乙醇、甲醇、二氯甲烷等有机溶剂浓度均为体积浓度或者体积比。
实施例1
一种抗凝血桃花有效成分，其经过以下步骤提取获得：
1）以干燥、粉粹后的2000 g桃花为原料，室温下，用桃花原料重量12倍量的石油醚室温浸提 (浸提3次，每次3d)，石油醚浸提结束后过滤，回收滤渣。然后用原料重量13倍量的70%乙醇室温浸提 (浸提3次，每次3d)，乙醇浸提结束后合并乙醇浸提液，过滤、浓缩，得510 g乙醇总浸膏；
将乙醇总浸膏分散于50 mL水中形成分散液，依次用石油醚 (约分散液的1倍体积)、乙酸乙酯 (约分散液的1倍体积) 和正丁醇 (约分散液的1倍体积) 萃取，各萃取3次，回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位；
2）将步骤1）所得正丁醇部位用体积比1:1二氯甲烷-甲醇溶解后，用80~100目硅胶拌样，然后按重量比1:30经200~300目硅胶柱色谱，以体积比100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32、0:100的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，以硅胶薄层色谱检测合并，得到8个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1~8；
3）将步骤2）所得组分5用体积比1:1二氯甲烷-甲醇溶解后，用80~100目硅胶拌样，然后按重量比1:30经200~300目硅胶柱色谱分离，以体积比15:1:1的二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇进行洗脱，经硅胶薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得Fr.5.1；
4）步骤3）所得Fr.5.1用硅胶拌样后装柱，经硅胶柱色谱分离，以体积比20:1的二氯甲烷-甲醇进行洗脱，经硅胶薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得Fr.5.1.1；
5）将步骤4）所得Fr.5.1.1用硅胶拌样后装柱，经硅胶柱色谱分离，以体积比10:1的二氯甲烷-甲醇进行洗脱，经薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得Fr.5.1.1.1；将Fr.5.1.1.1用甲醇溶解，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，甲醇洗脱，薄层色谱检测、合并相同组分并减压浓缩回收溶剂、干燥，得到白色粉末状的化合物1（43mg）；
经鉴定，化合物1为绿原酸正丁酯，运用多种谱学技术鉴定结构，具体如下：
仪器材料：紫外经UV-210A紫外光谱测定仪测定；1H-NMR、13C-NMR图谱由Brukeram-400 MHz核磁共振仪测定，TMS为内标，质谱由VG.AUTO Spec-3000型质谱仪测定。
实验结果：化合物1，白色粉末(甲醇)，分子式为C20H26O9，ESI-MS m/z: 409 [M-H]-。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d 6) δ: 9.57(1H, s, -OH), 9.16(1H, s, -OH), 7.37(1H,d, J=15.9Hz, H-3′), 7.01(1H, d, J=1.9Hz, H-5′), 6.98(1H, dd, J=8.2Hz, 1.9Hz,H-9′), 6.78(1H, d, J=8.2Hz, H-8′), 6.12(1H, d, J=15.9Hz, H-2′), 5.03(1H, m,H-5), 3.97(2H, t, J=6.6, H-8), 3.92(1H, m, H-3), 3.58(1H, dd, J=5.7Hz, 3.0Hz,H-4), 2.11(2H, m, C2-αH, C6-αH), 1.95(1H, dd, J=13.6Hz, 3.5Hz, C6-βH), 1.76(1H, dd, J=12.6Hz, 9.4Hz, C2-βH), 1.49(2H, m, H-9), 1.25(2H, m, H-10), 0.82(3H, t, J=7.3Hz, H-11)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ: 73.13(C-1), 37.17(C-2),66.97(C-3), 69.45(C-4), 70.98(C-5), 35.17(C-6), 173.09(C-7), 64.01(C-8),29.96(C-9), 18.44(C-10), 13.44(C-11), 165.34(C-1′), 113.86(C-2′), 148.41(C-3′), 125.36(C-4′), 114.55(C-5′), 145.58(C-6′), 145.02(C-7′), 115.79(C-8′),121.19(C-9′) ，详见谱图1和2。
抗凝血应用试验
下面对抗凝血桃花有效成分（即化合物1绿原酸正丁酯）进行抗凝血作用试验。
仪器和试剂：
TGL-16gR高速台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；
RAC-030全自动凝血分析仪（济南汉方医疗器械有限公司）；
氯化钠注射液（辰欣药业股份有限公司，1603311336）；
云南白药（云南白药集团股份有限公司，ZJA1708）；
注射用灯盏花素（昆明龙津药业股份有限公司，20190813-1）；
凝血酶原时间（PT）测定试剂盒（20191209M）；活化部分凝血酶时间（APTT）测定试剂盒（20200319M）；凝血酶时间（TT）测定试剂盒（20190821M）；纤维蛋白原（FIB）含量测定试剂盒（20191120M）均由深圳雷杜生命科学股份有限公司生产。
实验动物：SD大鼠，SPF级，雄性，体重180~200 g，由河南省实验动物中心提供（SCXK（豫）2017-0001）。
样品溶液配制：
取化合物1样品3 mg用1000 μL溶剂溶解配制成浓度3 mg/mL的溶液；
取灯盏花素8 mg用600 μL溶剂配制成浓度13.33 mg/mL的溶液；
取云南白药1 mg用25 μL溶剂配制成浓度40 mg/mL的溶液；
溶剂（也作为空白溶剂）为：无水乙醇: 1,2-丙二醇: 氯化钠注射液=1: 1: 3（体积比）。
血浆的制备：大鼠，采用水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，置于一次性抗凝负压真空管，轻轻颠倒混匀，3000 rpm离心15 min，取上层清液备用。
具体试验方法：
（1）对APTT影响的检测方法
分别在不同测试杯中加入25 μL各个样品溶液，再加入50 μL血浆，放入凝血仪器中，自动加入25 μL APTT试剂，37℃孵育后加入37℃预温的50 μL CaCl2溶液，记录凝固时间，即为APTT值。
（2）对PT影响的检测方法
分别在不同测试杯中加入25 μL各个样品溶液，再加入50 μL血浆，放入凝血仪器中，自动加入100 μL PT试剂，记录凝固时间，即为PT值。
（3）对TT影响的检测方法
分别在不同测试杯中加入25 μL各个样品溶液，再加入100 μL血浆，放入凝血仪器中，自动加入100 μL TT试剂，记录凝固时间，即为TT值。
（4）对FIB影响的检测方法
分别在不同测试杯中加入25 μL各个样品溶液，再加入50 μL血浆，放入凝血仪器中，自动加入100 μL FIB试剂，记录纤维蛋白原的含量。
试验结果：
结果采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法(One-Way ANOVA)比较其显著性差异，测定结果见表1。
表1 化合物对大鼠凝血时间及纤维蛋白原含量的影响(x±s)
注：数据代表平均值±SD，N=4
与空白比较： ### p<0.001< ## p<0.01< # p<0.05；
与云南白药比较：△△△ p<0.001< △△ p <0.01< △ p <0.05；
与灯盏花素比较： *** p<0.001< ** p<0.01< * p<0.05。
由表1可以看出，与空白组相比，本发明所述抗凝血桃花有效成分化合物1可以显著的延长APTT (p<0.01)，其效果弱于灯盏花素 (p<0.001)；可以延长PT (p<0.05)，其效果弱于灯盏花素 (p<0.01)；可以显著的降低FIB含量 (p<0.001)，作用弱于灯盏花素 (p<0.05)。可见，本发明所述抗凝血桃花有效成分化合物1能延长APTT、PT时间，降低FIB的含量，提示化合物1具有一定的抗凝血作用，可用作抗凝血试剂。