阅读说明：本技术 一种丝胶蛋白微球的制备方法 (Preparation method of sericin microspheres ) 是由 蔡玉荣 赵陈煜 王振宇 谢文姣 于 2020-05-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种丝胶蛋白微球的制备方法。本发明以易溶性丝胶蛋白为原料,将其溶解在水中后,依次经过溶剂置换、化学交联和溶剂热处理,并通过离心洗涤和真空干燥,最终得到稳定的丝胶蛋白微球。该方法简单、高效,特别适用于从丝胶水溶液制备得到丝胶纳米微球。本发明利用丝胶蛋白制备出粒径可控且分散性、稳定性好的丝胶蛋白微球,一方面可减轻丝胶废水对自然环境造成的伤害,另一方面充分利用了丝胶废水的剩余价值,拓展了丝胶蛋白在不同领域的应用,对保护环境和增加经济效益具有重要的现实意义。(The invention discloses a preparation method of sericin microspheres. The invention takes soluble sericin as a raw material, and the stable sericin microspheres are obtained by dissolving the soluble sericin in water, sequentially carrying out solvent replacement, chemical crosslinking and solvent heat treatment, and carrying out centrifugal washing and vacuum drying. The method is simple and efficient, and is particularly suitable for preparing the sericin nano-microspheres from the sericin aqueous solution. The sericin microspheres with controllable particle size, good dispersibility and good stability are prepared by sericin, so that the damage of sericin wastewater to the natural environment can be reduced, the residual value of sericin wastewater is fully utilized, the application of sericin in different fields is expanded, and the sericin microspheres have important practical significance for protecting the environment and increasing the economic benefit.)

一种丝胶蛋白微球的制备方法

技术领域

本发明涉及一种制备丝胶蛋白微球的制备方法，属于蛋白质纳米微球技术领域。

背景技术

我国是世界上最主要的蚕丝生产国，无论是规模上还是产量上均居世界前列。天然蚕丝由丝胶和丝素两种蛋白质组成，丝胶蛋白占蚕丝比重为25％～30％。根据不同温度和压力下丝胶蛋白在水中的溶解性，又可将丝胶蛋白分为外层(50wt％)，中间层(35wt％)和内层(15wt％)丝胶蛋白。相比于丝素蛋白，丝胶蛋白的机械性能较差，降解更快，因而在以往很长一段时期未能得到与之同等的关注。我国每年脱胶而产生的丝胶总量约为3.5万吨，含有大量丝胶的废水直接排放，既造成了对环境的污染，同时大量宝贵的丝胶蛋白资源也被浪费。

丝胶蛋白是一种球状蛋白,含有多种多肽,其由18种氨基酸组成,含有较多的丝氨酸、天门冬氨酸和甘氨酸。丝胶蛋白主的二级结构主要呈无规卷曲，仅有极少量的α螺旋或β转角。由于丝胶蛋白含有丰富的极性氨基酸，其具有良好的水溶性。

由于丝胶良好的水溶性与优越的生物相容性，目前丝胶蛋白主要以水溶液的形式，作为功能性添加剂被应用于织物整理、化妆护肤品、食品与生物医药领域，只有少部分研究将丝胶作为固相直接利用。这是因为蚕茧在脱胶的过程中，为了提高脱胶率，往往需要借助碱处理或酶解等方法使大分子量的丝胶蛋白降解。虽然这使得丝胶蛋白在水中的溶解性大大提升，但是也增加了丝胶作为固相回收利用的难度。

在丝胶蛋白的再加工领域，中国专利(ZL 201210574086.X)“一种柞蚕丝胶蛋白粉的制造方法”以难溶性丝胶蛋白为原料，利用中性蛋白酶和胰蛋白酶将其水解后又通过超滤分离、H₂O₂脱色、蒸发浓缩和喷雾干燥制备了易溶性丝胶蛋白粉末，但并未对其进行形貌等表征；中国专利(ZL 201410019276.4)一种丝胶蛋白球形微胶囊制备的方法以易溶性丝胶为原料，通过金属离子螯合的方法，在水溶剂中制备出稳定的丝胶蛋白球型微胶囊，并对其形貌和生物相容性进行了表征；欧洲专利(EP 3112396A1)“Preparation method anduse of sericin hydrogel”使用LiCl或LiBr的水溶液溶解丝胶粉末，而后将溶液经过透析达到一定的浓度后进行化学交联，制备了丝胶水凝胶，体外细胞实验与动物实验均证明了所制备的丝胶水凝胶具有较好的稳定性与生物相容性；韩国专利(KR 101534290B1)“Silksericin film with good mechanical properties and its preparation method”在酸性条件下溶解丝胶蛋白，并在室温下干燥得到了具有较好力学性能的丝胶蛋白膜。

我国作为当今最主要的蚕丝生产国，每年都会产生大量丝胶废水，因此提高对于丝胶的回收利用率，制备多样化和高附加值的丝胶产品，一方面可以减轻丝胶废水对自然环境造成的压力，另一方面将丝胶作为自然资源极大地开发利用，对保护环境和增加经济效益具有深远的意义。

发明内容

为了克服上述背景技术中提出的问题，本发明的目的是提供一种丝胶蛋白微球的制备方法。

1)将丝胶蛋白溶解于去离子水中，在磁力搅拌下充分溶解后放入离心机中，设定转速为8000rpm离心10min，取上清液得到4wt％的丝胶水溶液；

2)将0.48～1.92gF127溶解于30mL无水乙醇中，控制水浴温度为40℃，在磁力搅拌下全部溶解；

3)取3mL步骤1)中得到的丝胶蛋白水溶液，控制水浴温度为40℃，设定机械搅拌速率为500～1500rpm，逐滴加入步骤2)中得到的F127/无水乙醇溶液中；

4)在步骤3)中得到的丝胶蛋白悬浮液中，加入0.3mL5wt％戊二醛/乙醇溶液,控制水浴温度为40℃，交联15min；

5)将步骤4)中得到丝胶蛋白悬浮液，倒入50mL聚四氟乙烯内衬中，封装入反应釜外套后，迅速放置于160～180℃的烘箱中，反应2～8h；

6)将步骤5)中得到的丝胶蛋白悬浮液在15000rpm下离心分离20min，倒去上层液体后依次用去离子水和无水乙醇洗涤、离心各三次，将得到的固体于60℃的真空烘箱中干燥12h后取出，最终得到丝胶蛋白微球。

所述的丝胶蛋白分子量为16000～20000。

所述的稳定剂为三嵌段共聚物F127，丝胶蛋白与F127的质量比为1:4～1:16；用滴管将4wt％的丝胶水溶液逐滴加入F127/无水乙醇中，搅拌速度为500～1500rpm；溶剂热反应温度为160～180℃；溶剂热反应时间为2～8h；离心机转速为12000rpm，离心时间为20min。

与背景技术相比，本发明具有的有益效果是：

本发明利用了低分子量的易溶性丝胶蛋白，制备出可在水中稳定、均匀分散且粒径可控的丝胶蛋白微球，拓展了丝胶蛋白在不同领域的应用前景，充分开发了丝胶废液的剩余价值；同时，有利于减轻丝胶废水对自然环境造成的压力。

附图说明

图1是实施例1～3制备的丝胶蛋白微球的粒径分布图。其中，(a)、(b)、(c)分别对应实施例1～3中得到的产物。图2是丝胶蛋白原料与实例施1～3制备的丝胶蛋白微球的酰胺Ⅲ带傅里叶红外光谱图。其中，(a)、(b)、(c)、(d)分别对应丝胶原料与实施例1～3中得到的产物。图3是实施例3制备的丝胶蛋白微球的场发射扫描电镜照片。其中，(a)是丝胶蛋白微球放大5千倍照片，(b)是丝胶蛋白微球放大1万倍照片。图4是制备丝胶蛋白微球的流程示意图和实例3中得到的产物分散在水中的照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1:

1)将丝胶蛋白溶解于去离子水中，在磁力搅拌下充分溶解后放入离心机中，设定转速为8000rpm离心10min，取上清液得到4wt％的丝胶水溶液；

2)将0.48gF127溶解于30mL无水乙醇中，控制水浴温度为40℃，在磁力搅拌下全部溶解；

3)取3mL步骤1)中得到的丝胶蛋白水溶液，控制水浴温度为40℃，设定机械搅拌速率为500rpm，逐滴加入步骤2)中得到的F127/无水乙醇溶液中；

4)在步骤3)中得到的丝胶蛋白悬浮液中，加入0.3mL5wt％戊二醛/乙醇溶液,控制水浴温度为40℃，交联15min；

5)将步骤4)中得到丝胶蛋白悬浮液，倒入50mL聚四氟乙烯内衬中，封装入反应釜外套后，迅速放置于180℃的烘箱中，反应2h；

6)将步骤5)中得到的丝胶蛋白悬浮液在12000rpm下离心分离20min，倒去上层液体后依次用去离子水和无水乙醇洗涤、离心各三次，将得到的固体于60℃的真空烘箱中干燥12h后取出，最终得到丝胶蛋白微球。

实施例2:

1)将丝胶蛋白溶解于去离子水中，在磁力搅拌下充分溶解后放入离心机中，设定转速为8000rpm离心10min，取上清液得到4wt％的丝胶水溶液；

2)将1.92gF127溶解于30mL无水乙醇中，控制水浴温度为40℃，在磁力搅拌下全部溶解；

3)取3mL步骤1)中得到的丝胶蛋白水溶液，控制水浴温度为40℃，设定机械搅拌速率为1000rpm，逐滴加入步骤2)中得到的F127/无水乙醇溶液中；

4)在步骤3)中得到的丝胶蛋白悬浮液中，加入0.3mL5wt％戊二醛/乙醇溶液,控制水浴温度为40℃，交联15min；

5)将步骤4)中得到丝胶蛋白悬浮液，倒入50mL聚四氟乙烯内衬中，封装入反应釜外套后，迅速放置于160℃的烘箱中，反应4h；

6)将步骤5)中得到的丝胶蛋白悬浮液在12000rpm下离心分离20min，倒去上层溶液后依次用去离子水和无水乙醇洗涤、离心各三次，将得到的固体于60℃的真空烘箱中干燥12h后取出，最终得到丝胶蛋白微球。

实施例3:

1)将丝胶蛋白溶解于去离子水中，在磁力搅拌下充分溶解后放入离心机中，设定转速为8000rpm离心10min，取上清液得到4wt％的丝胶水溶液；

2)将0.96gF127溶解于30mL无水乙醇中，控制水浴温度为40℃，在磁力搅拌下全部溶解；

3)取3mL步骤1)中得到的丝胶蛋白水溶液，控制水浴温度为40℃，设定机械搅拌速率为1500rpm，逐滴加入步骤2)中得到的F127/无水乙醇溶液中；

4)在步骤3)中得到的丝胶蛋白悬浮液中，加入0.3mL5wt％戊二醛/乙醇溶液,控制水浴温度为40℃，交联15min；

5)将步骤4)中得到丝胶蛋白悬浮液，倒入50mL聚四氟乙烯内衬中，封装入反应釜外套后，迅速放置于170℃的烘箱中，反应8h；

6)将步骤5)中得到的丝胶蛋白悬浮液在12000rpm下离心分离20min，倒去上层溶液后依次用去离子水和无水乙醇洗涤、离心各三次，将得到的固体于60℃的真空烘箱中干燥12h后取出，最终得到丝胶蛋白微球。

测定实施例1～3制得的三种丝胶蛋白微球的平均粒径、多分散指数和粒径分布。表1与图1为由实施例1～3制备的丝胶蛋白微球(a)、(b)、(c)的尺寸表征结果。由表1中数据可知，采用本发明所述的制备方法获得的丝胶蛋白微球(a)、(b)、(c)平均粒径分别为660、379和319nm；多分散指数分别为0.176、0.143和0.164，说明丝胶蛋白微球的粒径较为均一。如图1，可以得出制备的丝胶蛋白微球的粒径分布较窄，均为亚微米尺寸范围。如图2，为本发明中所使用的丝胶蛋白原料与实施例1～3所制备的丝胶蛋白微球在酰胺Ⅲ带的傅里叶红外光谱图，通过对二级构象的分析可知，易溶性丝胶原料的二级构象以无归卷曲为主，仅有少量的α-螺旋与β-折叠，而实施例中得到的丝胶蛋白微球根据反应条件的不同，无归卷曲和α-螺旋构象含量降低，β-折叠结构含量上升，这是所制得的丝胶蛋白微球在水中具有良好稳定性的主要原因。如图3，从实施例3制备的丝胶蛋白微球的场发射扫描电镜照片可看出，其形貌接近于球形，由于丝胶蛋白微球具有较高的比表面积和表面丰富的极性官能团，在样品干燥过程中丝胶蛋白微球出现了轻微的相互吸引和团聚现象。如图4，从实施例3制备的丝胶蛋白微球分散在水中的照片可看出，其在水中可均匀地分散从而形成稳定的悬浊液，在水中既不溶解，也没有明显的团聚现象。

表1

以上列举的仅是本发明的具体实施例。本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。